免疫细胞的分离和保存技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术
免疫学研究中的免疫细胞分离和纯化技术免疫学研究是现代生物医学领域的一个重要分支，它研究的是人类和动物身体对各种病原微生物、异物和肿瘤细胞的防御反应。
在免疫系统中，免疫细胞是起关键作用的细胞类型。
它们能够识别和灭杀感染体和变异细胞，调节和模拟免疫反应，从而维持机体的免疫平衡。
因此，为了更好地研究免疫学的各个方面，对免疫细胞进行有效的分离和纯化是非常重要的。
免疫细胞的分离和纯化技术主要有以下几种：一、梯度离心分离法梯度离心分离法是采用密度梯度离心分离免疫细胞的方法。
具体步骤是将单个样品分离成不同的浓度梯度，并将样品均匀地添加在内层管子上，然后进行离心分离。
通过分析分离后的离心上清液中各种细胞类型的分布情况，可得到高纯度的特定免疫细胞。
该方法具有简单、快速、操作简单等优点。
二、单克隆抗体柱纯化法单克隆抗体柱纯化法是使用和特定抗体相结合的高亲和性蛋白质固相柱进行免疫细胞分离和纯化的方法。
该方法是将单个样品进行混合，将混合物通过配对的特定抗体柱，将目标细胞捕获和结合。
然后用缓冲液除去不结合的细胞，然后逐步提高pH、浓度等条件进行脱附和纯化。
该方法可以获得高纯度特定细胞的纯度，但需要对抗体进行结合实验，需要一些特殊的仪器和设备。
三、磁珠分离法磁珠分离法是将磁性珠子通过表面结合蛋白并与目标细胞结合的方法实现免疫细胞的分离和纯化的方法。
目前，该方法是免疫学研究分离和纯化细胞的主要方法之一。
该方法具有结合力强、纯度高、高通量、实时观察和可重复等特点。
然而，现有产品价格较高，因此利用磁珠结合留存的免疫抗体分子，促进自主磁珠制备已成为热门技术研究领域。
四、流式细胞术流式细胞术是一种使用单胞悬液通过免疫表型分析和单细胞相关性分析的方法。
该技术是通过将免疫细胞进行标记，然后将其通过流式细胞术仪器进行检测和分析，以实现细胞分离和分析的方法。
流式细胞术是高分析刻度，可以分析更多的样品、更少的细胞、更少的步骤，同时也能够研究细胞的表面和内部组成，测定分析数据的精确性高，检测的速度快等多种优点。
临床免疫学检验-第十三章细胞免疫学技术
Ficoll分离法
聚蔗糖-泛影葡胺分层液的制备
6%聚蔗糖溶液 (Ficoll溶液)密度1.020
34%泛影葡胺溶液 (Hypaque溶液)密度1.2
酸性磷酸酶测定 非特异性酶的测定
巨噬细胞功能检测
炭粒廓清试验
正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90% 炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据 此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)， 间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒 的浓度，根据血流中炭粒被廓清的速度，判 断巨噬细胞的功能。
吞噬功能检测
鸡RBC
l液 密度1.135
细胞混悬液
高速离心 密
度
6小时
梯 度
低速离心 密 度 梯 度
死细胞残片和血小板 富含单核细胞的组分
富含淋巴细胞的组分 红细胞与粒细胞组分
淋巴细胞亚群的分离
T细胞和B细胞的分离
E花环分离法 尼龙棉分离法
E花环分离法
E受体
T
SRBC
B
E花环 T
离心
B
E花环
聚蔗糖-泛影
形成溶血空斑
可以检测致敏红细胞的各种抗原所对应的抗体,临 床应用比较广泛
反向空斑形成试验
反应物: 琼脂凝胶
SPA致敏的SRBC B细胞 补体 抗Ig抗体
形成溶血空斑
体外检测人类Ig分泌细胞的方法,与抗体的特异性 无关
酶联免疫斑点法
反应物:
包被在固相载体上的抗原 B细胞 酶标二抗
加底物显色
计数斑点形成细胞
免疫细胞的分离和保存技术
免疫细胞的分离和保存技术用体外方法对机体各种具有免疫反应的细胞分别作鉴定、计数和功能测定，是观察机体免疫状态的一种重要手段。
为此，须将各种参与免疫反应的细胞从血液或脏器中分离出来。
参与免疫反应的细胞主要包括淋巴细胞、巨噬细胞、中性粒细胞等。
由于检测的目的和方法有同，分离细胞的需求和技术也异。
有的仅需分离白细胞，有的则需分离单个核细胞（mononuclearcell），其中含淋巴细胞和单核细胞（monocyte），有的则需分离T细胞和B细胞以及其亚群。
分离细胞选用的方法应力求简便可行，并能获得高纯度、高获得率、高活力的细胞。
现用分离细胞群的原则，一是根据各类细胞的大小、沉降率、粘附和吞噬能力加以组分，另一则按照各类细胞的表面标志，包括细胞表面的抗原和受体加以选择性分离。
一、白细胞的分离（一）血液中红细胞与白细胞比例约600～1000:1，两者的比重不同其沉降速度亦异，通常用两种方法加以分离。
本法是利用血细胞自然沉降率的分离法，采集血液后应及时抗凝，通常选用肝素抗凝法。
肝素能阻止凝血酶原转化为凝血酶，从而抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白而防止血液凝固。
操作原则是将含抗凝血的试管直立静置室温30～60min 后，血液分成明显三层，上层为淡黄色血浆，底层为红细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为白细胞，轻轻吸取即得富含白细胞的细胞群，离心洗涤后加入少量蒸馏水或含氯化铵的Gey溶液，经短时间的低渗处理，使红细胞裂解，经过反复洗涤可得纯度较高的白细胞悬液。
（二）聚合物加速沉淀法本法是利用高分子量的聚合物如明胶、右旋糖酐、聚乙烯吡喀烷酮（polyvinylpyrolidone，PVP）等使红细胞凝集成串，加速红细胞沉降，使之与白细胞分离。
本法的细胞获得率比自然沉降法高。
二、外周血单个核细胞的分离外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090，血小板为1.030～1.035。
免疫细胞分离技术
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人外周血淋巴细胞(亚群)的分纯(purificcation) 人外周血单个核细胞（PBMC）主含淋巴细胞, 但混有 单核细胞、粒细胞、红细胞和血小板等。淋巴细胞的分纯： （一）红细胞的去除（0.83%氯化铵、蒸馏水） （二）血小板的去除（离心、洗涤） （三）单核、粒细胞的去除（黏附去除，羰基铁粉吞噬） （四）淋巴细胞亚群的分离★
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正选（positive selection）法： 磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞
负选（negtive selection）法： 磁珠结合不需要的细胞，游离于上清液的细胞为所需细胞
一般而言，负选法比正选法的磁珠用量大
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评价(evalution)：
Lymphocytes + sRBC , centrifugation----T lympho-cytes(底) / B lympho-cytes（界面）
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2、黏着性（理化）： B淋巴细胞易黏附聚酰胺纤维（尼龙纤维）表面，而T淋巴细胞则不易附 着～
（例）尼龙棉柱分离 — 直接流出的是T淋巴细胞。 3、免疫学：用特异性抗体并使其固相化，捕获具特定膜抗原的细胞～ （例）1、亲和板结合分离
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Precipitation of E rosette
Erythrocyte Rosette forming cell; ERFC The sueface of T lymphocyte contains the receptor (CD2) of sheep erythrocyte ,which is called E receptor for short . T lympho-cytes can form E rosette with sheep erythro-cytes by its E receptor.
免疫细胞存储的操作流程
免疫细胞存储的操作流程引言：免疫细胞存储是一种重要的生物医学技术，它可以帮助人们保存和利用免疫细胞以进行免疫治疗。
本文将介绍免疫细胞存储的操作流程，包括细胞采集、处理、贮存和使用等环节。
一、细胞采集1. 选择合适的采集源：免疫细胞可以从多个来源采集，包括外周血、骨髓、脐血等。
根据具体需求，选择合适的采集源很关键。
2. 采集方法：根据采集源的不同，采用相应的采集方法。
例如，外周血可以通过静脉抽血，骨髓可以通过穿刺抽取，脐血可以通过脐带剪断后采集。
3. 采集样本处理：采集的细胞样本需要尽快处理，以避免细胞失活或受污染。
通常，采集后的样本会被送往实验室进行下一步处理。
二、细胞处理1. 细胞分离：采集到的样本中可能存在其他细胞或物质，需要进行细胞分离。
可以通过离心、流式细胞术等方法将目标细胞分离出来。
2. 细胞富集：为了提高目标细胞的纯度和浓度，可以采用细胞富集技术，如磁珠富集、流式细胞术等。
3. 细胞检测：对处理后的细胞进行质量控制，确保细胞的存活率和纯度达到要求。
可以使用细胞计数仪、细胞培养等方法进行检测。
三、细胞贮存1. 冷冻保存：为了延长细胞的存活时间，通常会选择冷冻保存。
将处理后的细胞用特定的冷冻液冷冻保存，以确保细胞在低温下保持稳定。
2. 冷冻管标识：为了方便细胞的识别和管理，冷冻管需要进行标识。
可以使用标签或条码等方式标记细胞的相关信息，如样本编号、采集日期等。
3. 贮存条件：细胞贮存需要在恒定的温度和湿度条件下进行，通常选择液氮罐或液氮制冷器进行贮存。
同时，注意避免细胞受到震动或其他不良环境因素的影响。
四、细胞使用1. 细胞解冻：在使用前，需要将冷冻的细胞解冻。
解冻的过程需要控制温度和时间，以避免细胞受损。
2. 细胞培养：解冻后的细胞需要进行培养，以促进其生长和增殖。
通常使用适当的培养基和条件进行培养。
3. 细胞应用：培养后的细胞可以用于免疫治疗、疫苗制备等领域。
根据具体需求，细胞可以进行进一步的处理和应用。
免疫细胞的分离和检测
第一节 中性粒细胞功能的检测 Assays for Polymorphonuclear Function
一、细胞运动功能的检测
（一）体内实验法 （二）体外试验法 二、吞噬和杀菌功能的检测 （一）细胞内杀菌功能的检测
吞噬率 =
吞噬细菌的白细胞数
计数的白细胞数
吞噬细菌总数 计数的白细胞数
X 100%
4. 吞噬细胞的功能检测
第一节 免疫细胞的分离与纯化 Separation and Purification of Immunocyte
• 实验的目的；
• 所需细胞的种类、纯度和数量； • 方法简便可行，尽量保持活性、 纯度和收获率。
一、白细胞的分离
（一）自然沉降法 （二）聚合物加速沉降法
某些高分子聚合物（如明胶、 右旋糖酐、甲基纤维素和聚乙烯吡 咯烷酮等）可使红细胞凝聚成串， 加速红细胞沉降，使之更易与白细 胞分离。
第三节
淋巴细胞功能检测技术
Assays for Lymphocyte
Function
一、T细胞功能检测
（一）T细胞增殖试验
T细胞在体外受有丝分裂原或抗原刺激后，
细胞代谢和形态发生变化，主要表现为胞内蛋白
质和核酸合成增加，发生一系列增殖反应。如细
胞变大、胞质增多、出现空泡、核质疏松、核仁
明显并转化为淋巴母细胞，又称淋巴细胞转化试
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
密度梯度分离单个核细胞 （Ficoll分层液）
Percoll (商品名） 经过聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrolidone,PVP)处理的硅胶颗粒大小 不一的混悬液。 高速离心后，形成连续密度梯度， 可将密度不同的细胞分离纯化。分离淋 巴细胞纯度达98% ，单个核细胞纯度达 78% 。流程长、烦琐、费用高。
15-免疫细胞的分离和保存技术
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、
巴
CD25等。
细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、CD22、 CD29等。
1、E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+ SRBC悬液→加入 分层液→T细胞形成E花环而沉于管→ 悬液中为B细胞。
2、尼龙毛分离法
方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤维管 →洗脱下来的是T细胞。
（二）斑螯敷法
•此法可从人体组织液中获取较纯的吞噬细胞。 •方法：
用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液 → 贴敷在臂内侧皮肤表面 → 4~5小时后皮肤局部充血 → 48小时后局部形成水泡 → 吸取水泡中的组织液，内 含大量巨噬细胞。 •但此法对病人皮肤有一定损伤，有时可引起局部感 染。
• 中性粒细胞的分离
→与磁珠结合的细胞运动将受限， 未与磁珠结合的细胞将先被洗脱
→再将该柱移出磁场
→与磁珠结合的细胞将被洗脱。
5、磁性激活细胞 分离器分离法
6、淘选法 (利用 表面标志分离淋 巴细胞亚群）
五、单核巨噬细胞的分离
（一）Percoll分离法 •此法从外周血中分离出单核-巨噬细 胞，但由于此类细胞在外周血中的含 量较低，分离时所需的血量较多。
人：静脉采血，抗凝剂抗凝。 动物：颈静脉采血法、尾部采血法、
眼眶采血法、心脏采血法等。
二、外周血中白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600:1~1000:1， ➢ 两者的比重不同，其沉降速度也不同，通常
用两种方法加以分离。 1、自然沉降法 2、聚合物加速沉淀法 ➢ 或采用0.83%氯化铵分离法使红细胞破裂后， 洗涤得到白细胞。
2、吸附柱过滤法 •将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下 来的主要是淋巴细胞。
pbmc分离结果
pbmc分离结果PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cells）分离结果是指将外周血中的白细胞分离出来的实验结果。
PBMC是指在外周血中存在的各种核细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和自然杀伤细胞等。
PBMC分离结果在生物医学研究中具有重要意义，可以用于免疫学研究、细胞治疗和药物开发等方面。
PBMC主要通过离心技术进行分离。
首先，采集新鲜外周血样本，并将其加入抗凝剂保存。
然后，将外周血样本轻轻倒入离心管中，并使用相应的稀释液进行稀释。
接下来，将离心管放入离心机中进行离心。
离心过程中，由于外周血成分的不同密度，PBMC会在特定离心力下沉降到离心管的底部，形成一层细胞沉积物。
最后，将上清液轻轻吸出，留下PBMC沉积物。
PBMC分离结果可以通过显微镜观察，也可以通过流式细胞术进一步鉴定和分析。
显微镜观察可以直接观察到PBMC的形态特征，如淋巴细胞的小圆形核和少量胞质。
而流式细胞术则可以利用特定的细胞表面标记物，对PBMC进行表型和功能分析。
PBMC分离结果在免疫学研究中具有广泛的应用。
通过分离PBMC，可以对免疫细胞的种类、数量和功能进行研究，了解免疫机制和疾病发生发展的规律。
例如，可以通过分离PBMC来检测某种疾病的免疫指标，如细胞因子水平、T细胞亚群的比例等。
此外，PBMC还可以用于体外培养细胞，进行免疫治疗研究。
通过激活PBMC并与其他靶细胞相互作用，可以评估抗肿瘤药物和免疫治疗的效果。
PBMC分离结果也在细胞治疗领域具有重要作用。
细胞治疗是利用人体的细胞、组织或细胞因子来治疗疾病的一种新型治疗方法。
PBMC 中的多能干细胞（如间充质干细胞）具有自我更新和多向分化能力，可以用于再生医学研究和治疗。
通过分离PBMC，可以提取出这些多能干细胞，并进行体外扩增和定向分化，最终用于临床治疗。
此外，PBMC分离结果在药物开发中也扮演着重要角色。
药物开发过程中，需要评估药物的毒性和免疫原性。
项目十六 免疫细胞的分离
项目十六免疫细胞的分离一、抗凝血的制备【实验原理】常用的抗凝剂如肝素能阻止凝血酶的形成；乙二胺四乙酸(EDTA)和柠檬酸能与Ca2+结合；机械脱纤维使血液中血小板和纤维蛋白凝聚；从而都能阻止血液凝固。
实验室常用的抗凝方法有如下几种：肝素抗凝、EDTA抗凝、脱纤维抗凝及Alsever液抗凝等方法。
【试剂和器材】1．试剂肝素、EDTA-Na2、Alsever液、生理盐水等。
2．器材三角烧瓶、玻璃珠、试管或离心管、采血器具。
【步骤和方法】1．肝素抗凝法将肝素用生理盐水配制成250U/ml或其它浓度的溶液，115℃灭菌10min(或112℃15min)，置-20℃可保存数月。
实验中常用的肝素抗凝浓度为20~50U/ml血液，实际当肝素浓度为5~10U/ml血液时已显出良好的抗凝效果。
2．EDTA法常用EDTA二钠盐(EDTA-Na2)，用生理盐水配制成浓度为27g/L的溶液。
配制时将溶液调至pH7.2，否则EDTA-Na2不溶解。
用时取0.05ml即可使1ml血液抗凝。
EDTA-Na2有效抗凝浓度为1~2mg/ml血液。
3．脱纤维法在三角烧瓶中放入一些小玻璃珠(放入数目视采血量多少而定，通常放30~40粒)，将血采入后立即轻轻顺一个方向旋转，直到血纤维凝聚为止。
4．Alsever液抗凝法血液与Aalsever液混合比例为1:1~1:2。
【结果判定】除玻璃珠脱纤维法有血纤维凝聚之外，抗凝血中不能有血凝块出现，否则应重新制备。
【注意事项】1．采血所用器具、抗凝剂、操作过程均应无菌。
2．加入血液后应轻轻混合，直到与抗凝剂均匀混合为止。
常采用旋转混合的方法混匀。
3．抗凝血放4℃保存。
【方法评价】肝素制备的抗凝血不易长期保存(保存时间12h)。
EDTA 法能保持血小板与白细胞的正常形态，避免聚集。
脱纤维法可使少量淋巴细胞丢失，但是悬液中细胞活力好，而且血小板污染甚少。
Alsever可较长时间保存血液，一般可保存2~3周。
免疫细胞提取方法-详细解释说明
免疫细胞提取方法-概述说明以及解释1.引言1.1 概述免疫细胞提取方法是一种技术手段，用于从生物样本中提取和分离免疫细胞。
免疫细胞是免疫系统中的重要组成部分，能够识别和消除入侵的病原体以及异常细胞，起到维护机体免疫平衡和保持正常生理功能的关键作用。
随着对免疫细胞的研究不断深入，越来越多的科研和临床应用需要对免疫细胞进行进一步的分析和研究。
免疫细胞提取方法的发展和优化对于免疫学领域的研究人员和医生来说具有重要意义。
本文旨在综述和分析免疫细胞提取方法的背景、问题以及未来的发展方向。
首先，我们将对免疫细胞提取方法的背景进行概述，包括该技术的起源、发展历程以及目前已有的主要提取方法。
其次，我们将探讨免疫细胞提取方法的重要性，包括在研究领域的应用前景和临床诊断治疗中的重要作用。
最后，我们将着重讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度、损伤等方面的局限性，并对未来的免疫细胞提取方法进行展望，探讨可能的改进和突破。
通过本文的分析和总结，我们将能够更全面地了解免疫细胞提取方法的现状和挑战，并为未来的研究和应用提供思路和参考。
希望本文能够对免疫学领域的研究人员和医学工作者提供有益的信息，推动免疫细胞提取方法的发展和应用。
1.2 文章结构文章结构部分的内容可以进行如下编写：文章结构部分旨在介绍本篇长文的组织和内容。
本篇文章主要探讨免疫细胞提取方法，并对该研究领域进行概述、分析和总结。
首先，在第一部分的引言中，我们将提供对本文的概述。
我们将对免疫细胞提取方法的背景和重要性进行简要介绍，并阐述本文的目的。
通过这一部分，读者可以对免疫细胞提取方法有一个整体的了解，以及对本文的研究目标有所把握。
接下来，在第二部分的正文中，我们将深入探讨免疫细胞提取方法的背景、重要性以及目前存在的问题。
我们将指出免疫细胞提取方法的基本原理和技术，并分析其在免疫学研究和临床应用中的重要性。
同时，我们也将讨论目前存在的免疫细胞提取方法的问题，如提取效率、纯度和可重复性等方面的种种挑战。
免疫细胞的分离与计数
实验五免疫细胞的分离与计数一、实验原理外周血单个核细胞（peripheral mononuclear cells, PMBC）包括淋巴细胞与单核细胞，其中T细胞约占50-70%，B细胞约占10-15%，单核细胞约占10-25%，还有部分NK细胞和其他细胞。
常规的促分裂原诱导的T细胞增殖试验和特异性抗原诱导的T细胞增殖试验可直接用PMBC作为靶细胞，其中混杂的单核细胞可作为抗原提呈细胞促进细胞增殖。
对于要求较高纯度T细胞的试验，可以从PMBC中再纯化T细胞。
因此，分离和获取外周血单个核细胞（PMBC）是检测T细胞免疫功能的基础。
目前常用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法直接分离PMBC。
用来分离人和动物外周血PMBC的分离液的比重是1.077±0.001kg/L的聚蔗糖（Ficoll）—泛影酸葡甲胺（Urografin）(F/H)分离液。
当将抗凝血叠加在淋巴细胞分离液表面水平离心后，由于红细胞、粒细胞、单个核细胞、血浆等的比重不同，会出现分层现象，即在离心管中出现5层：最上层是血浆（内含血小板），血浆层和淋巴细胞分离液层之间是PMBC，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层，又称为棕黄层。
吸取血浆与淋巴细胞分离液层之间的白色细胞，即为所需的PMBC。
二、实验目的1. 掌握Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞的技术与细胞计数法。
2. 掌握脾细胞的分离与计数方法。
三、试剂与材料1.比重为1.077±0.001kg/L的淋巴细胞分离液；2.无菌Hank’s液（4。
C冰箱保存，临用时将PH值调至7.3-7.6）；3.1%台盼蓝染液；4.柠檬酸钠抗凝剂；5.含10%犊牛血清的RPMI-1640培养液；6.仪器设备：血细胞计数板（hemocytometer）、计数器、显微镜、水平离心机、无菌注射器、碘酒、酒精、无菌试管、无菌吸管、微量移液器和无菌枪头。
免疫细胞的分离技术
CD80 (B7-1)、CD86 (B7-2) 、CD267(TACI)、CD268(BAFFR)、
CD269(BCMA)、CD307(IRTA2)
髓样细胞 CD14、CD35(CR1)、CD64 (FcRI)、CD256(APRIL)、
CD257(BAFF)、CD312(EMR2)
血小板 CD36、CD41(整合蛋白IIb)、CD42aCD42d、CD51(整合蛋白v) 、
➢ 不同细胞密度不同 ➢ 不同细胞表面生物学特性不同 ➢ 不同细胞表面分化抗原不同
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免疫细胞的分离技术
根据不同的实验目的可以采取下列不同的分离方法
1、密度梯度离心法 2、黏附分离法（尼龙毛法、贴壁法、亲和板法） 3、磁性分离法 4、荧光激活分离法 5、其他分离法（花环沉降法）
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（一）外周血单个核细胞分离
加工处理抗原，将抗原肽提呈给抗原特异性淋巴细胞的 一组免疫细胞。血液中主要的APC细胞主要包括单核细 胞、树突状细胞、B细胞
10
其他细胞
自然杀伤(NK)细胞，肥大细胞，嗜酸性粒细胞，嗜中 性粒细胞，嗜碱性粒细胞，血小板等
NK细胞 肥大细胞 嗜酸性粒细胞 嗜中性粒细胞 嗜碱性粒细胞 血小板
11
免疫细胞的特征
39
方法 （以CD4+T细胞为例）
1. 羊抗兔Ig包被平皿 2. CD4 一抗培育T细胞，倒入平皿，4℃孵育1小时； 3. 收集未粘附的CD4-T细胞 4. PBS漂洗非特异吸附的CD4-T细胞 5. 收集粘附的CD4+T细胞，可以用刮板刮取并在显微
镜下观察
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免疫磁珠法 （Magnetic activated cell
CD55(DAF)、CD59、CD252(OX40L)、 CD279(PD1)、
9.免疫细胞样本制备
实操拓展
细胞活率
用台盼蓝进行染色，如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞 ，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则 为正常细胞或凋亡细胞。进行计数。
革兰氏染色
革兰氏染色法通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶 于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚 糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇或丙酮脱色处理时其仍呈紫色； 而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交 联度差，通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使 革兰氏阴性菌呈红色。
胞壁上的一种脂多糖和蛋白的复合物，当细
菌死亡或自溶后便会释放出内毒素。内毒素 大量进入血液就会引起发热反应—“热原反 应”。快速检测（1小时）血液、脏器内毒素 含量可以为临床相关疾病的诊断预后提供参
考。
④ 发放前查阅送检报告，所有结果均合格后确定发放。 核对制剂发放信息通知单，确定无误后，打印发放制 剂标签。
流式检测
提问讨论
⑤ 核对信息发放细胞。 收集：根据总量取一定量细 胞悬液至对应编号225ml离心 管，800G、6min离心。
⑥ 第一次洗涤：弃上清， 生理盐水重悬细胞至对应编 号50ml离心管混匀，定容至 50ml，300G,8min。核对细胞 量是否符合质量标准。
⑦ 第二次洗涤：弃上清， 生理盐水重悬细胞混匀， 定容至50ml，300G,8min。
免疫细胞样本制备
一、采集套装
二、样本接收
三、细胞分离提取
①档案填写：根据套装标 签上的信息，填好档案， 完成后续实验准备工作。
②血浆分离：将血液转至 两只50ml注明编号的离心 管，25ml/管、并留样约 1ml测流式，0.5ml测密度。 800G 8min离心。（上升转 速9，下降转速7）
免疫细胞制备
免疫细胞制备
免疫细胞的制备主要包括以下几个步骤：
1. 免疫细胞的来源：免疫细胞可以从多个来源获得，常见的包括外周血、骨髓和脐血等。
2. 免疫细胞的分离：从血液或其他组织中分离出免疫细胞。
分离过程可以使用离心机将血液中的不同成分分离，也可以通过过滤、离心和密度梯度离心等方法从组织中提取免疫细胞。
3. 免疫细胞的激活：为了使免疫细胞更具活性，可以使用不同的激活方法，如使用抗体、细胞因子或抗原等。
4. 免疫细胞的扩增：将分离出的免疫细胞在体外进行培养，使其数量增加。
5. 免疫细胞的检测与鉴定：使用流式细胞术、免疫荧光等技术检测和鉴定免疫细胞的表型和功能。
6. 免疫细胞的储存：将制备好的免疫细胞在低温下保存，以便后续使用。
总之，免疫细胞的制备需要经过多个步骤，每一步都需要严格的质量控制和操作规范，以确保所得免疫细胞的质量和安全性。
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第二节 淋巴细胞及其亚群的分离 1、纯淋巴细胞群的采集
原理：利用单核细胞在37℃和Ca 离子存在条件下，能主动粘附在玻璃、 塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝 胶的特性，据此建立许多从单个核细 胞中除去单核细胞的方法，以获得高 纯度的淋巴细胞群。
(1)粘附贴壁法 因B细胞也有贴壁现象，因此，本 法分离的淋巴细胞群中B细胞有所 损失。
第 免疫细胞的分 二 离和保存技术
十
章
何
印
蕾
概述
临床上的各种类型的免疫缺陷、自身
免疫病以及肿瘤等疾病均可出现淋巴细胞 或淋巴亚群的数量和功能的变化。因此用 体外方法对机体具有免疫反应的外周血淋 巴细胞及其亚群的数目或比例以及它们所 显示的功能的强弱进行检测，是判断机体 细胞免疫水平的一种重要手段。这对于临 床认识疾病、探讨其发病机制、观察病情 变化、判断预后、考核疗效和防治疾病等 方面均有重要意义。
淋 T细胞：CD2、CD3、CD4、CD8、 巴 CD25等 细 胞
B细胞：CD19、CD20、CD21、 CD22、CD29等
(1)E花环沉淀法 方法：淋巴细胞+SRBC悬液→加 入分层液→T细胞形成E花环而沉 于管底→悬液中为B细胞。 （2）尼龙毛分离法 方法：淋巴细胞→通过聚酰胺纤 维管→洗脱下来的是T细胞
胞，是一种单次密度梯度离心分离法。 其主要成分为聚蔗糖(商品名为Ficoll ) 其密度为1.020。可将血液分成四层， 从上到下依次是：血浆、单个核细胞、 粒细胞和红细胞。
2、Percoll分层液 是一种连续密度梯度离心分离法， 其主要成分为：硅胶颗粒，其原液 密度为：1.135。可将血液分成四层， 从上到下依次是：死亡细胞和血小 板、单核细胞、淋巴细胞、粒细胞 和红细胞。
二、外周血单个核细胞的分离
人血液中各种细胞的密度如下：
红细胞：1.093 白细胞：1.092 淋巴细胞和单核细胞：1.075~1.090 血小板：1.030~1.035 单个核细胞包括：淋巴细胞和单核细胞。
分离血细胞常用的分离剂为：Ficoll和 Percoll分离剂 1、 Ficoll分层液
主要用于分离外周血中的单个核细
方法：将包被有关抗体的磁珠与待分离 细胞充分作用，这样借助于抗体磁珠，将与 相应的细胞结合成：细胞－抗体－磁珠复合 物，该细胞在磁场中运动与其他细胞产生明 显差别。如采用层析的方法，将层析柱放于 强磁场中，与磁珠结合的细胞运动将受限， 而未与磁珠结合的细胞将先被洗脱下出来， 再将该柱移出磁场，与结合的细胞也将被洗 脱下来，达到分离目的。
第四节 淋巴细胞的保存和活力测定
1、分离细胞的保存 （1）短期保存
用含有10%~20%灭活小牛 血清的Hanks、Tc-199、 RPMI 1640培养液可保存数周。
（2）长期保存及复苏 保存：在保护剂二甲亚砜中于液氮（-
196℃)中保存。其过程是：先对需冻存的细胞 作活细胞计数，低速离心后，取沉积细胞用含 有10%二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的 细胞悬 液，分装于冻存管内，立即放入降温过
1、自然沉降法 外周血， 抗凝，静置约一 小时血液分为三层，上层为血浆，底层为红 细胞，紧贴红细胞层上面的灰白层为WBC， 轻轻吸取此层即可得到富含WBC悬液，低 渗破坏RBC，洗涤即可。
2、聚合物加速沉淀法 常利用高分子量的聚合物如明 胶、右旋糖酐等，将红细胞快 速沉降，从而分离出白细胞。 本法的细胞获得率比自然沉降 法高。
第三节 吞噬细胞的分离和收集
一、Percoll分离法 此法从外周 血中分离出单核-巨噬细胞，但由 于此类细胞在外周血中的含量较 低，分离时所需的血量较多。
二、斑螯敷法 此法可从人体组织液
中获取较纯的吞噬细胞。其方法是： 用滤纸蘸取10%中药斑螯酒精浸出液， 贴敷在臂内侧皮肤表面，4~5小时后皮 肤局部充血，48小时后局部形成水泡， 吸取水泡中的组织液，内含大量巨噬 细胞。但此法对病人皮肤有一定损伤， 有时可引起局部感染。
（3）亲合板结合分离法—分离亚群 方法：将所需的细胞对应的单克隆抗体包被 于小管内→加入淋巴细胞→形成Ag-Ab复合 物→洗去不反应的物质。
（4）荧光激活细胞分离仪法
荧光激活细胞分离仪(FACS)主 要由4部分组成:细胞流动系统 及气压流速控制系统;激发系统; 检测与讯号处理系统;细胞分选 ห้องสมุดไป่ตู้统。
(2)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗
脱下来的主要是淋巴细胞
(3)磁铁吸引法 利用单核细胞具有吞噬的特性，
在悬液中加入羰基铁颗粒，待单核 细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞 吸至管底，上层液中含较纯的淋巴 细胞群。
2、淋巴细胞亚群的分离
分 离 阳性选择法：纯化所需的细胞
方 法
阴性选择法：去除不要的细胞，留下所需细 胞
其原理是：细胞经荧光染色后，通过高
速流动系统，细胞排成单行，逐个流经 检测区进行测定。当细胞从流动室喷嘴 处流出时，超声振荡动液流，使液流断 裂成一连串的均匀小滴(4000个/s)，每小 滴内最多含一个细胞，细胞经激光束照 射产生荧光和散射光，由光电倍增管接 收，转换成脉冲信号，数据经电脑处理， 分辨细胞的类型。
第一节 免疫细胞的分离
用体外方法对机体各种具有免疫
反应的细胞分别作鉴定、计数和功能 测定，是观察机体免疫状态的一种重 要手段。为此，须将各种参与免疫反 应的细胞从血液中分离出来。参与免 疫的细胞主要包括：淋巴细胞、巨噬 细胞、中性粒细胞等。
一、白细胞的分离
血液中红细胞与白细胞比例约为600~1000： 1，两者的比重不同其沉降速度也不同，通 常用两种方法加以分离。
（5）磁性微球分离法
磁性微球是将磁性材料颗粒表面进行外理， 微球的核心为小金属颗粒，核心处包裹高分子材 料（聚苯乙烯），可结合不同的生物大分子物质 （抗原、抗体、核酸等），若微球表面包被有免 疫物质者称为免疫磁珠，其兼有免疫配基的性质 和磁响应性质，即在磁场中显示磁性，移出磁场 时磁性消除。目前商品出售的磁珠有直径为 1~5um等不同的规格，表面活性基团有氨基（－ NH2）、羧基（－COOH）和羟基（－OH）等， 包被的免疫物质有：一抗、二抗等。