基于OPA反应的水解度反应的水解度((DH)测定方法

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蛋白质水解度测定方法综述

蛋白质水解度测定方法综述
徐英操;刘春红
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2007(028)007
【摘要】对目前国内外常用的蛋白质水解度测定方法进行了综述,其中pH-state 方法是通过滴定水解过程中释放的质子测定DH;OPA、TNBSCLOt内常用的水合茚三酮和甲醛等测定方法是利用游离氨基的反应测定DH.
【总页数】4页(P173-176)
【作者】徐英操;刘春红
【作者单位】东北农业大学理学院应用化学系,黑龙江,哈尔滨,150030;东北农业大学理学院应用化学系,黑龙江,哈尔滨,150030
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.核桃蛋白水解物水解度测定方法比较 [J], 周慧江;朱振宝;易建华
2.蛋白水解物水解度测定方法的研究 [J], 罗艳华;王全杰;陈沛海;高翔
3.蛋白质水解度的测定方法研究 [J], 杨文博;张英华
4.蛋白质水解度的简易测定方法 [J], 袁斌;吕桂善;刘小玲
5.氨基酸配方及蛋白质水解配方特殊医学用途婴儿配方食品中氯测定方法的比较研究 [J], 田洪芸; 李恒; 任雪梅; 张海红; 王文特; 傅俊青; 吴鸿敏
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聚合物水解度的测试方法探析

（２００一ｍ）ｇ蒸馏水，配制母液；
在２５０ｍＬ锥形瓶中加入４０．００ｇ３５．３．４中
溶液，加入６０．ＯＯｇ蒸馏水在磁力搅拌器上以
（３００士２０）ｒ／ｍｉｎ搅拌１５ｍｉｎ：
用两支液滴体积比为ｌ：１的滴管向试样
溶液中加入甲基橙和靛蓝二磺酸钠指示剂各２
溶液的ｐＨ值为９—１０，此时丙烯酸会全部以丙烯酸钠形式存在。再用丙酮或乙醇沉析，干燥后制得纯化后的样品，采用上述的ｐＨ滴定法测定水解度。另一种可行的办法是再用标准酸滴定后，再增加一个碱回滴过程，测定样品的含酸量。对比测得的样品含碱量与含酸量的相对大小，可以判断ＰＡＭ样品中是否含有过量的小分子碱，以及是否含有丙烯酸单元。并通过计算，求出其相应数值，从而求得样品的真实水解度。
低或反应时间较短。也可能当ＨＰＡＭ是经由丙烯酸与丙烯酰胺共聚制备时，可以会使部分飞丙烯酸存在，这部分阴离子基团则难以用酸滴定直接测出。这种情况在一般ＰＡＮ的水解度分析时常被人们忽略。并导致水解度的虚假数值。
针对这种情况，有两种办法可以解决。一种我们在研究中经常采用的样品纯化方法，即将ＨＰＡＭ样品溶于纯水中，用ＮａＯＨ调节
缺点和适用范围。但前六种方法会用到较
爿Ｄ — — 水解度，％；
碱性水解时的残留，比如水解时反应温度较
贵的分析仪器，使其方泛的工业使用受到限制，＿－一般用于科学研究中，有助于对结构不十分明确样品的分析。基于酸碱反应的化学滴定成为工业应用最为可行的方法。

水解程度计算公式

水解程度计算公式水解程度（Degree of Hydrolysis, DH）是衡量某种物质被水解程度的一个通用概念，可以帮助测定有机物质分子中键的水解特征。

它定义为水解物与未发生水解的原始物质总量的比，分子式如下：DH=m/M×100%。

水解程度是有机化学领域中非常重要的框架，描述了有机物质被水解或缩聚的性质。

它也可以用来测定陶瓷材料的溶解度，这种测定方法又叫做袋式法。

水解程度对分子大小的影响也很大，大分子的水解更加容易。

同时，水解程度也可以从人体的微生物数量中获得，以此来查看某种有机物质水解的程度。

水解程度是由不同种类水解反应来实现的。

常见的水解反应有水解反应、电解质反应和离子交换反应。

这些反应在物质的分子结构中的不同链条，会对水解程度产生不同的影响。

举个例子，有机物质甲醇（Methanol）是不容易被水解的，这种物质究竟被水解了多少呢？我们可以生成一组实验数据，从中推断出水解程度的值，新生成的数据可以用于验证预测值。

水解程度的实验测定方法十分有效。

它们可以用于应对水解性能和物质质量之间的变化，如食品中的水解淀粉，检查有机物质的电子结构，还能用于有机合成反应。

通过这些试验，可以获得更准确的水解程度结果。

在实际应用中，无论是工业还是家庭，水解程度总是一个非常重要的因素。

例如，在饮料制造业，企业必须让食品中的淀粉达到一定的水解程度，这样才能得到高质量的口感和风味。

同样，在家庭酿酒制作中，需要把糖溶液水解一定的程度，才能得到理想的效果。

因此，测定水解程度的研究分析，对实际的应用企业来说是非常重要的。

总之，水解程度是由物理和化学反应控制的特征，是衡量某种物质被水解程度的重要指标。

它不仅有助于研究有机物质的键的水解特征，而且应用于食品工业、酒精饮料业以及家庭制作行业等，是作为重要指标被广泛采用的。

尽管水解程度的测定有很多分析方法，但它们都是有效的。

随着水解程度的深入研究，必将更好地应用于工业和家庭生活中。

蛋白水解度测定方法

蛋白水解度测定方法蛋白水解度（Protein Hydrolysis）是指蛋白质在特定的水解条件下被分解的程度。

测定蛋白水解度的方法有很多种，以下是其中几种常见的方法：1.肽图分析法（Peptide Mapping）肽图分析法是一种通过蛋白质在特定条件下水解得到的肽片段的分离和鉴定，来推断蛋白质序列和结构信息的方法。

该方法的原理是，不同的肽片段与固定相的结合能力不同，从而可以在色谱柱上分离出不同的肽片段。

通过对这些肽片段的分析，可以得到蛋白质的一级结构信息，进而计算出蛋白质的水解度。

2.游离氨基含量法（Free Amino Acid Content）游离氨基含量法是通过测定蛋白质水解液中游离氨基的含量，来计算蛋白质的水解度。

该方法的基本原理是，蛋白质水解后生成的游离氨基酸与某些特定的试剂反应，生成有色产物，通过测定有色产物的吸光度，可以得出游离氨基酸的含量。

根据游离氨基酸的含量，可以计算出蛋白质的水解度。

3.肽谱法（Peptide Mass Spectrometry）肽谱法是通过分析蛋白质水解液中肽片段的质量，来推断蛋白质的序列和结构信息。

该方法的基本原理是，不同的肽片段在质谱仪中碎裂后产生不同的离子峰，通过对这些离子峰的分析，可以得出肽片段的质量。

根据肽片段的质量，可以推断出蛋白质的序列和结构信息，进而计算出蛋白质的水解度。

4.生物化学法（Biochemical Methods）生物化学法是通过研究蛋白质在生物体内的代谢过程，来推断蛋白质的水解度。

该方法的基本原理是，蛋白质在生物体内的代谢过程受到许多因素的影响，如酶的活性、底物的浓度、代谢途径等。

通过对这些影响因素的研究，可以推断出蛋白质的水解程度。

5.免疫学法（Immunological Methods）免疫学法是通过检测蛋白质在生物体内的免疫原性，来推断蛋白质的水解度。

该方法的基本原理是，蛋白质在生物体内的免疫原性与其分子量、构象等因素有关。

蛋白质水解度测定方法综述

使用荧光光度计在吸收波长为３４０ｎｍ条件下测
法，采用本方法测定蛋白质水解度时，不需要经典的定衍生物的荧光度。水解度的计算公式：
ｐＨ－ｓｔａｔｅ法那样，对反应体系的ｐＨ值进行在线控制，
ＤＨ＝１００ｎ／Ｎ
而只需在水解结束后将反应体系的ｐＨ调至７．０，并记
式中：ｎ代表牛乳蛋白水解后肽键的平均数，Ｎ代
原料大豆中游离氨基酸进行测定，计算如下：
４小结
ＤＨ＝水解蛋白质的７－．８（ＮＨｍ２ｍ含ｏｌ量／ｇ）－０．３３（ｍｍｏｌ／ｇ）×１００％
其中：０．３３是原料大豆样品中游离氨基含量，可根据自己样品测定值代入。
但是由于不同氨基酸和水合茚三酮显色不同，对测量结果有部分偏差，例如脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应产生黄色物质，因其 α－氨基被取代，所以产生不同的衍生物。郭兴凤［１３］利用待水解原料的完全水解液作为标准，消除了由于不同氨基酸与茚三酮结合产
蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成，在这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成，称为非必需氨基酸；而另外约有八种氨基酸必需由食物供给，称为必需氨基酸。食物中如含有全部的必需氨基酸，而且数量又多，这种食物蛋白质营养价值就高。但是，存在一个问题，就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于人体的吸收，因此国内外通过对此进行大量的研究表明：蛋白质通过水解，水解为二肽或三肽的产物在人体内要比自由氨基酸易于吸收，比没有水解的蛋白质更易于吸收［１］。因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进行水解时，必须要对水解度进行测定。
在水解过程中，当肽键断裂后，就会有一个新的－ＣＯＯＨ和－ＮＨ２形成，因此，水解肽键的数，就可以根据水解后测定新形成的末端－ＣＯＯＨ或－ＮＨ２基团的量确定。

食用蛋白质水解度的改良测定方法

食用蛋白质水解度的改良测定方法摘要：当制备水解蛋白的时候，测定水解度（DH）是至关重要的。

已建立的三硝基苯磺酸（TNBS）发被认为是测定酶水解度的常用方法。

然为，三硝基苯磺酸法费时费力，不能连续的测定水解反应程度，并且需要使用有危险不安全的化学试剂。

本文阐述了一种基于基本氨基酸与邻苯二甲醛（OPA）反应的水解度测定方法。

结论是使用OPA法测定蛋白质的水解度更准确，方便，迅速，有更为广泛的使用范围，并且较之TNBS方法更环保。

关键词：水解度，食用蛋白，水解，蛋白质水解，测定介绍在蛋白质水解物当中，检测反应的一个关键参数就是水解度（DH）。

DH值呗定义为断开的肽键的百分比：DH=h/h tot*100%试中htot是每蛋白质当量中肽键总数，h是被水解的肽键数。

Htot是取决于原料的氨基酸组成。

在各种文献中，人们已经建立了几种测定蛋白质水解物DH值的方法，例如pH-stat法，渗压法，可溶性氮法以及三硝基苯磺酸（TNBS）法。

pH-stat法（Jacobsen 等，1957）测定DH值是基于一种基准物（或是由于水解物pH值变化产生的酸）来保持水解过程中的pH值。

基准物质的使用量与DH值是成比例的。

在实际的蛋白质水解试验中，Ph-stat法的使用仅限于pH略高于7的条件下（Adler-Nissen,1986）。

当水解反应的DH值达到约30%时，采用Ph-stat法来测定水解度并不经济可行，在pH>7的单一酶反应系统中使用该方法是不可取的。

这将使最适pH值低于7的酶不适用Ph-stat法。

另外，在水解反应当中添加基准物可能会导致最终产物的使用不尽如人意。

在水解反应当中，混合物冰点的降低值可以通过渗压计（冰点测定器）来测得。

这与DH值是相关的（Adler-Nissen,1984）.渗压法是一种可以在多种反应当中使用的快速方法。

这种方法的限制之处就在于它不能测定粘度大的溶液及溶质溶解度高的溶液，例如在长期反应当中作为防腐剂的盐。

蛋白水解度测定方法

2. 标准溶液测试
将 400ul 丝氨酸标准溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中（时间点 0），混合均匀（5S）后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。
在测空白和样品值之前测 2 个标准品，另 2 个标准品在测完空白和样品后再测。标准品的吸光值取 4 次的平均值。
一般情况下 ODstand.≈0.8
��
更多 α，β，htot 的精确数值请参见备注。此处的 DH 是指样品相对于原始底物的水解度，如果要计算水解反应前后的水解度，需要使用如下公式：
h1 − h0 DH = htot × 100%
h0: 水解反应前样品相对原始底物的水解度； h1: 水解反应后样品相对原始底物的水解度。
二、原理 OPA（邻苯二甲醛）法测定蛋白质水解度的原理是 OPA 在 β-巯基乙醇的存在下会与自由 α氨基形成黄色化合物，其在 340nm 处有特征吸收，用分光光度计可检测其 OD 值。实际使用中 1，4 二巯基苏糖醇（DTT）比 β-巯基乙醇更易使用。
3.2 丝氨酸标准溶液将 50mg 丝氨酸（serine）溶解于 500ml 去离子水中。此溶液中 Serine-NH2 约为 0.9516 meqv/L.
3.3 样品溶液
将 Xg 样品溶解于 100ml 去离子水中，X 的值在 0.1～1.0 之间。
如果样品蛋白含量为 80%，则 X 取 0.1g，如果样品蛋白含量为 8%，则 X 取 1.0g。
4. 样品测试将 400ul 样品溶液加入到一个装有 3mlOPA 试剂的测试管中（时间点 0），混合均匀（5S）后精确静置 2min 后立即读取 340nm 的吸光值。因为吸光值会随时间变化，所以读取 OD 值的时间必须是同样的（2min）。

蛋白质水解度测定方法综述_徐英操

ｈｏｈｏ
×１００
式中：ｈｓ和ｈｏ分别代表ＷＰＩ水解产物中和没进行
水解的ＷＰＩ中氨基酸浓度；ｈｔ代表用６ｍｏｌ／Ｌ盐酸完全
水解ＷＰＩ产物中总的氨基酸的浓度。没有酶的没水解
的蛋白质溶液视为０％ＤＨ。
ｐＫ＝ｐＨ２＋ｌｏｇ（ｂ２－
ｂ１）－
ｌｏｇ（１０
ｐＨ－２
ｐＨ１×ｂ２－
综述
食品研究与开发
２００７．Ｖｏｌ．２８．ＮＯ．０７１７５
解，放出氨和二氧化碳，氨基酸生成醛，水合茚三酮则３．２水溶性蛋白质的测定
生成还原型茚三酮。在弱酸性溶液中，还原型茚三酮、
蛋白质通过酶水解，形成易溶解的小分子的多肽
氨和另一分子茚三酮反应，缩合生成蓝紫色物质。
溶液，使得溶解性增加，因此在一定程度上，水解度的
根据水解度的定义如果直接用水解后游离氨基总增加及可溶性蛋白的含量也可以用来表征蛋白质水解
含量计算水解度，由于用水合茚三酮显色法无法判断的程度。测定水溶性蛋白质的方法很多，有福林－酚
水解后的游离氨基是原样品中本来就含有的还是经水法、双缩脲法、考马斯亮蓝等。
解产生的，因此，赵新淮，冯志彪［１２］对此进行研究，并对
肽键数，这里的ｈ和ｈｔｏｔ单位经常用ｍｍｏｌ／ｇ表示。对于一个特定的蛋白质，ｈｔｏｔ是一个常数，一般采用文献中的经验值，比如：大豆蛋白质的ｈｔｏｔ值为７．８ｍｍｏｌ／ｇ，酪蛋白质的ｈｔｏｔ值为８．２ｍｍｏｌ／ｇ，也可以根据蛋白质中氨基酸的组成成分计算得到［２］。
蛋白质由不同的氨基酸通过肽键相连所组成，在这些氨基酸中一部分可以由人体自己合成，称为非必需氨基酸；而另外约有八种氨基酸必需由食物供给，称为必需氨基酸。食物中如含有全部的必需氨基酸，而且数量又多，这种食物蛋白质营养价值就高。但是，存在一个问题，就是如何使蛋白质或氨基酸更有利于人体的吸收，因此国内外通过对此进行大量的研究表明：蛋白质通过水解，水解为二肽或三肽的产物在人体内要比自由氨基酸易于吸收，比没有水解的蛋白质更易于吸收［１］。因此在用不同的蛋白质酶对蛋白质进行水解时，必须要对水解度进行测定。

棉籽蛋白水解物水解度3种测定方法的比较

棉籽蛋白水解物水解度3种测定方法的比较林虬;黄薇;宋永康;姚清华;颜孙安;钱爱萍【摘要】介绍了一种比较简单可行、适用于棉籽蛋白水解度的测定方法——OPA 法.选用中性蛋白酶将棉籽蛋白水解成棉籽多肽,通过新建立的方法测定不同酶解时间棉籽蛋白水解液的水解度,并与文献所报道的甲醛滴定法和茚三酮比色法进行比较.结果表明,与甲醛滴定法和茚三酮比色法相比,OPA法更简便、更快速,且灵敏度高、可重复性强、对环境友好,是3种方法中最适合测定棉籽蛋白水解液水解度的方法,同时该方法也适用于饲料及食品行业中其他蛋白水解度的测定.%This paper introduced a method that based on the reaction oi primary ammo groups with o-phthaldialdehyde (OPA) for determining the hydrolytic degree of cottonseed protein. Neutral protease was used to hydrolyze cottonseed protein and the degree of hydrolysis (DH) was compared with three assay methods, I. E. O-phthaldialdehyde method, formaldehyde titration method and ninhydrin colorimetric method. Comparing with formaldehyde titration and ninhydrin colorimetric methods, results showed that OPA method performed more accurate and faster in analyzing, easier to handle, repeatable in results and friendly for environment. It is recommended that OPA method is an appropriate method for evaluating in hydrolytic degree of cottonseed protein.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】5页(P1076-1080)【关键词】水解度;棉籽蛋白;对苯二甲醛法【作者】林虬;黄薇;宋永康;姚清华;颜孙安;钱爱萍【作者单位】福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州 350003;福建省农业科学院中心实验室,福建福州 350003;福建省精密仪器农业测试重点实验室,福建福州350003【正文语种】中文近年来，棉籽蛋白受到饲料业的普遍关注，提高棉籽蛋白资源利用率成为当前国内外学者研究的热点，其中使用蛋白酶生物技术将低值的蛋白源转化成多肽、寡肽等高值蛋白原料的方法极具生命力，是目前棉籽蛋白质的开发和利用的新方法和思路。

基于OPA反应的水解度反应的水解度((DH)测定方法

基于OPA反应的水解度反应的水解度（（DH）测定方法1．定义：水解度（DH）的定义是被水解的肽键数的百分比。

DH＝水解的肽键数＊100%＝h *100% 总肽键数htothtot取决于原料的类型。

h则是丝氨酸氨基毫摩数的函数。

h=(serine-NH2 －β)/ αmmol/g protein对于大多数食物蛋白而言，氨基酸的平均分子量是125g/mol，则htot约为8，也即每Kg蛋白约含有8摩的肽键。

一些常见的蛋白质的α、β和htot 值见表1。

2．原理：每水解一个肽键便会释放出一个游离胺基。

游离胺基与OPA（邻苯二甲醛）反应形成一种黄色络合物。

可用分光光度计在340nm下测量其吸光度。

3．设备:A.1 容量瓶（100mL, 200mL, 500mL）A.2 试管（10mL）B. 分析天平，精确至小数点后四位C. 磁力搅拌器D. 分光光度计，可以在340nm下工作4．试剂:OPA试剂：A.1 将7.620g 四硼酸钠和200mgSDS用150mL去离子水溶解。

必须在完全溶解后再加入其他试剂A.2 用4mL乙醇溶解160mg邻苯二甲醛97%（OPA）并将此OPA溶液全部移入A.1，用去离子水冲洗。

A.3 向A.1中加入176mgDTT（99%），用去离子水冲洗。

A.4 定容至200mLA.5 该试剂对光敏感，应在配制当日使用。

丝氨酸标准样品：B.1 称50mg丝氨酸（Merck Art. 7769）溶于500mL去离子水（0.9516毫摩/升）B.2 标准溶液可以在5℃下贮存3周。

样品溶液：B. 用去离子水溶解X g 样品，定容至100mL(0.25-2.5毫摩氨基氮/升）。

样品中蛋白含量在80%－8%时，X为0.1g-1.0g。

具体的样品参考称量值见表2。

5．实验步骤:在340nm下测定吸光度值，以去离子水作参比。

A. 每个试管中分别加入3mL OPA。

测定一个样品所需试管如下：标准4个空白4个样品2＊2个每个样品需测定两次，因此需4个试管。

蛋白水解物水解度测定方法的研究

蛋白水解物水解度测定方法的研究一、本文概述本文旨在深入研究并探讨蛋白水解物水解度的测定方法。

蛋白水解物，即蛋白质经过水解反应后的产物，其水解度的测定对于了解蛋白质的结构与功能、优化蛋白质水解工艺以及评估蛋白质水解产物的营养价值具有重要意义。

因此，本文将从多个方面对蛋白水解物水解度的测定方法进行系统研究，以期为提高蛋白水解物质量评价和工业生产过程的优化提供理论依据和技术支持。

具体而言，本文将首先综述现有的蛋白水解物水解度测定方法，包括化学法、光谱法、色谱法等，并分析其优缺点和适用范围。

在此基础上，本文将重点研究基于现代分析技术的水解度测定新方法，如高效液相色谱法、质谱法等，以提高测定的准确性和灵敏度。

本文还将关注水解度测定过程中的影响因素，如温度、pH值、水解时间等，以揭示其对水解度测定结果的影响规律。

通过本文的研究，期望能够为相关领域的研究人员和技术人员提供一套系统、全面的蛋白水解物水解度测定方法，以推动蛋白质水解技术的不断发展和应用领域的拓展。

二、蛋白水解物水解度测定方法概述蛋白水解物水解度的测定对于了解蛋白质在生物体内的消化、吸收和代谢过程，以及优化蛋白酶的催化效率具有重要意义。

水解度是描述蛋白质被水解成氨基酸或多肽的程度，其测定方法主要基于水解产物的分析。

目前，常用的蛋白水解物水解度测定方法主要包括化学法、光谱法和色谱法。

化学法主要利用氨基酸与某些化学试剂的特异性反应来测定水解产物的量，如茚三酮法和甲醛滴定法。

这些方法操作简便，但精度相对较低，且易受干扰。

光谱法如紫外-可见光谱法和荧光光谱法，通过测定水解产物在特定波长下的吸光度或荧光强度来推算水解度。

这种方法灵敏度高，但需要对样品进行预处理，且可能受到其他物质的干扰。

色谱法如高效液相色谱法（HPLC）和氨基酸自动分析仪，能够对水解产物进行分离和定量分析。

这些方法准确性高，但操作复杂，成本较高。

近年来还出现了一些新的测定方法，如基于酶联免疫吸附试验（ELISA）的方法，以及利用近红外光谱、拉曼光谱等现代光谱技术的方法。

蛋白水解物水解度测定方法的研究

蛋白水解物水解度测定方法的研究罗艳华;王全杰;陈沛海;高翔【摘要】本文通过TNBS法、OPA法、茚三酮比色法三种方法对革屑水解物、乳清蛋白水解物和毛发水解物的水解度进行了测定.结果表明:三种方法在测量革屑水解物和乳清蛋白水解物的水解度时结果比较接近,茚三酮法和OPA法略低;但在测量毛发水解物时OPA法的测量结果明显小于TNBS法和茚三酮法;同时茚三酮法吸光度波动较大,不稳定;OPA法和TNBS法的测定结果更能接近实际的游离氨基浓度,从而水解度的计算更准确,而且OPA法操作更简便,反应时间更短.%In this paper, the degree of hydrolysis of the leather scraps hydrolysate,whey protein hydrolysate and hair hydrolysate were determined by TNBS, OPA, ninhydrin colorimetry. The results showed that:The results of these three methods were relatively close in measuring the degree of hydrolysis of the leather scraps hydrolysate and whey protein hydrolysate,Indene three ketone and OPA slightly lower; but the measurement results of OPA method in the measurement of hair hydrolysate was significantly less than the TNBS method and three indene ketone method;at the same time, Yin three ketone absorbance fluctuated widely, unstable;the results of OPA method and TNBS method were more close to the actual concentration of free amino acid, so the calculation of degree of hydrolysis was more accurate, and the OPA method was more simple and convenient, and the reaction time was shorter.【期刊名称】《皮革与化工》【年(卷),期】2017(034)002【总页数】6页(P26-31)【关键词】蛋白质;水解度;游离氨基;OPA法;TNBS法;茚三酮法【作者】罗艳华;王全杰;陈沛海;高翔【作者单位】陕西科技大学,陕西西安 710021;陕西科技大学,陕西西安 710021;烟台大学,山东烟台 264005;烟台大学,山东烟台 264005;江南大学,江苏无锡 214122【正文语种】中文【中图分类】TQ936.1我国是制革大国、食品大国，伴随着我国经济高速发展，我国的这些工业发展越来越迅速。

蛋白质水解度的简易测定方法

蛋白质水解度的简易测定方法1.实验原理：蛋白质水解度的测定方法通常基于蛋白质中的特定氨基酸残基（如酪氨酸）在酸性和碱性条件下发生水解产生的特定产物的定量测定。

本实验基于酸性条件下酪氨酸的水解反应，通过测定水解后产生的酪氨酸相关物质的含量来计算蛋白质水解度。

2.实验步骤：步骤1：样品制备称取适量的待测蛋白质样品，加入一定体积的适宜浓度的酸性溶液（如6MHCl），并通过搅拌使蛋白质样品均匀分散。

将样品置于恒温水浴中，在一定的酸性条件下进行水解反应。

步骤2：样品处理在水解反应结束后，取出样品并进行处理。

将样品中的酸成分中和，通常使用适量的氢氧化钠溶液进行中和。

同时，可添加适量的酸性指示剂进行中和状态的可视化判断。

步骤3：产物分析将处理后的样品转移至分析容器中，并适当稀释。

利用合适的分析方法，如紫外可见光谱法、高效液相色谱法（HPLC）或毛细管电泳等分析方法，测定样品中特定产物（如酪氨酸）的含量。

步骤4：计算水解度根据上一步骤中测得的特定产物的含量，结合待测蛋白质的初始浓度和水解反应的体积等参数，可计算蛋白质的水解度。

水解度的计算公式如下：水解度（%）=（水解产物浓度/总蛋白质初始浓度）×100%3.实验注意事项：-实验中的酸性条件需要根据待测蛋白质的特性和水解反应的要求进行调整，确保水解反应的有效进行。

-在中和步骤中，应严格控制中和剂的用量，以避免影响产物浓度测定的精确性。

-在产物分析步骤中，要选择合适的分析方法，并注意样品预处理的影响，以确保分析结果的准确性和可靠性。

-实验过程中需要进行严格的操作控制，避免误差的引入，影响实验结果的准确性。

4.结论：本实验介绍了一种简易测定蛋白质水解度的方法。

通过在酸性条件下进行水解反应，并测定水解产物的含量，可以计算蛋白质的水解度。

这种方法具有简单、快速、准确的特点，适合于大规模的蛋白质水解度测定。

但需要注意实验操作的精确性和条件的合理性，以确保实验结果的可靠性和准确性。

邻苯二甲醛测定氨基酸原理

邻苯二甲醛测定氨基酸原理邻苯二甲醛(OPA)是一种常用的氨基酸分析试剂，它能够与氨基酸反应生成荧光产物，通过测定荧光产物的荧光强度可以定量测定氨基酸的含量。

下面将详细介绍邻苯二甲醛测定氨基酸的原理。

1.反应机理邻苯二甲醛与氨基酸的反应机理主要包括两个步骤：第一步是邻苯二甲醛与氨基酸的活性基团发生亲核加成反应，生成中间产物；第二步是中间产物发生水解反应，生成荧光产物。

具体反应过程如下：(1)亲核加成反应：邻苯二甲醛的醛基与氨基酸的氨基发生亲核加成反应，生成中间产物。

这一步需要酸催化剂的存在，如盐酸HCl等。

(2)水解反应：中间产物在酸性条件下发生水解反应，生成荧光产物。

这一步也需要酸催化剂的存在。

(3)荧光产物的生成：荧光产物经过进一步反应，生成具有荧光的化合物。

该化合物的荧光强度与氨基酸的含量成正比，从而可以定量测定氨基酸的含量。

2.邻苯二甲醛与氨基酸的反应条件及产物性质(1)反应条件：邻苯二甲醛与氨基酸的反应需要在酸性条件下进行，一般使用盐酸HCl等作为酸催化剂。

反应温度和反应时间也会影响反应结果，通常在室温下进行反应，反应时间约为10分钟至2小时。

(2)产物性质：生成的荧光产物具有较高的荧光强度和稳定性,可以用于定量测定氨基酸的含量。

荧光产物的波长范围在340nm至40Onnl 之间，具有较高的量子产率和寿命。

3.测定方法及注意事项(1)样品准备：将待测氨基酸样品用适量的缓冲液稀释，加入适量的邻苯二甲醛试剂，充分混合均匀。

然后将样品在室温下反应一定时间，生成荧光产物。

(2)激发波长和发射波长的选择：选择合适的激发波长和发射波长是测定荧光产物的关键步骤。

通常选择的激发波长范围为34Onm至360nm,发射波长范围为400nm至450nm o通过调整激发波长和发射波长可以获得最佳的荧光信号。

(3)荧光强度的测量：使用荧光光谱仪或荧光光度计测量荧光产物的荧光强度。

在测量时需要注意仪器的校准和标准化，以保证测量结果的准确性。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法1.水解度（DH ）的测定采用OPA （邻苯二甲醛）法，取3.00 mLOPA 溶液于试管中加入400 μL 稀释至一定倍数的水解上清液，精确反应2 min 后在340 nm 处测定吸光值。

同时以丝氨酸标准溶液（0.9516 mmol/L ）作参考和空白试验。

()mmol/g7.72tot h ）,摩尔数（mmol/g 每克原料蛋白的肽键毫tot 数0.4和1表示；h 式中：β、α分别以常 (2) 100％tot h /αβ-2SerineNH DH 清液体积N：稀释倍数；V：上含量；量；P：样品中的蛋白/g蛋白；X：样品重2serineNH ：mmol 2H 式中：SerineN (1) protein L/g P X V N mmol/L 0.9516空白式样－OD 标准样品OD 空白式样OD 待测样品OD2SerineNH =⨯=⨯⨯⨯⨯-=2.酶解产物的相对分子质量的分布采用高效液相色谱法测定。

取酶解液上清液稀释至一定浓度，微孔过滤膜过滤后上色谱柱。

色谱条件：实验色谱柱：TSK gel 2000SWXL （300 mmx7.8 mm ），流动相：乙腈：水：三氟乙酸=45:55:0.1（V/V/V ），检测波长220 nm ，流速0.5 mL/min ，柱温30℃，进样量10 μL 。

3.DPPH 清除能力测定取一定浓度的样品溶液4 ml ，加入1 ml 用甲醇配制的DPPH 溶液，并使DPPH终浓度为0.2 mmol/L 。

用力振摇混匀后置暗室中静置30 min ，于517 nm 处测定吸光度。

按照下式计算DPPH 清除率。

DPPH 清除率（％）=100*（1-（A2-A1）/A0），式中：A2是加入样品溶液后的吸光度；A1是样品溶液本底的吸光度；A0是空白对照液的吸光度。

4.总还原能力测定称取一定浓度的样品溶液2.5 mL ，加入0.2 mol/L 磷酸缓冲液（pH 6.6）和1％铁氰化钾溶液各2.5 mL ，混合均匀。

水解度测定的国标方法

水解度测定的国标方法引言水解度是描述物质在水中溶解程度的性质之一，广泛应用于药物、化妆品、食品等领域的研究和生产中。

为了保证水解度测定的准确性和可比性，国家标准委员会制定了水解度测定的国标方法。

本文将对水解度测定的国标方法进行全面、详细、完整和深入的探讨。

什么是水解度水解度是指物质在一定温度下在水中的溶解程度。

它是通过测定物质在水中形成溶液的浓度或溶解度来进行评估的。

水解度通常用百分比表示，表示物质溶解在水中所占的百分比。

水解度测定的意义水解度是描述物质在水中溶解程度的重要指标，对于药物、化妆品、食品等领域的研究和生产具有重要意义。

准确测定物质的水解度，可以为药物剂量的确定、药效的发挥、药物的质量评价等提供可靠的依据。

水解度测定的国标方法国家标准委员会制定了一套水解度测定的标准方法，以保证测定结果的准确性和可比性。

该方法主要包括以下几个方面的内容：样品准备1.准备一定数量的样品，并确保样品的纯度和质量符合要求。

2.如果样品是固体，需要进行粉碎并筛选，以获得均匀粒径的样品。

测定条件设置1.确定测定的温度和pH值，这两个参数对水解度测定具有重要影响。

2.确定测定的时间，通常需要在一定的时间范围内测定水解度的变化。

溶液制备1.将一定量的样品加入适量的水中，以便样品完全溶解。

2.在制备溶液时，要注意控制溶解温度和搅拌速度，以保证溶液的均匀性。

测定方法1.取一定体积的溶液，通过一定的方法（如滴定法、分光光度法等）测定其中溶质的浓度。

2.根据测定结果，计算出溶质的水解度。

数据处理和分析1.对测定得到的数据进行统计和分析，计算出水解度的平均值和标准差等参数。

2.利用统计学方法对数据进行处理，以确定水解度的可靠性和可比性。

水解度测定的注意事项1.在进行水解度测定时，要严格控制测定条件，确保测定结果的准确性和可比性。

2.样品的选择和准备要符合要求，以避免对水解度测定结果的影响。

3.测定前要对仪器设备进行校准和检查，以确保测定的准确性。

水解度的测定方法

水解度的测定方法1. 直接观察法直接观察法是一种简单直观的测定水解度的方法。

该方法适用于一些易溶于水且水解反应速度较慢的物质。

首先，将待测物质加入一定量的水中，搅拌均匀。

然后，观察物质是否完全溶解，以及是否发生水解反应产生沉淀。

如果物质完全溶解且无沉淀生成，则说明水解度很高；如果物质未完全溶解或有沉淀生成，则说明水解度较低。

2. 重量法重量法是一种常用的测定水解度的方法。

该方法适用于水解反应速度较快的物质。

首先，将待测物质加入一定量的水中，搅拌均匀。

然后，将溶液过滤，将滤液和沉淀分别称重。

根据溶液中物质的质量和总质量，可以计算出溶解的百分比，即水解度。

3. 比色法比色法是一种常用的测定水解度的方法。

该方法适用于水解产物具有显色性质的物质。

首先，将待测物质加入一定量的水中，搅拌均匀。

然后，用分光光度计测定溶液的吸光度。

根据溶液吸光度与物质浓度之间的关系，可以计算出物质的浓度，从而得到水解度。

4. pH法pH法是一种常用的测定水解度的方法。

该方法适用于水解反应与溶液的酸碱性质相关的物质。

首先，将待测物质加入一定量的水中，搅拌均匀。

然后，用pH计测定溶液的酸碱性。

根据溶液的pH值，可以推断出水解反应的进行程度，从而得到水解度。

5. 离子选择性电极法离子选择性电极法是一种准确测定水解度的方法。

该方法适用于水解产物能够与特定离子发生反应的物质。

首先，将待测物质加入一定量的水中，搅拌均匀。

然后，用离子选择性电极测定溶液中特定离子的浓度。

根据离子浓度与物质浓度之间的关系，可以计算出物质的浓度，从而得到水解度。

总结起来，水解度的测定方法包括直接观察法、重量法、比色法、pH法和离子选择性电极法等。

不同的方法适用于不同的物质和实验条件。

在进行测定时，需要根据具体情况选择合适的方法，并注意实验操作的准确性和数据的可靠性。

水解度的测定对于了解物质的溶解性质和反应活性具有重要意义，能够为化学研究和工业生产提供有价值的信息。

水解度指标测定

水解度的测定方法一：（前三酮比色法）（1）标准曲线制定:1、20 g/ml甘氨酸：2mg甘氨酸定容到100ml容量瓶中。

2、前三酮显示剂：水合前三酮0.5g ,果糖0.3g，磷酸氢二钠11.2g ,磷酸二氢钾6g,定容到100ml.稍热溶解，避过低温保存1周。

3、40%^醇标准曲线制作试管0 1 2345678待测样品标液ml0.000.1 0.20.30.40.50.60.7 1.00.5蒸储水ml 2.00 1.90 1.80 1.70 1.60 1.50 1.40 1.30 1.00 1.5前二酮显示剂ml1 1 1摇匀，沸水浴115min,1 1 1用冷水迅速冷却至室温11140%^醇ml5 5 55555555甘氨酸gOD(570nm)0 2 46810121420??因甘嬴酸的分子量为：75.07,换算成-NH?的呻。

1数的AQ关系: 水解度计算公式：DH-—>100%水解液-心曲含萼5凹一原料蛋白质中游高_也含量（响0 g）h^irnmol/g)xioo%所以米糠蛋白的加广7・3477N----水解液蛋白含量（凯氏定氮）F-----米糠蛋白换算系数5.95方法二：采用甲醛滴定法。

水解度（%）=（水解后生成的氨基氮的量/样品中总氮含量）X 100%（1）粗蛋白含量的测定：采用凯氏定氮法。

（2）氨基氮的测定氨基酸含有氨基和埃基，具有两性，加入甲醛与氨基酸中的氨基作用，可消除其碱性，使埃基显示出酸性，用氢氧化钠标准溶液滴定，即可对氨基酸进行定量。

1、酚猷指示剂：0.5g酚猷溶丁100ml 50%的乙醇中2、中性甲醛溶液：甲醛溶液（36-37%,分析纯）50ml，加入0.5%的酚猷指示剂约3ml，滴加0.1mol / L NaOH使溶液显微粉色，储存丁棕色瓶中，临用前配制。

具体方法如下：分别吸取2mL不同水解度的水解液丁烧杯中加蒸僻水5mL,向烧杯中加入5滴酚猷指示剂，混合后加中性甲醛溶液 2.0ml再混合，用0.1mol /L NaOH滴定显微粉色。

超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母代谢的影响

超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物对酿酒酵母代谢的影响赵海锋;卢敏;周永婧;阳辉蓉;孟赫诚【摘要】By a 20°P very high gravity brewing,the effects of the degree of hydrolysis(DH)and the amount of wheat gluten protein hydrolysates onthe growth and fermentation performance of brewer's yeast were investigated. The results show that,after a 24 h hydrolysis, the hydrolysates have the greatest DH, which is 22.4%, and they exhibit the best promoting effect on the growth of brewer's yeast,and that,the wort supplemented with 1.0%wheat gluten protein hydrolysates shows a significant effect on the growth and fermentation of brewer's yeast,specifically, the yeast biomass accumulation,the utilization rate of free amino nitrogen and the ethanol production are improved by 4.6%,41.2%and 15.2%, respectively.The conclusions indicate that the wheat gluten protein hydrolysates can be used as effective nitrogen for the growth and fermentation of brewer's yeast during the 20°P very high gravity brewing.%在20°P超高浓麦汁发酵中,研究了小麦面筋蛋白水解物的水解度和添加量对酿酒酵母生长和发酵性能的影响.结果表明:酶解24 h,水解物达到最大水解度22.4%,其对酵母的促生长效果最好;向超高浓麦汁中补充1.0%的水解物可使酵母净增长量提高4.6%,氨基氮利用率提高41.2%,乙醇产量提高15.2%,作用效果显著.这说明小麦面筋蛋白水解物是超高浓麦汁发酵中酵母同化和代谢的有效氮源.【期刊名称】《华南理工大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2017(045)012【总页数】6页(P14-19)【关键词】小麦面筋蛋白水解物;酿酒酵母;超高浓酿造;生长代谢【作者】赵海锋;卢敏;周永婧;阳辉蓉;孟赫诚【作者单位】华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州510640;华南理工大学食品科学与工程学院,广东广州510640【正文语种】中文【中图分类】TS261.1啤酒是一种低酒精度发酵酒,含有各种营养物质,成分均衡,适度饮用有益于健康[1- 2].传统的啤酒酿造是常浓酿造,现在的啤酒生产企业则主要采用高辅料酿造和高浓酿造技术[3].高浓酿造技术的应用可以降低生产成本、提高设备利用率,改善啤酒风味，但同时也会产生一系列的问题,例如高渗透压、高酒精毒性会使酵母的生长代谢受到影响,营养物质的缺乏(主要是氮源)会阻碍酵母的生长,使发酵延缓甚至停滞,从而影响啤酒发酵[4].而在提高酵母生长代谢和发酵效率的各种方法中,氮源补充被认为是最有效的方式.Vu等[5]发现添加0.25%的酵母抽提物和0.8%的吐温80可以缩短发酵时间和提高乙醇产量.Kitagawa等[6]证实了大豆肽的添加可以提高酵母的抗冻压力,使得酵母更能忍受低温环境,但是大豆肽影响酵母生长代谢的机制还不明确.Kemsawasd等[7]发现氮源对酵母生长代谢的影响是有菌株特异性的,不同酵母影响也不同.文中研究了超高浓酿造中小麦面筋蛋白水解物的水解度和添加量对酿酒酵母生长和发酵性能的影响,以期探讨酿酒酵母对小分子肽的吸收和代谢机制,并拓展小麦面筋蛋白的应用范围.1 材料与方法1.1 实验材料酿酒酵母(Saccharomyces pastorianus) FBY0095，华南理工大学食品生物技术研究室保藏;小麦面筋蛋白(蛋白含量76.1%)，安徽瑞福祥食品有限公司提供;胰酶(酶活力2.7×107 U/g)，重庆市全新祥盛生物制药有限公司提供;大麦芽、60 °P高浓麦葡糖浆,广州珠江啤酒有限公司提供;其他试剂均为分析纯.冷冻离心机,3-18K,德国Sigma公司出品;全自动糖化仪,杭州博日科技有限公司出品;高效液相色谱仪,Waters2695,美国Waters公司出品;低温培养箱,LRN-250CL,上海一恒科技有限公司出品;紫外分光光度计,UV-721,上海精密科学仪器仪表有限公司出品.1.2 实验方法小麦面筋蛋白水解物的制备:参照万春艳[8]制备大豆分离蛋白水解物的方法并加以改进,其中蛋白与水配比为1∶10(质量体积比(g/mL)),调pH至9.0,胰酶添加量为蛋白质量的1%.麦汁制备、酵母活化和扩培:参照万春艳等[9- 11]的方法,使20 °P麦汁的游离氨基氮(FAN)的含量控制在180 mg/L.酵母发酵:将不同酶解时间的水解物分别添加至麦芽汁培养基中作为实验组,不添加水解物的作为空白对照组(CK),调pH至5.5，高压灭菌后,按每升培养基6.8 g酵母泥接入扩培后的酵母,在12 ℃的培养箱发酵,厌氧,隔天摇瓶.1.3 分析方法1.3.1 水解度(DH)测定参照王剑锋等[12- 14]的水解度测定方法测水解度.1.3.2 酵母增殖和发酵性能指标测定参照宗绪岩等[15- 16]的发酵过程各指标测定方法测量乙醇、表观发酵度、发酵液降糖、生物量等.1.3.3 游离氨基氮的测定采用茚三酮比色法,样液稀释100至200倍,在1、2号玻璃试管中加入2 mL的蒸馏水,2、4号试管中加入2 mL甘氨酸标准液,其余试管则加入稀释后的样液,然后各试管中加入1 mL的发色剂,加玻璃珠,盖上螺帽,将试管放于沸水浴中,精确反应16 min,在20 ℃的水浴中冷却20 min,再各加入稀释剂5 mL,充分混匀.用空白液管(1、2 号试管)调节分光光度计零点,于570 nm 下测定吸光值,尽量在30 min内测完. FAN含量(mg/L)=样液吸光值×2(mg/L)×稀释倍数/甘氨酸标准液的吸光值FAN含量消耗率(%)=(FAN初始量-FAN最终量)/FAN初始量×100%称取0.107 2 g甘氨酸用水溶解,定容至100 mL,从中取1 mL用水稀释至100 mL,即为甘氨酸标准液,游离氨基酸质量浓度为2 g/L.发色剂的制备：取10.0 g Na2HPO4·12H2O、6.0 g KH2PO4、0.5 g茚三酮、0.3 g果糖溶于 100 mL 去离子水.稀释剂的制备：称取碘酸钾2 g溶于600 mL水中,加入96%(体积分数)乙醇400 mL.1.3.4 小麦面筋蛋白水解物分子量分布的测定高效液相色谱法,参照莫芬等[17]的方法测定.色谱柱：TSK gel 2000SXL凝胶柱，7.8 mm×300 mm；预柱：C18；柱温：30 ℃.流动相：100%磷酸盐缓冲液(pH 7.2);流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；洗脱时间：20 min.检测波长：214 nm.1.3.5 数据处理实验数据以3次平行实验的平均值作为最终结果，用Origin 8.0和Excel 软件数据作图处理,利用SPSS 17.0 软件对数据进行差异显著性检验分析，以P<0.05为差异显著.2 结果与讨论2.1 小麦面筋蛋白胰酶酶解过程中水解度的变化小麦面筋蛋白可以被不同种类的蛋白酶酶解得到水解物,前期的研究发现[18],胰酶处理过的小麦面筋蛋白水解物具有良好的生理活性,所以文中选择胰酶水解小麦面筋蛋白.酶解过程中水解度的变化如图1所示.酶解的36 h内,水解度在6.8%～22.4%之间变化.前24 h随着时间的增加水解度不断增大,在24 h时水解度达到了22.4%,但是在24～36 h间水解度基本趋于稳定,酶解36 h时水解度为21.7%.随着反应的进行底物浓度变小,可以被胰酶水解的肽键数目逐渐减少,同时酶活力也逐渐下降,因此随着时间的延长,在24～36 h之间水解度并无显著变化.不同字母表示数据间存在显著性差异图1 胰酶水解小麦面筋蛋白过程中水解度的变化Fig.1 Changes in degree of hydrolysis of wheat gluten protein treated by pancreatic enzymes不同水解度的酶解液中肽的分子量分布也不同,结果如表1所示.随着水解度的增大,各水解物中10 ku的大分子肽类物质逐渐减少,被水解成小分子肽或氨基酸,3 ku以下的多肽则逐渐增加,所占比例最多,从最初的32.8%到最终的62.7%.水解度为22.4%的酶解液中小分子肽最多,而酶解至36 h时,水解度和小分子肽含量均未进一步增大和提高.表1 不同DH的水解物中肽的分子量分布Table 1 Molecular weight distribution of hydrolysates with different DH水解物编号DH/%基于分子量的肽的分布/%>10ku5～10ku3～5ku<3kuWG26.7923.7621.4022.0232.82WG49.0411.4218.8225.0844.68WG8 12.326.1315.7626.7551.36WG1215.744.3513.8926.8754.89WG2422.451.749.4826.0762.71WG3621.731.869.8126.0262.312.2 不同水解度的小麦面筋蛋白水解物对酵母生长的影响将不同水解度的酶解物以1%的量添加到20 °P的超高浓麦汁中进行酵母发酵,观察其对酵母生长和活性的影响,结果见图2.水解度在6.8%～22.4%之间时,随着水解度的增大,酵母净增长量也增大,水解度22.4%组的酵母细胞净增长量为6.0 g/L,达到最大值,说明酶解物的促酵母生长作用与其水解度有一定的相关性.发酵结束后,发酵液中酵母活性均保持在85%以上,其中WG24组的酵母活性明显高于其他组,达到94.8%.不同字母表示数据间存在显著性差异图2 不同DH的小麦面筋蛋白水解物对酵母增殖和活性的影响Fig.2 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different DH on the proliferation and viability of brewer’s yeast小麦面筋蛋白水解后的主要物质是肽类物质,而肽类物质的生理活性与其分子量的大小有关.小麦面筋蛋白水解物中3 ku以下的多肽所占比例最多,说明对促进酵母生长起主导作用的是小分子肽,与以往研究得出的结论一致.已有研究证实了有生理活性的主要是小分子肽,Zhao等[19]发现3 ku以下的大豆肽能显著促进酵母细胞的生长与代谢.张清丽[20]发现3 ku以下的酪蛋白活性肽对乳酸菌的生长代谢及乳酸发酵有很好的促进作用.以上结果说明，水解度为22.4%的小麦面筋蛋白酶解物的促酵母生长效果最好,因此最佳的酶解时间为24 h.2.3 小麦面筋蛋白水解物(WG24)添加量对酵母生长代谢的影响将酶解24 h得到的小麦面筋蛋白水解物以不同的量添加至培养基中，观察酵母的生长代谢.从图3中的生物量曲线图可以看出,酵母生长经过了延滞期和对数期后第8天生物量达到最大,经过了两天的稳定期后进入了衰亡期,细胞逐渐自溶,生物量降低.在第23天时最大生物量的WG1.0%组为6.4 g/L,对照组生物量最少为5.5g/L,4组样的最大净增长量与最大生物量结果一致,均为WG1.0%组>WG2.0%组>WG0.1%组>对照组,相比之下,添加1.0%的水解物对酵母的促生长效果最好.这印证了上面的实验结果,即水解物的添加可以促进酵母生长,但是其促进作用并不总随着水解物添加量的增大而增加,过多的水解物在一定程度上会抑制酵母细胞的生长,抑制原因尚待进一步探究.图3 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母增殖的影响Fig.3 Effect of wheat gluten protein hydrolysates with different amounts on proliferation of brewer’s yeast2.4 小麦面筋蛋白水解物添加量对酵母发酵性能的影响游离氨基氮(FAN)是麦汁中能够被酵母直接利用的含氮物质,主要是游离氨基酸和铵离子以及小分子肽(二肽和三肽),酵母的生长代谢伴随着氮源的吸收利用[21].从图4可知,20 °P的超高浓麦汁最初FAN含量是180 mg/L左右,添加不同量的小麦面筋蛋白水解物(WG24)后,FAN含量均有不同程度提高,WG0.1%组的最初FAN是200 mg/L,而WG1.0%和WG2.0%组的FAN含量分别是390和580 mg/L,充足的氮源可以保证酵母细胞的快速生长,从而有利于啤酒的发酵.在发酵前12 d,酵母细胞大量生长繁殖,伴随着氮源物质的大量消耗,而前2 d的FAN下降速度相对较快,12 d之后,FAN含量又有小幅度的上升,然后趋于平稳.这是因为随着发酵的进行,在后期由于乙醇的大量产生和其他产物的积累,对细胞产生了毒害作用,从而使其自溶,胞内的氮类物质进入发酵液中,FAN含量小幅地上升[22].发酵结束后,各组残留FAN含量不同,并不是所有的氮源都能被吸收利用,有些多肽类氮源要用于稳定啤酒的泡沫和多肽类复杂物质的代谢合成[23].各组的FAN利用率分别是71%、60%、47%和41%,说明初始FAN含量越低,利用量越少,但是利用率却越高.WG1.0%组添加了水解物后FAN含量比对照组增加了200 mg/L,结束时FAN消耗比对照组多50 mg/L,说明水解物在高浓麦汁中能被酵母有效的利用25%,WG2.0%组也有同样的结果.图4 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母发酵利用FAN的影响Fig.4 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on FAN utilization rate of brewer’s yeast在酿酒酵母生长代谢的过程中不仅有氮源物质的消耗吸收,同时也伴随着糖的吸收利用,如图5所示.在20 °P的超高浓麦汁发酵中,4组最初的糖度基本一致,随着酵母的生长繁殖,营养物质被消耗,在前4天,4组的降糖速率差距不大,而从第4天到第12天之间,各自的耗糖速度出现差异,WG2.0%组最慢,发酵12天之后,酵母停止生长,糖度基本保持稳定.此时,WG1.0%组的表观发酵度达到了84%,WG0.1%组的发酵度则是82%左右,对照组也发酵结束,达到了80%,但是WG2.0%组却只有76%,氮源的充足可以使酵母快速生长繁殖,大量消耗营养物质,但是过量的氮源在某种程度上又会抑制酵母的生长,所以氮源的适量补充是很有必要的.图5 小麦面筋蛋白水解物添加量对酿酒酵母降糖的影响Fig.5 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts on sugar consumption of brewer’s yeast酵母细胞吸收氮源和糖类以及其他营养物质的过程中,一部分用于自身的繁殖,另一部分则用于乙醇以及其他高级醇和酯类等风味物质的合成.发酵过程中的乙醇含量如图6所示,在酵母生长的前12 d内,乙醇含量逐渐增加,之后发酵结束,乙醇含量保持恒定.在乙醇生成的整个过程中,WG1.0%组的乙图6 小麦面筋蛋白水解物的添加量对酿酒酵母乙醇生成的影响Fig.6 Effects of wheat gluten hydrolysate with different amounts onethanol yield of brewer’s yeast醇含量始终是4组中最高的,达7.6%之多,比乙醇含量最少的对照组提高了15%,而WG0.1%和WG2.0%组的乙醇含量相对于对照组也有一定的提高.综合以上结果,可以得出小麦面筋蛋白水解物的最适添加量为1.0%(见表3).这进一步说明了小麦蛋白水解物在超高浓度麦汁中能够有效促进酿酒酵母的生长和发酵,是啤酒酿造的一种有效氮源.表3 添加1.0%的小麦蛋白水解物对酿酒酵母发酵性能的影响Table 3 Effects of 1.0% wheat gluten hydrolysates on fermentation performance of brewer’s yeast项目发酵周期/d净增长量/(g·L-1)表观发酵度/%终残糖/°PFAN利用量/(mg·L-1)乙醇产量/%对照组125.81803.72131.06.6WG1.0%126.08843.02185.07.6变化率/%04.6523.2041.215.23 结语小麦面筋蛋白水解物在20 °P的超高浓麦汁中对酿酒酵母的增殖、活性保持以及发酵代谢具有促进作用,在啤酒发酵中可作为酵母的有效氮源.胰酶处理小麦面筋蛋白时,其中水解度达22.4%的水解物添加量为1.0%时对酵母的促进效果最佳,可使酵母活性达94.8%,残糖量降低23.2%,乙醇产量提高15.2%.文中的研究明确了小麦面筋蛋白水解物对于提高酵母生长和发酵性能的作用,在啤酒生产中有潜在的应用价值和指导意义.参考文献：[1] 杨静静,钟俊辉,杜绿君,等.啤酒与健康 [J].啤酒科技,2016(1):14- 25.YANG Jing-jing,ZHONG Jun-hui,DU Lü-jun,et al.Beer and health [J].Beer Science and Technology,2016(1):14- 25.[2] TIAN J.Determination of several flavours 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