凝胶层析操作过程(莫雯静)
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子（如蛋白质、核酸等）的方法。
该方法基于分子的大小和形状的差异，利用一种孔隙较小的基质（凝胶）将分子按照大小分离，从而达到纯化的目的。
凝胶过滤层析是一种非亲和层析法，因为分离是通过分子与基质之间的排斥效应进行的，而不是通过特定的信号配对。
1.准备样品：将待纯化的生物大分子样品（如蛋白质溶液）处理成适合进行层析的条件。
这通常包括调节样品的pH值、离子强度、缓冲剂等。
2. 准备层析柱：选择合适的凝胶填料，并根据需要选择合适的柱尺寸。
凝胶填料可以是聚合物凝胶或硅胶凝胶。
聚合物凝胶（如Sephadex、Sepharose等）常用于分离中等分子量的生物大分子，而硅胶凝胶（如Sephacryl等）则适用于分离较大分子量的生物大分子。
3.平衡柱：将层析柱与缓冲液平衡。
通常用适当的缓冲液（如甘氨酸盐缓冲液）进行平衡，以确保柱内填充物的孔隙充满均匀。
4.样品加载：取适量的样品，在不破坏填充物的情况下缓慢地、连续地将样品滴入柱顶端。
加载速度要缓慢，以确保样品充分进入柱内而不是渗漏到填充物外。
5.洗脱：在缓冲液的作用下，样品溶液逐渐沿柱体下滤。
较小的分子会占据填充物内较小的孔隙，因此会与缓冲液一起快速通过填充物，而较大的分子则会在填充物中逐渐滞留。
洗脱时间的长短取决于目标分子的大小。
6.收集洗脱液：用收集管接收洗脱液，以便将目标分子收集起来。
7.考虑后续处理：根据需要，纯化后的生物大分子可以进一步进行其他处理，如浓缩、冻干或储存等。
凝胶过滤层析技术的优点包括操作简单、不需要特殊的设备和试剂、分离过程温和且不破坏生物大分子的活性。
但也需要注意凝胶的选择、控制操作速度、适当调节缓冲液等因素，以获得最佳的纯化效果。
另外，凝胶过滤层析不能对极低分子量的物质进行有效分离，且柱内的适用范围有限，对于较大的生物大分子可能需要较长的时间来完成分离。
凝胶过滤层析步骤
凝胶过滤层析步骤凝胶过滤层析是一种常用的色谱技术，广泛应用于生物分离和分析领域。
下面将介绍凝胶过滤层析的步骤。
一、样品制备在进行凝胶过滤层析之前，首先需要准备样品。
样品可以是生物大分子，如蛋白质、核酸等。
样品需要在适当的缓冲液中溶解，并进行必要的预处理，如去除杂质、浓缩等。
二、凝胶选择凝胶过滤层析中常用的凝胶材料有几种，如琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶等。
在选择凝胶时，需要考虑样品的分子大小、分子量范围以及分离的目的等因素。
不同的凝胶材料具有不同的孔隙结构和分子筛效果，因此需要根据实验要求选择合适的凝胶。
三、制备凝胶柱凝胶过滤层析通常需要制备凝胶柱。
制备凝胶柱的方法有很多种，常见的有手工制备和使用专用的凝胶柱填充器。
制备凝胶柱时需要注意填充均匀、不产生气泡和空隙等问题。
四、样品加载将制备好的样品加载到凝胶柱中。
加载样品时，需要根据样品的性质和目的选择合适的操作方法。
一般来说，可以采用重力或压力驱动的方式进行样品加载。
五、洗脱和分离完成样品加载后，可以进行洗脱和分离步骤。
洗脱是指用适当的缓冲液将未结合的样品从凝胶中洗脱出来，以去除杂质。
分离是指将目标分子从凝胶中洗脱出来，以实现分离纯化的目的。
在洗脱和分离过程中，需要根据实验要求选择合适的缓冲液体系和洗脱条件。
六、收集和分析样品完成洗脱和分离后，可以将洗脱液收集起来进行进一步的分析。
收集的洗脱液可以用于测定目标分子的浓度、纯度以及其他相关性质。
常用的分析方法有分光光度法、蛋白质浓度测定、电泳分析等。
七、凝胶再生完成一次凝胶过滤层析后，凝胶柱需要进行再生以便下次使用。
凝胶再生的方法有多种，常见的有使用盐溶液、酸碱溶液或特定的再生缓冲液进行再生。
再生后的凝胶柱需要进行验证，确保再生效果良好。
总结：凝胶过滤层析是一种简单有效的生物分离技术。
通过选择合适的凝胶材料、制备凝胶柱、加载样品、洗脱和分离等步骤，可以实现对样品的纯化和分离。
凝胶过滤层析在生物学、生物化学等领域有着广泛的应用，为研究和分析生物大分子提供了重要的手段。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质 ppt课件
吸水能力，每g干胶吸水量的10倍
数字愈小,交联度越大,被筛分物质的分子量也愈小
例：
Sephadex G-50：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 1500 – 30000
Sephadex G-200：
对多肽及蛋白质的筛分范围(分子量)为: 5000 – 80000
B. 琼脂糖凝胶
( 商品名: Sepharose , Bio- gel – A ) 对实验条件要求高 ( 温度, pH )
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
一、 实验目的
1.掌握凝胶过滤层析法的基本原理； 2.掌握凝胶过滤层析法分离蛋白质的过程。
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
1. 常用生化实验技术
分光光度技术 电泳技术 离心技术 层析技术
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
是利用混合物中各组分的理化性质差异（吸附 力、溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲 和力等）建立起来的技术。
注意：
防止床面干涸，可适当补充蒸馏水
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
① 加样前打开出口，使床面的蒸馏水流出，正好露 出床面时，立即关闭出口（将干未干）
② 用滴管将混合样品(0.6ml，即血红蛋白和溶菌酶 各0.3ml)缓缓沿柱内壁小心加于床表面
③ 打开出口，使样品进入床内，直到床面重新露出, 立即加入1~2倍于样品体积的蒸馏水
名称
操作形式
柱层析法
固定相装于层析柱内，使样品沿着一个方 向前移而达分离的层析法，包括一般柱层 析法、毛细管层析法和微粒填充柱层析法
平面层析法 层析过程在固定相构成的平面层内进行的 层析法，包括纸层析法、薄层层析法和薄 膜层析法
实验一凝胶过滤层析分离蛋白质
分离效率高 分析速度快 具有极高的灵敏度 应用范围广
凝胶层析操作过程(莫雯静)
（四）样 液 的 制 备
样品在上样前要进行适当的处理， 如通过离心、沉淀、抽提等方法以 去除杂质，样液的浓度不宜太稀也 不宜太浓，组分不宜太多。
（五）上 柱
上柱是将欲分离的混合液加入凝胶层 析柱的过程，要在洗脱液的液面恰好 与凝胶床的表面相平时加入混合液， 使组分能够均匀的进入凝胶床。上柱 的混合体积常为凝胶床体积的10%左 右，最大不能超过30%。混合液的浓 度可以高些，但是黏度宜低。
凝胶层析操作过程主要可分为三大步骤：
装柱 上柱 洗脱 凝胶层析实验操作过程：
(一）层 析 柱 ຫໍສະໝຸດ 选 择 层析柱是所有层析方法的主要主要组成 部分。对 层析柱选择合理与否将直接影响分离效果。 选择层析柱主要考虑被分离组分相对分子质量的 差异：（1）分离相对分子质量差别较大的样品可 采用短粗的层析柱，柱长度：柱内径=10:1或 20:1，如脱盐柱。 （2）分离相对分子质量差别较小的样品，可采 用细长的层析柱，柱长度：柱内径=50:1,或 100:1如：蛋白质组分分离。
（六）洗 脱
样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内， 当样品液面洽与凝胶床表面相平时，再加入数毫 升洗脱液洗管壁，洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及 装柱平衡时所使用的液体完全一致，否则会影响 分离效果。使其全部进入凝胶床后，将层析床与 洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速。一 般来说，洗脱流速慢，分离效果好，但是太慢也 会因扩散加剧而影响分离效果。另外洗脱时的流 速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就 不会恒定，理想的分配技术就难以测出。控制流 速的最好装置是恒流泵。
V=K △P/L 但是对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围 很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流 速反而降低。
凝胶层析
凝胶层析技术(凝胶过滤).
3、样品的加入吸取1ml血红蛋白——核黄素混合液，加到凝胶床的表面上，不要沿柱壁加样品，注意加样时勿将床冲起。
打开出口管，用少量水流一下，接触过样品的管壁，再加水扩展洗脱，用试管将洗脱液。
4、洗脱：加去离子水洗脱，流速为每分钟1ml,两分钟收一管。
5、比色测定：波长，红色部分520nm,黄色部分450nm 绘制洗脱曲线：以光密度为纵座标，以时间为横座标，并标明洗脱峰的名称。
6、凝胶的回收。
四、凝胶层析的特点 1、凝胶是一种不带电荷的惰性物质，本身不会与被分离物质相互作用，分离效果好，重复性高。
2、设备简单，操作简便。
五、影响凝胶层析的因素（一）凝胶的选择：（二）凝胶粒度对分离效果的影响 40-60目为粗粒。
100-200目为细粒（应用较多）能使洗脱曲线的峰区变得对称和狭窄。
250-400目为最细粒。
250-400 （三）洗脱流速对分离效果的影响：一般采用流速在30-200ml/小时，过快会使色层谱变形。
（四）离子强度和附值（五）样品液体积对分离效果的影响通常样品液体积约为凝胶床总体积的5-10%。
（六）凝胶柱的长度，直径和分离效果的关系（七）Vo和Vi。
凝胶柱层析操作方法
凝胶柱层析操作方法凝胶柱层析是一种常见的生物化学分离和纯化技术，主要用于分离和纯化蛋白质、核酸、多糖以及其他生物大分子。
它是基于溶液中分子在凝胶柱中通过扩散和吸附/排斥作用的差异，从而实现分离和纯化的过程。
凝胶柱层析的操作步骤如下：1. 准备工作首先，准备好所需的实验设备和试剂，包括凝胶柱、载体溶液、平衡缓冲液、洗脱缓冲液以及待纯化的样品等。
2. 凝胶柱的平衡将凝胶柱放入层析缸中，并用足够的平衡缓冲液预先洗涤凝胶柱，以确保凝胶柱内缸体达到平衡状态。
洗涤凝胶柱的缓冲液通常是与样品一样的成分，以确保样品在平衡和层析过程中的稳定性。
3. 样品的加载将待纯化的样品加入凝胶柱顶部，让样品自由通过凝胶柱，在凝胶柱中发生分子的扩散和吸附/排斥作用，不同组分因差异而逐渐分离。
4. 缓冲液的加入与洗脱根据需要，逐渐加入一定体积的洗脱缓冲液，通过调整洗脱缓冲液的组成和浓度，使目标分子从凝胶柱上洗脱下来。
洗脱过程中，可以利用不同组分在凝胶柱中的吸附/排斥特性来实现分离纯化。
凝胶柱层析的洗脱缓冲液通常是在平衡缓冲液的基础上，通过调整pH值、离子浓度、缓冲剂浓度等参数来实现。
常用的洗脱缓冲液包括梯度洗脱和逐步洗脱等方法。
5. 收集分离纯化的样品通过洗脱，将目标物质从凝胶柱上洗脱下来，可以收集到分离纯化后的样品。
收集的样品可以进行后续的实验分析、储存或进一步纯化。
凝胶柱层析操作中需要注意的事项：1. 凝胶柱的选择根据待纯化样品的性质和分子大小，选择合适的凝胶柱类型和尺寸。
常见的凝胶柱类型包括聚丙烯酰胺凝胶、超大孔凝胶、琼脂糖凝胶等。
2. 缓冲液的选择根据待纯化样品的特性，选择适当的缓冲液，确保样品在平衡、层析和洗脱过程中的稳定性。
常用的缓冲液有Tris-HCl、PBS等。
3. 流速的控制凝胶柱层析过程中，要控制好流速，以避免分子在凝胶柱中过快通过，影响分离效果。
流速的选择应根据试剂和样品的性质进行调节。
4. 洗脱缓冲液的选择需要根据目标分子的特性选择合适的洗脱缓冲液，确保洗脱效果和分离纯化效果的最大化。
实验6 凝胶层析分离技术—血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
实验6、凝胶层析分离技术——血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离(学生实验方案）一、实验目的1. 掌握凝胶层析的基本原理。
2. 熟悉凝胶层析的操作过程。
3．掌握蛋白质洗脱分离监测和收集系统的安装及使用技术。
二、实验原理凝胶层析又叫分子筛层析，是利用凝胶将分子大小不同的物质进行分离的方法。
当分子大小不同的物质通过凝胶时,由于凝胶颗粒内部的网状结构具有分子筛作用,分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。
本实验用葡聚糖凝胶作支持物，用核黄素（黄色，相对分子质量为267KD）和血红蛋白（红色，相对分子质量为67000KD）混合物作样品，在层析时，血红蛋白相对分子质量大，不能进入凝胶颗粒内部，而从凝胶颗粒间隙流下，所受阻力小，移动速度快，先流出层析柱；核黄素相对分子质量小，可进入凝胶颗粒内部，洗脱流程长，因而所受阻力大，移动速度慢，后流出层析柱。
这样就可分离核黄素和血红蛋白。
三、试剂配制1、葡聚糖凝胶：sephadexG-252、洗脱液（pH7.2，0.1mol/L磷酸盐缓冲液）：取0.1mol/L磷酸氢二钠720ml和0.1mol/L 磷酸二氢钠280ml，混匀。
共配10L。
3、0.2%（m/v）血红蛋白溶液4、0.05%（m/v）核黄素(VitB2)溶液5、样品液：0.05%核黄素(VitB2)与0.2%血红蛋白液等量混合置4o C保存。
注意：核黄素需近期生产，并新鲜配制。
四、主要仪器设备1、恒流泵2、层析柱：高25～40cm，内径1cm。
3、自动收集器4、紫外检测仪5、台式记录仪6、可见分光光度计五、实验步骤1、凝胶处理；（1）溶涨与浮选：称取SephadexG-25 5g，加磷酸盐缓冲液（洗脱液）50ml，置于水中浸泡6小时（沸水浴中为2小时）。
转移至100mL量筒中，再加磷酸盐缓冲液（改用蒸馏水）至100mL刻度，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬浮，如此反复多次。
（2）平衡：将浸泡后的凝胶，用3~4倍量的洗脱液处理约1小时，搅拌后继续去除上层细浮悬液。
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析
凝胶色谱层析（Gel Chromatography）是一种常用的分离和分析
生物大分子的技术。
它基于不同分子的大小和形状差异，通过凝胶的
分子筛效应来实现分离。
凝胶色谱层析通常包括以下步骤：
1. 凝胶的选择：选择适当的凝胶，如琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶，根据待分离物质的大小和性质选择合适的凝胶孔径。
2. 柱子的制备：将凝胶填充到柱子中，确保凝胶均匀且无气泡。
3. 上样：将待分离的混合物加载到柱子的顶部。
4. 洗脱：使用适当的洗脱液，通常是缓冲液，将混合物通过柱子
进行洗脱。
大分子物质由于不能进入凝胶的孔径，会首先被洗脱出来，而小分子物质则会被凝胶保留较长时间。
5. 检测：在洗脱过程中，通过检测柱子出口处的洗脱液，可以监
测不同物质的洗脱时间和浓度。
6. 收集和分析：根据洗脱时间和检测结果，收集不同组分的洗脱液，并进行进一步的分析和鉴定。
凝胶色谱层析的优点包括分离效果好、操作简单、可重复性高，适用于分离和分析蛋白质、核酸、多糖等生物大分子。
它是生物化学、分子生物学和生物技术等领域中常用的分离和分析技术之一。
凝胶层析实验报告
凝胶层析实验报告一、实验目的1.学习凝胶层析的原理和操作方法。
2.熟悉常用的层析缓冲液配制方法。
3.掌握凝胶层析实验结果的分析和判断。
二、实验原理凝胶层析是利用凝胶介质对溶液中的离子或分子进行分离和纯化的方法。
其原理基于不同溶质在凝胶介质中的扩散速率差异，从而实现分离和纯化。
在本实验中，我们使用的是凝胶过滤层析。
凝胶过滤层析是一种分子量分离的方法，适用于分离高分子量溶质和低分子量溶质。
其原理是通过选择性的孔径大小和分子量将目标蛋白分离出来。
三、实验步骤1.准备工作：配制层析缓冲液。
2.准备凝胶柱：取一个洁净的层析柱，将其连接到固定底座上。
3.预处理凝胶柱：在凝胶柱上加入适量的层析缓冲液，振荡平衡一段时间。
4.样品处理：将样品加入层析缓冲液中，轻轻混合，使样品均匀分布。
5.等体积加载：将样品缓慢地加入凝胶柱顶部，等体积加载约1.5倍。
6.等待分离：样品逐渐从凝胶柱中过滤，高分子量溶质滞留在凝胶中，而低分子量的溶质通过凝胶柱流出。
7.收集分离物：根据实验需求，收集分离物进行后续的分析或操作。
四、结果分析实验结果以图表形式呈现，其中包括吸光度曲线、蛋白的分离和纯化效果等。
通过分析结果可以得出以下结论：1.凝胶层析可以有效地分离高分子量蛋白和低分子量蛋白。
2.凝胶层析的纯化效果与样品的初始浓度、孔径大小等因素有关。
3.层析缓冲液的pH值和离子强度对层析效果有重要影响。
4.凝胶层析可以用于富集和纯化特定蛋白，为后续实验提供高纯度的样品。
五、实验总结凝胶层析是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，具有操作简便、高效、可扩展性强等优点。
通过本次实验，我对凝胶层析的原理和操作方法有了更深入的了解，并且熟悉了层析缓冲液的配制和实验结果的分析方法。
然而，在实验中还存在一些问题和改进的方向。
首先，凝胶层析的选择需要根据样品特性和实验目的来确定，不同的凝胶介质适用于不同的分离和纯化需求。
其次，凝胶柱的装配和操作要求严格，需要保证凝胶柱平衡和预处理的稳定性。
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤
凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）是一种常用的蛋白纯化方法，可以根据蛋白的分子大小以及形状，将不同分子量的蛋白分离和纯化。
下面将详细介绍凝胶过滤层析纯化蛋白的步骤，并探讨其中一些关键的因素。
1.实验准备：准备所需的层析柱、缓冲液、样品和标准品。
选择合适的层析柱是非常重要的，根据需要选择合适的分离范围和流速。
2.柱填充：将经过活化、平衡的凝胶填充到柱中。
凝胶通常是由多孔的聚合物材料制成，如琼脂糖或聚丙烯酰胺。
选择适当的凝胶类型和粒径主要根据目标蛋白的分子大小来决定。
常见的凝胶类型有Sephadex，Sephacryl和Superdex等。
3.前处理样品：前处理样品通常包括去除杂质和减少非特异性结合。
通过串联多个柱，可以实现前处理样品，如亲和柱或离子交换柱。
4.平衡柱子：使用适当的缓冲液洗涤和平衡填充的柱子，以提前去除杂质和干扰物。
5.样品加载：将待纯化的样品加载到填充好的层析柱中。
样品应根据需要进行浓缩和稀释，使其适合填充层析柱。
6.层析运行：选择恰当的流速和缓冲液来进行层析运行。
在层析过程中，缓冲液会逐渐在凝胶中通过，较大分子的蛋白会随着缓冲液流动而快速通过，而较小分子的蛋白则会受到凝胶孔径限制而在凝胶中滞留更长时间。
这样就实现了蛋白的分离和纯化。
7.收集洗脱分数：根据纯化目标的大小和形状，选择适当的分数收集。
较大分子的蛋白会在前期的分数中被洗脱，而较小分子的蛋白会在后期的分数中被洗脱。
8.分析和纯化评价：通过检测分析，如SDS-或Western blot等技术，评估样品纯度和目标蛋白的丰度。
如果需要更高的纯度，可进行进一步的步骤，如再层析或其他纯化方法。
在凝胶过滤层析纯化蛋白的过程中-选择适当的缓冲液：缓冲液的pH值和离子强度应根据目标蛋白的理化性质进行优化，以保持蛋白稳定性和纯化效果。
-选择合适的流速：流速的选择应根据柱子的尺寸和样品的需求进行调整。
凝胶过滤层析实验报告
一、实验目的1. 了解凝胶过滤层析的原理及操作步骤。
2. 掌握利用凝胶过滤层析法分离混合物中不同分子量蛋白质的方法。
3. 通过实验验证凝胶过滤层析法在蛋白质分离中的应用。
二、实验原理凝胶过滤层析法，又称分子筛层析法或凝胶过滤法，是一种根据分子大小进行分离的层析技术。
该技术利用凝胶的分子筛特性，将混合物中的不同分子量的物质分离。
凝胶是一种具有多孔结构的物质，孔径大小不一，当混合物通过凝胶层析柱时，大分子物质由于无法进入凝胶孔径，将直接通过层析柱；而小分子物质则可以进入凝胶孔径，从而在层析柱中停留较长时间，实现分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质混合物（含有已知分子量的标准蛋白质和未知分子量的蛋白质）- 凝胶层析柱（Sephadex G-75）- 洗脱液（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）- 标准蛋白质（如牛血清白蛋白、卵清蛋白等）- 未知蛋白质样品2. 实验仪器：- 凝胶层析柱架- 凝胶层析柱- 量筒- 离心机- 分光光度计四、实验步骤1. 准备凝胶层析柱：将凝胶层析柱垂直放置于凝胶层析柱架上，用洗脱液平衡凝胶层析柱，直至洗脱液颜色清澈。
2. 加样：取一定量的蛋白质混合物，加入凝胶层析柱的顶部，用洗脱液冲洗，直至混合物完全进入层析柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢冲洗层析柱，收集各部分洗脱液，分别测定其蛋白质含量。
4. 分离：根据洗脱液的蛋白质含量，绘制洗脱曲线，分析不同分子量蛋白质的分离情况。
5. 结果分析：根据标准蛋白质的分子量和洗脱曲线，推测未知蛋白质样品的分子量。
五、实验结果与分析1. 凝胶过滤层析柱平衡后，洗脱液颜色清澈，说明凝胶层析柱已准备就绪。
2. 洗脱过程中，标准蛋白质和未知蛋白质样品的洗脱曲线如下：- 标准蛋白质洗脱曲线：在洗脱曲线中，标准蛋白质的洗脱峰呈对称状，峰面积较大，说明分离效果较好。
- 未知蛋白质样品洗脱曲线：在洗脱曲线中，未知蛋白质样品的洗脱峰位置与标准蛋白质的洗脱峰位置不同，峰面积较小，说明分离效果较差。
实验八 凝胶层析
实验八凝胶层析一实验目的：掌握凝胶层析的基本原理，学会使用凝胶层析分离纯化蛋白质。
二重点难点：凝胶层析分离蛋白质的基本原理三实验原理：凝胶层析又称凝胶过滤，是选用一定大小空隙的凝胶，将混合液中的小分子和大分子物质“筛”开来的一种分离方法。
本实验采用交联葡萄聚糖凝胶G-25作为层析柱，将蓝色葡聚糖和铬酸钾混合物进行分离。
加样后，以0.9% NaCl为溶剂进行洗脱。
由于蓝色葡聚糖和铬酸钾分子量不同，通过交联葡聚糖凝胶层析柱时，分子量较小的铬酸钾进入凝胶颗粒内部网格中，而分子量较大的蓝色葡聚糖分子经凝胶颗粒间的空隙随溶剂先流出，易进入凝胶颗粒内部网格中的铬酸钾分子经过一定时间后才能随溶剂洗出，即分子量大者先洗出，分子量小者后流出，如此，分子大小不同的物质就能被分开。
蓝色葡聚糖和铬酸钾在凝胶柱中可被分离出两条不同颜色的区带，并可分别进行收集。
四实验步骤：具体内容如下：（具体步骤见《基础生物化学实验》P102）1凝胶处理0.9% NaCl浸泡过夜，不用时置4度冰箱保存（夏天需加入叠氮钠防腐）。
2装柱将柱垂直装好，关闭出口。
加入洗脱液1cm高。
将处理好的凝胶用等体积的洗脱液调成浆状，自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中，待底部凝胶沉积约1cm时再打开出口，继续加入凝胶浆至凝胶沉积至一定的高度即可。
装柱要求连续、均匀，无气泡，无纹路。
3平衡洗脱液平衡4加样将柱中多余的液体放出，使得液面刚好盖过凝胶，关闭出口。
将1ml样品沿层析柱管壁小心加入，加完后打开底端入口，使液面降至与凝胶面相平时关闭出口。
5洗脱收集不断加入洗脱液，保持洗脱液面高于凝胶面。
收集洗脱液，紫外检测，记录。
6实验结束后，反复用蒸馏水洗脱柱。
回收玻璃管内凝胶。
凝胶柱层析实验报告
1. 理解凝胶柱层析的基本原理和操作步骤。
2. 掌握凝胶柱层析在分离和纯化生物大分子中的应用。
3. 分析实验结果，验证实验原理。
二、实验原理凝胶柱层析是一种常用的分离技术，主要用于分离分子量不同的生物大分子。
其原理是利用凝胶的分子筛效应，将混合物中的大分子、中分子和小分子进行分离。
凝胶是一种具有三维网状结构的物质，其孔径大小不同，大分子无法进入孔径较小的凝胶颗粒，而小分子则可以自由进出。
在实验中，样品溶液通过凝胶柱，不同分子量的物质将在凝胶柱中形成不同的洗脱峰，从而实现分离。
三、实验材料与仪器1. 材料：蛋白质样品、标准分子量蛋白质、凝胶柱、洗脱液、缓冲液等。
2. 仪器：凝胶柱层析仪、离心管、移液器、微量注射器、凝胶柱等。
四、实验步骤1. 准备凝胶柱：将凝胶柱垂直固定在凝胶柱层析仪上，用缓冲液平衡凝胶柱，使其达到稳定的操作状态。
2. 样品制备：将蛋白质样品与缓冲液混合，用移液器取适量样品加入凝胶柱。
3. 洗脱：用洗脱液缓慢洗脱凝胶柱，收集不同洗脱峰的样品。
4. 样品分析：将收集到的洗脱峰样品进行SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质分子量的变化。
五、实验结果与分析1. 凝胶柱层析分离结果：通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离。
洗脱峰1主要包含大分子蛋白质，洗脱峰2主要包含中分子蛋白质，洗脱峰3主要包含小分子蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳分析结果：将不同洗脱峰的样品进行SDS-PAGE电泳分析，结果显示洗脱峰1的蛋白质分子量最大，洗脱峰3的蛋白质分子量最小，与凝胶柱层析分离结果一致。
1. 凝胶柱层析是一种有效的分离技术，可以用于分离分子量不同的生物大分子。
2. 通过凝胶柱层析实验，成功地将蛋白质样品中的大分子、中分子和小分子分离，并验证了实验原理。
3. 实验结果表明，凝胶柱层析与SDS-PAGE电泳分析相结合，可以实现对蛋白质分子量的准确测定。
七、实验注意事项1. 在进行凝胶柱层析实验时，应注意凝胶柱的平衡和操作状态，以保证实验结果的准确性。
凝胶过滤层析的基本操作
凝胶过滤层析的基本操作凝胶过滤层析（gel filtration chromatography）是一种广泛应用于生物科学和化学研究中的蛋白质和其他大分子化合物的纯化和分离技术。
它利用凝胶过滤基质，通过分子的大小、形状和电荷等物理性质的差异，将待分离物分离出来。
下面将详细介绍凝胶过滤层析的基本操作步骤。
1.准备工作（1）选择合适的凝胶基质：根据待分离物的分子量范围选择合适的凝胶基质，如分子筛、琼脂糖、琼脂糖-琼脂糖6等。
常用的凝胶基质有不同的孔径大小，可以根据待分离物的分子量范围选择合适的孔径大小。
（2）根据凝胶基质使用说明进行膨胀：将干燥的凝胶基质用适当的缓冲液（如PBS）溶解，并在4°C下放置一段时间使凝胶膨胀成固定的形状。
2.样品处理（1）将待分离物样品稀释至合适的浓度：样品浓度过高可能会导致凝胶基质的饱和和堵塞，因此需要根据实验要求和待分离物的特性合理调整样品的浓度。
（2）加入适当的缓冲液：为了保持待分离物的生物活性和稳定性，需要在样品中加入适当的缓冲液，如PBS、Tris-HCl等。
3.装填柱子（1）将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中：可以使用手动装填或压力装填的方法将膨胀好的凝胶基质均匀地填充到层析柱中。
填充时需要轻轻振动层析柱，以排除气泡并获得均匀的填充。
（2）用缓冲液预洗柱子：用适当的缓冲液预洗填充好的层析柱，以去除杂质和预平衡凝胶基质。
4.样品加载和洗脱（1）注射样品：将处理好的样品缓慢地注射到已经平衡的层析柱上。
为了保持柱子的稳定性和样品分离的准确性，需要控制好注射的速度和量。
（2）收集分离的组分：将通过凝胶过滤层析分离的组分逐一收集，可以根据样品分离和实验要求，设置适当的收集管。
5.数据分析（1）测定峰值分离量：可以通过对收集的每个分离组分进行浓度测定，然后计算分离量和回收率。
通过浓度测定可以得到每个分离组分的峰值浓度。
（2）分子量估算：可以将已知分子量的标准品（如蛋白质标准品）以及待分离物的峰值分离量和峰值位置进行对比，从而估算待分离物的分子量。
凝胶层析实验步骤及细节
温州大学第四届生物学科实验技能大赛血清凝胶层析实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告实验时间： 5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。
下午1:30开始血清离心操作及层析操作。
实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具实验后：清理实验器具凝胶层析的实验步骤实验试剂和用品1. 试剂Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水2. 主要实验用具铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）<多孔板、筛板>（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒凝胶层析定义凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。
它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。
凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。
利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
实验原理不同类型凝胶的筛孔的大小不同。
如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。
当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。
凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。
因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。
凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。
凝胶柱的制备在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1小时即可达到凝胶的充分胀溶。
加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤
凝胶过滤层析实验步骤：
①选取合适粒径交联度的凝胶介质如Sephadex G-25根据分子量范围决定；
②准备柱子前需用大量蒸馏水浸泡凝胶颗粒直至完全膨胀恢复活性；
②装柱时缓缓倾倒凝胶悬浮液沿柱壁旋转使之内层密实无明显气泡夹杂；
④平衡过程中用磷酸盐缓冲液PBS以恒定流速洗涤直至流出液pH值稳定；
⑤样品制备时需离心去除沉淀溶解于少量缓冲液中保证浓度适中；
⑥上样后立即开启蠕动泵控制流速让样品均匀分布避免形成沟道效应；
⑦收集各个分数时预先准备好试管架编号记录每管对应体积位置；
⑧检测分子量分布可通过紫外检测器或其他合适手段监测洗脱峰；
⑨对于感兴趣峰段合并浓缩后可通过SDS-PAGE电泳进一步验证纯度；
⑩实验结束后拆卸清洗层析柱防止残留物质影响下次使用效果；
⑪根据实验目的选择合适分子筛范围重复上述过程直至达到分离目标；
⑫数据分析时注意计算保留时间体积并与标准曲线对比确定各组分分子量。
凝胶层析的操作步骤
凝胶层析的操作步骤嘿，咱今儿个就来唠唠凝胶层析的操作步骤哈！这凝胶层析啊，就好比是一场奇妙的筛选游戏。
首先呢，得把凝胶准备好呀，这就像是给游戏搭好舞台。
要挑那些质量好的、合适的凝胶，可不能随随便便哦。
就好像你要去参加比赛，不得选双合脚的鞋子呀！然后呢，把柱子装好，这柱子就是游戏的通道啦。
得装得稳稳当当的，不能歪七扭八的，不然这游戏可没法好好玩咯。
接下来，就是上样啦。
把要分离的东西小心地加进去，这可得轻点儿、慢点，别把啥都给弄乱了。
这就好像你小心翼翼地把宝贝放进盒子里一样。
上样完了，就开始洗脱啦。
洗脱液就像是推动游戏进行的力量，缓缓地、持续地让各种成分在柱子里跑起来。
想象一下，那些成分就像一个个小选手，在跑道上奔跑呢。
在这个过程中，咱可得时刻留意着。
看看它们跑得多快呀，有没有跑错道呀。
这就跟咱平时做事一样，得时刻盯着，不能马虎。
洗脱的速度也很关键哦，太快了不行，太慢了也不行。
这就像跑步的速度，得恰到好处，才能发挥出最佳效果。
等洗脱结束了，就得收集啦。
把不同的成分分别收集起来，这可不能搞混了呀。
就像你把不同颜色的糖果分别放在不同的小盒子里一样。
整个过程说起来好像挺简单，但实际操作可不能大意哟！每一步都得认真对待，不然结果可就不理想啦。
你想想，要是游戏里你不认真玩，能赢吗？凝胶层析就是这样一个有趣又有点神秘的过程。
它能帮我们把复杂的混合物分离开来，就像变魔术一样。
但这魔术可不是随便就能变成功的，得靠我们的细心和耐心呀。
所以啊，大家在操作凝胶层析的时候，一定要记住这些步骤，一步一步慢慢来，别着急。
相信只要认真去做，肯定能得到满意的结果。
加油吧！让我们在凝胶层析的世界里尽情探索！。
凝胶过滤层析上样方法
凝胶过滤层析上样方法《凝胶过滤层析上样方法：超接地气的独家秘籍》嘿，小伙伴们！今天我就像个无私的大侠一样，要把凝胶过滤层析上样方法这个独家秘籍分享给你们。
这就好比是把宝藏的开启方法告诉你们，可别小瞧了，学会了这个，在实验室里你就像个小魔法师一样厉害呢！首先呢，咱们在做凝胶过滤层析上样之前，得把所有要用的东西都准备好。
这就像你要做饭，得先把食材和厨具都摆出来一样。
你得有已经处理好的样品，这个样品可不能是乱七八糟的哦，就像你不能把烂菜叶子直接扔锅里就想炒出好菜一样。
样品得是澄清的，没有杂质，要是有杂质就像你炒菜的时候锅里有沙子，那这凝胶过滤层析可就搞砸了。
然后呢，就是选择合适的上样装置。
这有点像选武器，你得根据你的样品量和具体情况来挑。
如果你的样品量很少，就像你只有一点点调料，那你就得选那种比较小的上样环或者注射器之类的。
要是样品量比较大，就像你要做一大锅汤，那可能就得用大一点的上样设备了。
我曾经就干过一件蠢事，样品量明明不多，我却拿了个大上样装置，结果就像小蚂蚁坐了个大卡车，样品在里面晃荡得不行，效果超级差。
接下来就是关键的上样步骤啦。
在把样品加到上样装置里的时候，动作要轻，要缓。
这就好比你给一个特别娇弱的小宠物喂食，你不能一下子把食物全倒它身上吧。
你得慢慢地把样品注入到凝胶柱上面的液体层里，可千万别直接冲到凝胶里面去，那凝胶可就像个脆弱的小城堡，被你这么一冲就垮了。
我有次心急，就像个莽撞的小牛犊一样，把样品猛得一下灌进去，结果凝胶被冲得乱七八糟，实验结果那叫一个惨不忍睹啊。
还有啊，上样的体积也很有讲究。
你不能太多，也不能太少。
太多的话，就像一群人挤在一个小房间里，大家都动弹不得，样品在凝胶里就不能很好地分离。
太少呢，又像大海里扔了个小石子，根本看不到什么效果。
一般来说，要根据凝胶柱的大小和你样品的性质来确定合适的上样体积。
我就把这想象成给一群人安排住宿，房间大小决定了能住多少人，样品和凝胶柱的关系也是这个道理。
凝胶层析分离核黄素和丙种球蛋白的实验流程
凝胶层析分离核黄素和丙种球蛋白的实验流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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凝胶层析操作过程(莫雯静).共22页文档
56、死去何所道，托体同山阿。 57、春秋多佳日，登高赋新诗。 58、种豆南山下，草盛豆苗稀。晨兴 理荒秽 ，带月 荷锄归 。道狭 草木长 ，夕露 沾我衣 。衣沾 不足惜 ，但使 愿无违 。 59、相见无杂言，但道桑麻长。 60、迢迢新秋夕，亭亭月将圆。
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成பைடு நூலகம்的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
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层析柱 简 介
层析柱简介
1、普通层析柱 2、中压柱
3、尼龙膜
层析柱简介
层析柱是凝胶层析技术的主体：工厂中的层析柱
层析柱 简 介
低压凝胶层析柱
(二）装
柱
装柱的方法可分为湿装法和干装法两种 湿装法：加适量溶剂到柱内 排走空气 搅匀预先用溶剂浸泡好的吸附剂 连续倒入柱中 将此悬浮
自然沉降（至柱高1/4~1/3)
凝胶层析操作过程
莫雯静
凝胶层析即凝胶过滤技术
凝胶过滤技术主要包括：
（1）层析介质的选择 （2）凝胶粒度的选择 （3）凝胶用量的计算 （4）凝胶的处理 （5）柱的选择 （6）装柱 （7）流动相的选择 （8）样液的制备 （9）上柱 （10)洗脱 (11)凝胶柱的再生与保存
（六）洗 脱
样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内， 当样品液面洽与凝胶床表面相平时，再加入数毫 升洗脱液洗管壁，洗脱液应与干燥凝胶溶胀时及 装柱平衡时所使用的液体完全一致，否则会影响 分离效果。使其全部进入凝胶床后，将层析床与 洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速。一 般来说，洗脱流速慢，分离效果好，但是太慢也 会因扩散加剧而影响分离效果。另外洗脱时的流 速要严格控制，否则收集的每一部分洗脱体积就 不会恒定，理想的分配技术就难以测出。控制流 速的最好装置是恒流泵。
凝胶层析操作过程主要可分为三大步骤：
装柱 上柱 洗脱 凝胶层析实验操作过程：
(一）层 析 柱 的 选 择
层析柱是所有层析方法的主要主要组成 部分。对 层析柱选择合理与否将直接影响分离效果。 选择层析柱主要考虑被分离组分相对分子质量的 差异：（1）分离相对分子质量差别较大的样品可 采用短粗的层析柱，柱长度：柱内径=10:1或 20:1，如脱盐柱。 （2）分离相对分子质量差别较小的样品，可采 用细长的层析柱，柱长度：柱内径=50:1,或 100:1如：蛋白质组分分离。
（四）样 液 的 制 备
样品在上样前要进行适当的处理， 如通过离心、沉淀、抽提等方法以 去除杂质，样液的浓度不宜太稀也 不宜太浓，组分不宜太多。
（五）上 柱
上柱是将欲分离的混合液加入凝胶层 析柱的过程，要在洗脱液的液面恰好 与凝胶床的表面相平时加入混合液， 使组分能够均匀的进入凝胶床。上柱 的混合体积常为凝胶床体积的10%左 右，最大不能超过30%。混合液的浓 度可以高些，但是黏度宜低。
（三）流动相的选择
在选择凝胶过滤所使用的缓冲液主要考虑三方面因 素： （1）被分离物质的稳定性： 包括缓冲液的PH、离 子强度及保护剂。 （2）凝胶介质的稳定性：要求不与介质发生化学 反应，不变形，不降解。 （3）分离物质后处理：被分离组分经凝胶过滤分 离后如还需采用其他方法进一步分离，该采用与 后续层析方法同一缓冲液。如果后处理是冰冻干 燥，可选用易挥发性的溶液， 如HAC和NH4OH。
流速对洗脱曲线峰形的影响
洗脱剂的流速对分离效果也有很大的影响，下图 显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线，可 见在较快的流速下得到的洗脱峰较宽且低，流速 低洗脱峰窄而高。也就是说流速较低，分辨率较 高。
恒流泵
欲达到流速恒定的目的，可自己恒压加液 装置（下图），更可靠的是使用微量恒流 泵。
打开柱的下端口 溶剂流出，柱上端悬浮液下降至所 需高度 干装法：直接加吸附剂到柱中，然后倒入溶剂。 （湿装法对各种基质都适用）
装柱应注意事项
在装柱前要在柱的底部放置一层玻璃 纤维或者棉花。 层析柱中基质应符合填装均匀，一致 和没有松紧气泡的标准，所以装柱时， 吸附剂表面要平整，应使其一直浸泡 在溶剂的中，防止气泡或裂纹产生。
如果没有恒流泵该怎么办？
没有恒流泵的情况下可用控制操作压的办法。其 操作压是通过两个液面之间的距离来控制的。
流速与操作压关系
洗脱时，流速与操作压有关，与凝胶的型号与粒度也有
关，在同样的操作压下，洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶பைடு நூலகம் 以及颗粒粗的凝胶流速大；编号大的，粒度细的流速慢。 对于某种凝胶来说，在一定范围内，操作压加大，流速加 快。对于强度大的凝胶，如Sephadex G10~50，在相 当大的柱压范围内流速(V)与操作压（F)成正比，与柱长 (L)成反比：
V=K △P/L 但是对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围 很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流 速反而降低。
凝胶层析
凝胶层析实验操作装置
凝胶层析
参考：《酶工程》科学出版社 主编:施巧琴