基于OPA反应的水解度反应的水解度((DH)测定方法

基于OPA反应的水解度反应的水解度（（DH）测定方法

1．定义：

水解度（DH）的定义是被水解的肽键数的百分比。DH＝水解的肽键数＊100%＝h *100% 总肽键数htot

htot取决于原料的类型。h则是丝氨酸氨基毫摩数的函数。h=(serine-NH2 －β)/ αmmol/g protein

对于大多数食物蛋白而言，氨基酸的平均分子量是125g/mol，则htot约为8，也即每Kg蛋白约含有8摩的肽键。

一些常见的蛋白质的α、β和htot 值见表1。

2．原理：

每水解一个肽键便会释放出一个游离胺基。游离胺基与OPA（邻苯二甲醛）反应形成一种黄色络合物。可用分光光度计在340nm下测量其吸光度。

3．设备:

A.1 容量瓶（100mL, 200mL, 500mL）

A.2 试管（10mL）

B. 分析天平，精确至小数点后四位

C. 磁力搅拌器

D. 分光光度计，可以在340nm下工作

4．试剂:

OPA试剂：

A.1 将7.620g 四硼酸钠和200mgSDS用150mL去离子水溶解。必须在完全溶解后再加入其他试剂

A.2 用4mL乙醇溶解160mg邻苯二甲醛97%（OPA）并将此OPA溶液全部移入A.1，用去离子水冲洗。

A.3 向A.1中加入176mgDTT（99%），用去离子水冲洗。

A.4 定容至200mL

A.5 该试剂对光敏感，应在配制当日使用。丝氨酸标准样品：

B.1 称50mg丝氨酸（Merck Art. 7769）溶于500mL去离子水（0.9516毫摩/升）

B.2 标准溶液可以在5℃下贮存3周。

样品溶液：

B. 用去离子水溶解X g 样品，定容至100mL(0.25-2.5毫摩氨基氮/升）。样

品中蛋白含量在80%－8%时，X为0.1g-1.0g。具体的样品参考称量值见表2。

5．实验步骤:

在340nm下测定吸光度值，以去离子水作参比。A. 每个试管中分别加入3mL OPA。测定一个样品所需试管如下：标准4个空白4个样品2＊2个

每个样品需测定两次，因此需4个试管。B. 标准样品测定：

向装有3mLOPA的试管中加入400uL丝氨酸标准样品，振荡混匀，精确反应2min后在340nm 下测定其吸光度。

在测定空白和样品之前测定两次标准样品的吸光度，在所有空白和样品测定之后再测定两次标样的吸光度，计算时取四次测定的平均值。

C. 空白样测定

D. 样品测定：

向装有3mLOPA的试管中加入400uL去离子水，振荡混匀，精确反应2min后在340nm下测定其吸光度。样品测定两次取平均值。

注：因为吸光度随时间会发生变化，所以应确保在精确反应2min后进行测定。

参考值: 标样：OD≈0.8 空白：OD≈0.07

6．结果计算:

A. h的测定

Serine NH2= ODsample- ODblank * 0.9516 meqv/L * 0.1*100 L/g protein ODstand - ODblank X*P

式中：

Serine NH2 ：毫摩serine NH2/g 蛋白X ：样品重量P ：样品中的蛋白含量0.1 ：样品体积转换成L

则h按下式计算：

h = (Serine NH2 –β)/ αmmol/g protein α、β值见表1。

B. 计算DH