细胞转染
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧
细胞转染的原理操作步骤以及小技巧细胞转染是一种将外源DNA、RNA、蛋白质等分子导入到细胞内的实验技术。
这种技术可以用来研究基因功能、发现新的信号通路和治疗基因疾病等。
下面将介绍细胞转染的原理、操作步骤以及一些小技巧。
一、细胞转染的原理：细胞转染主要通过三种方法实现：物理法、化学法和生物学法。
1.物理法：通过高压、电穿孔、微射流等方式，使细胞膜发生瞬时破裂，从而使DNA、RNA等外源分子进入细胞。
常用的物理法有电穿孔法和基因枪法。
2.化学法：通过化学物质，如聚吡咯、脂质体等，使外源分子与细胞膜结合，从而实现转染。
常用的化学法有聚乙烯亚胺（PEI）法、磷酸钙共沉淀法等。
3.生物学法：通过利用病毒载体将外源基因导入目标细胞，实现基因的转移。
常用的生物学法有腺相关病毒（AAV）转染、逆转录病毒（RETRO）转染等。
二、细胞转染的操作步骤：1.细胞的预处理：根据细胞类型和实验要求，将细胞培养至合适的状态。
通常细胞应处于快速生长期，但还未达到接触抑制的阶段。
对于一些特定的细胞，如悬浮细胞，可能需要将其转接至适当的培养基中。
2.外源分子的准备：将外源DNA、RNA等转染载体制备好。
如将DNA克隆并纯化至高质量的质粒DNA，或将RNA合成或纯化。
根据实验要求选择合适的转染载体。
3.转染方法的选择：根据实验要求选择合适的转染方法，如物理法、化学法或生物学法。
一般情况下，物理法适用于悬浮细胞，化学法适用于贴壁细胞，而生物学法适用于大多数细胞类型。
4.细胞转染操作：a.物理法：i.电穿孔法：将细胞悬浮于含有外源分子的缓冲液中，然后通过电穿孔仪的电极或电穿孔板进行电穿孔。
ii. 基因枪法：使用基因枪将外源分子直接“枪”入目标细胞中。
b.化学法：i.PEI法：将PEI与外源DNA或RNA按一定比例混合，在适当条件下形成复合物，然后添加至目标细胞中。
ii. 磷酸钙共沉淀法：将外源DNA与磷酸钙按比例混合，并静置形成磷酸钙- DNA沉淀，然后加入至目标细胞中。
常规细胞转染过程和常见问题
实验过程（以24孔板为例）
1.提前一天细胞铺板
提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞密度在60％左右为宜。
2.转染过程
⑴将0.8μg的DNA用25μl无血清稀释液稀释，充分混匀，制成DNA稀释液。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
⑵将2μl的Entranster TM试剂用25μl无血清稀释液体稀释，充分混匀，制成
Entranster TM试剂稀释液。
室温静置5分钟。
⑶将Entranster TM试剂稀释液分别加入到DNA稀释液中，充分混匀（可用振
荡器振荡或用加样器吹吸10次以上），室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
⑷将转染复合物加入到含细胞和完全培养基的培养容器上，轻柔混匀。
注意：①转染试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
②完全培养基可加抗生素。
⑸培养4-6小时后更换培养基，继续培养24-48小时。
注意：①如细胞没有毒性等不良情况，转染后4-6小时可不必更换培养基。
注意：如用于同时共转染多种质粒，DNA的用量指每种质粒用量的总和，这时如需得到较高转染效率，建议将DNA的用量和转染试剂的用量同步提高1.5-2倍。
常见问题与解决方案。
细胞转染的技巧
细胞转染的技巧细胞转染是研究细胞分子生物学的关键技术之一，广泛应用于基因表达、基因敲除和功能分析等领域。
本文将详细介绍细胞转染的原理、方法和优化技巧。
细胞转染的原理主要基于外源DNA的纳入细胞内，并表达目的基因。
目前常用的转染方法包括化学法、电穿孔法、病毒介导法和基因枪法等。
一、化学法化学法是最常用的细胞转染方法之一，其基本原理是通过化学试剂破坏细胞膜屏障，使外源DNA能够进入细胞内。
常用的转染试剂包括聚乙烯亚胺（Polyethylenimine, PEI）、脂质体和阳离子聚合物等。
在化学转染过程中，需要注意以下几个关键环节：1. 细胞密度：化学转染对细胞密度有一定的要求，通常细胞密度应保持在80%~90%的对数生长期，以保证转染效果。
2. 转染试剂的浓度和比例：不同的转染试剂适用于不同的细胞系，需要根据实验需求进行优化。
一般情况下，转染试剂的浓度和DNA的比例为1:3~6。
3. 转染时间和转染条件：化学转染的时间和条件也需要进行优化。
过短的转染时间会导致转染效率低，而过长的转染时间可能会对细胞造成毒性影响。
二、电穿孔法电穿孔法通过电场脉冲的作用使细胞膜发生短暂的孔洞形成，从而实现外源DNA的转染。
电穿孔法具有转染效率高、转染速度快等优点，但对细胞需求较高，且操作较为繁琐。
在电穿孔转染过程中，需要注意以下几个环节：1. 电脉冲的参数：电脉冲参数包括电压、脉冲宽度和脉冲数等，需要根据细胞类型和实验需求进行优化。
2. 转染缓冲液的配方：转染缓冲液通常包含含有机磷盐的缓冲液或无机盐溶液，可用于增加细胞的导电性和缓解电穿孔过程中对细胞的损伤。
3. 转染后的细胞培养：电穿孔转染后，应及时将细胞转移到无血清培养基中，以减少电穿孔对细胞的影响。
三、病毒介导法病毒介导法是一种高效、稳定的转染方法，常用于长期表达和基因敲除实验。
病毒载体（如腺病毒、逆转录病毒等）可携带外源DNA进入细胞并整合到基因组中，从而实现目的基因的表达。
细胞转染操作方法
细胞转染操作方法一、细胞转染简介细胞转染是指将外源性DNA、RNA、蛋白质等分子通过物理或化学手段导入到细胞内，从而改变细胞的基因表达或功能。
常见的细胞转染方法包括病毒载体介导转染、电穿孔法、钙磷共沉淀法和化学转染法等。
其中，化学转染法是最为常用的方法之一，因为它具有操作简便、成本低廉和适用于多种类型的细胞等优点。
二、实验前准备1. 细胞培养：选择适当的培养基和培养条件，使得细胞处于生长状态。
2. 转染试剂：选择合适的化学转染试剂，如Lipofectamine 2000、PolyJet等。
3. 质粒DNA：准备所需的质粒DNA，并进行纯化和测定浓度。
4. 培养皿：准备适当大小和形状的培养皿，以满足实验需要。
5. 显微镜：准备显微镜以观察细胞转染效果。
三、实验步骤1. 细胞接种：将需要转染的细胞接种到培养皿中，使其达到适当的生长状态。
2. 质粒DNA和化学转染试剂混合：根据试剂说明书的建议，将质粒DNA和化学转染试剂混合，形成转染复合物。
3. 转染复合物与细胞接触：将转染复合物滴加到培养皿中，让其与细胞接触。
4. 培养：将培养皿放入恰当的培养箱中，并按照所选细胞类型的要求进行培养。
5. 观察效果：经过适当时间后，使用显微镜观察细胞转染效果。
若需要，可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
四、注意事项1. 选择适当的化学转染试剂，并按照说明书建议操作。
2. 转染前需要保证质粒DNA纯度和浓度足够，并进行必要的测定。
3. 细胞密度和培养时间应根据所选细胞类型进行调整。
4. 转染复合物与细胞接触时间不宜过长或过短，一般在4-6小时左右。
5. 培养过程中需要注意细胞状态的变化，并根据需要进行适当的处理。
五、实验结果解读通过细胞转染操作，可以实现外源性DNA、RNA、蛋白质等分子的导入，从而改变细胞的基因表达或功能。
实验结果可以通过Western blot、PCR等方法进行进一步验证。
质粒转化、细胞转染步骤
质粒转化、细胞转染步骤
转化是指将外源DNA（常以质粒作为载体）导入受体细
胞（如大肠杆菌），从而使其获得新的遗传特性。
具体步骤如下：首先将12ul的质粒DNA加入50ul感受态cell中，轻柔混合后进行冰浴30min。
接着向管中加入培养基，混匀后使细菌
恢复正常生长状态。
然后在42℃下热激90s，迅速冰浴2min，最后在37℃下震荡培养（﹤225rpm）1h，使细菌获得新的遗
传特性。
转染（n）是将含有目的基因的载体转移到真核细胞内的
过程。
在进行质粒转染时，需要先将6-well-plate中的每个孔
培养至60-70%的状态。
然后在接种时每个孔加入2.5×105个
/ml的细胞。
接下来，将2.5ug质粒DNA和200ul的opti-
MEM混合，再加入6ul的转染液进行混匀，并在室温下静置
15min。
待转染细胞换成1.3ml的opti-MEM培养基后，将转
染复合物（200ul）轻轻均匀滴入细胞培养基中，并十字形摇
晃6-well-plate以混匀转染复合物。
最后将6-well-plate放入37℃、CO2培养箱中进行培养。
细胞转染
• •
•
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。 没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
选择转染策略？
定因素是实验的时间范围和最终目标。
瞬时转染细胞一般在转染后24–96小时收集，常用于研 究基因或基因产物的短期表达效应，执行RNA干扰(RNAi)介可以更快速地提供结果；因为mRNA在胞浆中表达，无需 转移到细胞核，无需转录，转染数分钟后即可在部分系统 中表达转染mRNA。
• 使用选择性培养基培养时，未转染的细胞或瞬时转染 细胞都将会死亡，而表达一定水平的抗生素抗性基因 或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。选择标 记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性 试剂通常会杀死生物体或干扰其生长。 • 亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。用于转染 子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的 细胞。
相比之下，当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个 实验中使用时，则更多地选择稳定转染。由于将DNA载体整 合至染色体中的概率较低，因此细胞的稳定转染更麻烦、 更具挑战性，需要选择性筛选和克隆分离。因此，稳定转 染通常用于大规模的蛋白质生产、长期药理学研究、基因 治疗或长期基因调控机制研究。
三、转染的技术
2.转染的应用 • 基因表达
转染最常通过使用质粒载体在培养细胞(或动物 模型)中表达目的蛋白。另外，将带有可检测的标 记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子 和增强子序列或蛋白间相互作用的研究。
• 基因抑制
转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑 制特定蛋白质的表达。
细胞转染的原理
细胞转染的原理一、细胞转染的基本概念细胞转染是指将外源性DNA或RNA等物质导入到细胞内，以达到改变细胞基因表达或功能的目的。
它是生物学研究中常用的技术手段之一，广泛应用于基因治疗、药物筛选和基因功能研究等领域。
二、细胞转染的方法1. 化学法：通过化学试剂（如聚乙烯醇、离子脂质体等）将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法简单易行，但毒性较大且效率不高。
2. 物理法：通过机械冲击（如电穿孔）、高压注射、微注射等方式将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率较高，但操作复杂且对细胞有一定伤害。
3. 病毒载体法：利用病毒作为载体将DNA或RNA导入到细胞内。
这种方法效率高，但存在安全隐患和限制性较大。
三、化学法转染原理1. 离子脂质体介导转染离子脂质体是由阳离子表面活性剂和阴离子脂质组成的复合物，具有良好的生物相容性和可生物降解性。
在转染过程中，DNA或RNA与离子脂质体形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
此外，离子脂质体还能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，提高转染效率。
2. 聚乙烯醇介导转染聚乙烯醇（PEI）是一种阳离子聚合物，在水中能形成稳定的颗粒。
在转染过程中，PEI与DNA或RNA形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合并进入细胞内。
PEI不仅能促进细胞内吞作用和溶酶体逃逸，还能与核糖体结合并促进基因表达。
四、化学法转染优缺点1. 优点：简单易行、操作方便、不需要专门设备。
2. 缺点：毒性较大、效率低、对不同类型的细胞有一定限制。
五、物理法转染原理1. 电穿孔法电穿孔法利用电场作用使细胞膜通透，形成微小孔道，从而将DNA或RNA导入到细胞内。
电穿孔法的优点是操作简单、效率高，但缺点是对细胞有一定伤害。
2. 高压注射法高压注射法是通过高压气流将DNA或RNA直接注入到细胞内。
这种方法效率高，但对细胞有较大的伤害。
3. 微注射法微注射法是在显微镜下使用微针将DNA或RNA直接注入到单个细胞内。
细胞转染修订版
细胞转染准备：1．无抗生素培养基2．Opti－MEM ⅠReduced Serum Medium3．全培养基1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。
悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）2.1、制备质粒脂质体混合物，OPTI-MEM！1．将质粒溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；2．将脂质体溶于50 ul opti-mem 中，混匀室温静置5分钟；3．将两者混匀，室温静置5分钟（可能出现雾状沉淀，复合物在室温下六小时内稳定）。
2.2、加入培养皿中，温柔混匀；可在6小时后更换全培养基。
2.5、培养18－48个小时后，测量转染效率。
注：如有必要，转染前可用无抗生素无血清培养基。
细胞转染1、转染前细胞的处理（以35mm 培养皿为例）：贴壁细胞：在转染前一天，在35mm 培养皿中加入2 ml 无抗生素培养基培养一天，到转染时使细胞达到80％～90％的汇合率。
悬浮细胞:在制备混合物前，将4—8×105细胞用无抗生素培养基培养铺35mm 培养皿2、转染方法（以质粒DNA转染为例）A. 转染贴壁细胞（35 mm培养皿或6孔培养板）1. 对于每一个转染样本，按如下比例配制转染混合液：2.5 μg 质粒DNA7.5 μL GeneTranx μL 无血清DMEM（或其他无血清培养基, PBS,PBS）总体积100 μL2.用枪头吹打混匀，放置于室温20-40min。
3. 将混合液加入细胞培养皿中，晃动培养皿混匀培养液。
放入CO2培养箱。
注：血清浓度对于转染效果无影响，经测试高达20%的胎牛血清浓度也不会对转染效果产生影响。
4. 在转染后的18-48小时之间，对细胞进行换液。
细胞转染
磷酸钙法
即磷酸钙共沉淀转染法，先将DNA和氯化钙混合， 然后加入到PBS中慢慢形成DNA磷酸钙沉淀，最 后把含有沉沉淀的混悬液加到培养的细胞上， 通过细胞胞膜的内吞作用摄入DNA。磷酸钙似乎 还通过抑制血清中和细胞内的核酸酶活性而保 护外源DNA免受降解。
磷酸钙法
核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式出现时，可 使DNA附在细胞表面，利于细胞吞入摄取，或通 过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内， 进入细胞的DNA仅有1%～5%可以进入细胞核中， 其中仅有不到1%的DNA可以与细胞DNA整合，在 细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为 10-4，这项技术能用于任何DNA导入哺乳类动物 进行暂时性表达或长期转化的研究。此方法对 于贴壁细胞转染是最常用并首选的方法。
脂质体转染法
阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸 根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成 DNA脂复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附， 再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染法
脂质体转染法
1. 脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养 细胞，可用于瞬时转染和稳定转染。 2. 转染效率高，比磷酸钙法高5-100倍。 3. 能够把DNA和RNA转染到各种细胞。 4. 转染的稳定性好，可重复性高。 5. 转染时最好不加血清和抗生素。 6. 阳离子脂质体细胞毒性相对较高，对部分细胞可 能会干扰细胞的代谢。由于脂质体对细胞有一定 的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。 7. 常用细胞类型：cos-7 、BHK、NIH3T3 、Hela等。
理想的细胞转染
转染效率高，不影响细胞正常生理活动 细胞毒性 重复性好 安全 方法简单 省时、经济
报告基因
细胞转染实验
细胞转染实验简介细胞转染是一种将外源基因或荧光探针引入细胞的技术，用于研究基因功能、蛋白质表达以及信号通路等。
本文将为您介绍细胞转染实验的基本原理、实验步骤以及常见注意事项。
基本原理细胞转染是一种通过改变细胞外液环境，使细胞吸收外源基因或荧光探针的技术。
转染可采用多种方式实现，包括化学转染、电转染、病毒转染等。
不同的转染方法适用于不同类型的细胞和研究目的。
在化学转染中，常用的转染试剂有脂质体和阳离子聚合物。
脂质体是由磷脂和胆固醇组成的小囊泡，可以包裹外源基因形成脂质体-基因复合物。
阳离子聚合物是带正电荷的聚合物，可以和DNA形成复合体进入细胞。
电转染是利用高压脉冲将DNA导入细胞。
通常使用电穿孔仪产生的短暂高压电场，使细胞膜通透性增加，从而使DNA进入细胞。
病毒转染是将外源基因植入病毒载体中，通过感染细胞，使外源基因整合到细胞染色体中。
实验步骤1. 准备细胞选择合适的细胞系进行转染实验。
不同细胞系对转染方法和试剂的适应性有所差异。
常见细胞系如293T、HeLa、CHO 等。
2. 培养细胞将选定的细胞系按照相应的培养条件在细胞培养皿中培养至达到合适的密度，一般为70-90%的密度。
细胞应确保处于快速生长期，以提高转染效率。
3. 转染试剂的选择根据实验的需要选择合适的转染试剂。
常见的转染试剂有脂质体试剂（如Lipofectamine™）和阳离子聚合物试剂（如PolyJet™）。
4. 转染实验操作将所需的转染试剂加入适量的培养基中，并充分混合。
注意避免产生气泡，以免影响转染效率。
将转染试剂溶液缓慢滴加到含有细胞的培养皿中。
5. 恢复培养条件将含有转染试剂的培养皿置于恢复培养条件下，通常为37℃、5% CO2的培养箱中。
细胞需要一定时间来恢复并表达外源基因。
6. 分析转染效率通过荧光显微镜观察细胞是否发出荧光信号。
如果转染的是荧光探针，则直接观察细胞是否发出特定颜色的荧光。
如果转染的是外源基因，则需要进一步通过PCR或Western blot 等技术来验证外源基因是否成功表达。
细胞转染 Protocol
细胞转染是一种常用的生物技术，用于将外源基因或药物引入细胞中。
下面是细胞转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理细胞转染是利用细胞膜的通透性，将带有特定基因或药物的载体分子导入细胞内。
常用的载体分子包括病毒载体和非病毒载体。
病毒载体如腺病毒、逆转录病毒等，能将外源基因高效地导入细胞中，但可能对细胞产生一定毒性。
非病毒载体如脂质体、阳离子聚合物等，相对安全，但导入效率较低。
通过细胞转染，可以实现对基因的表达调控，探索基因功能和药物筛选等研究。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
o转染试剂：如Lipofectamine、Effectene等，用于细胞转染。
o DNA或RNA：携带目的基因的质粒或寡核苷酸。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于细胞转染后洗涤和离心。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
四、准备工作1.仔细阅读实验步骤和注意事项，了解所需的试剂和耗材及其使用方法。
2.准备好所需的试剂和耗材，并确保它们处于保质期内。
3.检查实验室内是否具备上述实验仪器，并确保其正常运行。
4.用70%乙醇擦拭实验台面，以确保无菌环境。
5.用高压蒸汽灭菌法灭菌所有的实验器具，包括离心管、移液器等，需在适当的压力和温度下进行灭菌处理，以消除所有潜在的污染源。
细胞转染原理
细胞转染原理细胞转染是指将外源DNA或RNA导入到细胞内的过程，以实现对细胞进行基因表达或功能调控的研究。
在细胞转染中，常用的方法包括转染剂介导转染、电穿孔转染和病毒载体介导转染等。
转染剂介导转染是最常用的细胞转染方法之一。
转染剂可以与外源DNA或RNA形成复合物，通过与细胞膜结合，将外源DNA或RNA送入细胞内。
转染剂通常为阳离子型表面活性剂，例如聚乳酸-聚赖氨酸共聚物（PLL-PLA）、聚乳酸-聚乙二醇共聚物（PLL-PEG）等。
这些阳离子型表面活性剂可以与带负电的DNA或RNA结合，形成带正电的复合物，利用细胞膜上负电荷的磷脂头基与阳离子复合物结合，实现DNA或RNA 的转染。
电穿孔转染是通过短暂应用高压电脉冲来创建细胞膜上的微小孔道，以便外源DNA或RNA能够进入细胞内。
这种方法利用电场脉冲造成细胞膜的破裂和微小孔道的形成，称为电穿孔。
电穿孔方法可以有效地将外源DNA或RNA导入细胞质，但由于电穿孔对细胞的生存性有一定的损伤，因此应注意控制电场强度和脉冲长度，以及适当的电穿孔时间。
病毒载体介导转染是一种专门利用改造后的病毒作为载体将外源DNA或RNA导入细胞内的方法。
常用的病毒载体包括腺病毒（Adenovirus）、衣藻病毒（Chlorella virus）和慢病毒（Lentivirus）等。
这些病毒载体经过改造可以将外源DNA或RNA插入其基因组中，并通过感染细胞实现外源基因的表达。
病毒载体介导转染的优点是高效、特异性强，但也存在着生物安全性和病毒免疫应答的问题。
除了上述方法外，还存在其他一些基于特殊原理的转染方法，如快速制备亲和复合物介导转染、脂质体介导转染、基因枪介导转染等。
这些方法在特定的实验条件下使用，并根据不同的研究需要选择适合的转染方法。
细胞转染技术的发展为基因治疗、基因表达研究和细胞功能研究等领域提供了重要的实验手段。
不同的转染方法适用于不同类型的细胞和外源DNA或RNA的特性，研究人员可以根据实际需求选择适合的细胞转染方法，以实现理想的转染效果。
详细描述细胞转染步骤
详细描述细胞转染步骤细胞转染是指将外源DNA或RNA引入细胞内，使其表达或干扰靶基因的过程。
该技术在基因工程、药物筛选和疾病研究中发挥着重要作用。
下面将详细介绍细胞转染的步骤。
1. 细胞培养准备在进行细胞转染之前，首先需要准备好细胞培养基和细胞。
常用的细胞包括哺乳动物细胞（如HEK293细胞、HeLa细胞等）和昆虫细胞（如Sf9细胞、S2细胞等）。
细胞应保持在良好的生长状态，通常需要在无菌条件下培养，并在适当的培养基中维持其生长。
2. DNA/RNA准备在进行细胞转染之前，需要准备好要转染的DNA或RNA。
DNA可以是质粒DNA、线性DNA或合成DNA，而RNA可以是mRNA或siRNA。
这些外源DNA/RNA应在实验室中进行合成或提取，并经过纯化、测序等步骤进行质检。
3. 转染试剂选择根据实验需要和细胞类型的特点，选择合适的转染试剂。
常用的转染试剂包括离子脂质体、阳离子聚合物和电穿孔等。
离子脂质体适用于多种细胞类型，而阳离子聚合物则更适用于特定细胞类型。
电穿孔则可用于绝大多数细胞类型。
4. 转染操作将细胞用适当的细胞培养基进行洗涤，以去除残留的培养基和细胞代谢物。
然后将细胞转移到新的培养基中，并使其适应新的培养条件。
接下来，将转染试剂与DNA/RNA混合，并在室温下孵育一段时间，以使其形成复合物。
然后将复合物加入到细胞培养基中，与细胞进行共培养。
5. 转染后处理转染后，细胞需要在适当的培养条件下继续培养，以使其表达或干扰靶基因。
在此期间，可以根据实验需要添加适当的选择抗生素或标记物，以筛选或鉴定转染细胞。
同时，还可以通过荧光显微镜观察转染效率，并进行定量分析。
6. 细胞检测和分析在转染后的一段时间内，可以通过PCR、RT-PCR、Western blot等方法，检测和分析靶基因的表达或干扰效果。
此外，还可以通过细胞增殖、凋亡、迁移等实验，研究转染对细胞生物学行为的影响。
7. 数据分析和结果解读根据实验结果，进行数据分析和结果解读。
细胞转染原理
细胞转染原理细胞转染是一种常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质等分子引入细胞内，以实现基因敲除、过表达、信号转导研究等目的。
细胞转染技术的原理是利用化学、物理或生物学方法，使外源分子穿过细胞膜，进入细胞内部。
本文将介绍细胞转染的原理及常用的转染方法。
细胞转染的原理主要包括细胞膜渗透性增加、内吞作用和融合作用。
首先，细胞膜渗透性增加是指通过物理或化学手段使细胞膜通透性增加，使外源分子能够穿过细胞膜进入细胞内。
其次，内吞作用是指细胞通过吞噬囊泡将外源分子包裹起来，形成内吞泡，然后将其输送到细胞内部。
最后，融合作用是指外源分子与细胞膜融合，直接进入细胞内。
常用的细胞转染方法包括化学转染、电穿孔法、基因枪法和病毒载体法。
化学转染是利用化学试剂（如聚乙烯亚胺、脂质体等）破坏细胞膜，使外源分子进入细胞内。
电穿孔法是利用电场作用使细胞膜通透性增加，使外源分子进入细胞内。
基因枪法是将外源分子包裹在微粒上，通过高速射击使其穿过细胞膜进入细胞内。
病毒载体法是利用病毒载体将外源分子转染入细胞内。
细胞转染技术在基因工程、细胞治疗、药物筛选等领域具有广泛的应用。
通过转染技术，可以实现基因敲除、外源基因表达、蛋白质功能研究等多种实验目的。
在细胞治疗领域，细胞转染技术可以用于将修饰后的细胞注入患者体内，治疗一些遗传性疾病或癌症。
在药物筛选领域，细胞转染技术可以用于快速筛选药物的活性和毒性，加快新药研发的速度。
总之，细胞转染技术是一种重要的实验手段，可以帮助科研人员进行基因功能研究、新药筛选和细胞治疗等工作。
通过深入了解细胞转染的原理和常用方法，可以更好地应用这一技术，推动科学研究和医学进步。
8、细胞转染(脂质体介导法)
三、实验材料与器材
1材料
293T细胞
MyoD表达质粒和EGFP表达质粒
DMEM培养基
链霉素/青霉素(双抗)
FCS(小牛血清)
PBS(磷酸盐缓冲溶液)
胰酶/EDTA消化液
转染试剂(TransFast)
2、器材
20ul/ 200ul/1ml微量移液器和Tip头
利于形成小的转染复合物，从而提高转染效率，但同时细胞毒性也增大。超高分枝的、较柔
性的PEI衍生物含有额外的仲胺基和叔胺基，在染实验中发现这种PEI的毒性低，但转染效
率却较高。
Gen Escort是采用各种分枝状和超高分枝状的小分子PEI与各种含有生理条件下可降解键的
交联剂交联，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝结构使得其具有
一、实验目的
学习和掌握外源基因导入真核细胞的主要方法——脂质体介导的转染。了解外源基因进入的
一般性方法，观测外源蛋白的表达(绿色荧光蛋白) ，为染色准备实验材料。
二、实验原理
上图所示是脂质体介导转染的示意图，它显示了外源质粒进入细胞的一般过程。
外源基因进入细胞主要有四种方法：电击法、磷酸钙法和脂质体介导法和病毒介导法。电击
法是在细胞上短时间暂时性的穿孔让外源质粒进入；磷酸钙法和脂质体法是利用不同的载体
物质携带质粒通过直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因进入细胞；病毒法是利用包装了
外源基因的病毒感染细胞的方法使得其进入细胞。但是由于电击法和磷酸钙法的实验条件控
制较严、难度较大；病毒法的前期准备较复杂、而且可能对于细胞有较大影响；所以现在对 于很多普通细胞系，一般的瞬时转染方法多采用脂质体法。
细胞转染技术
细胞转染细胞转染转染，是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。
随着基因与蛋白功能研究的深入，转染目前已成为实验室工作中经常涉及的基本方法。
转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。
电穿孔法、显微注射和基因枪属于通过物理方法将基因导入细胞的范例；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。
理想的细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。
病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。
但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。
其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。
需要指出的一点是，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。
影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态，到转染方法的操作细节，都需要考虑。
常用转染方法一、脂质体转染法阳离子脂质体表面带正电荷，能与核酸的磷酸根通过静电作用，将DNA分子包裹入内，形成DNA-脂质体复合物，也能被表面带负电的细胞膜吸附，再通过融合或细胞内吞进入细胞。
脂质体转染适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前实验室最方便的转染方法之一，其转染率较高，优于磷酸钙法。
由于脂质体对细胞有一定的毒性，所以转染时间一般不超过24小时。
二、电穿孔转染法电流能够可逆地击穿细胞膜形成瞬时的水通路或膜上小孔促使DNA分子进入胞内，这种方法就是电穿孔转染法。
当遇到某些脂质体转染效率很低或儿乎无法转入时建议使用电穿孔法转染。
一般情况下，高电场强度会杀死50%-70% 的细胞。
现在针对电穿孔转染会引起大量细胞死亡而开发出了一种电转保护剂，可以大大的降低细胞的死亡率，同时提高电穿孔转染效率。
三、病毒感染对于脂质体转染与电穿孔转染都无法成功转染的细胞系建议用病毒感染，此法可以快速100%感染，检测成功率高。
细胞转染步骤
细胞转染及其筛选1.传代：细胞于10cm盘消化后接种于6cm盘向6cm盘中加入3ml培养基，“米”字形摇晃。
当细胞生长到50%-70%时，根据细胞的生长速度可进行转染2.配置转染体系：（6cm盘）2.4ug基因载体质粒；9ul转染试剂；200ul无血清培养基。
混匀后室温静置10-15min孵育。
3.将6cm盘中的旧培养基弃去，换新的培养基3ml。
4.将配置好的转染体系加入到6cm盘中，混匀6-18h内换液。
5.12小时，换液后进行显微镜拍照观察。
6.再过6h加入G418，进行筛选（始终在6cm盘中进行），使用G418浓度：600µg/mlG418的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒4℃保存。
7.3-5天换液一次（换液不用PBS冲洗），此时仍要加G418，浓度不变，只到细胞呈单个细胞那种，当细胞死的过多时，可考虑药物浓度减半。
筛选出稳定表达的cell。
8.挑克隆：1制备细胞悬液，细胞计数，用培养基稀释细胞到1个/10ul，在96孔板中加入培养基150ul/孔，在加入细胞悬液10ul/孔，待其逐渐增多后转入24孔板、6孔板、6cm盘增殖。
2.伴随着细胞的生长，可能最后会变成细胞簇，故可以用黄枪头把细胞菌落挑出，放入24孔板里面。
9.单克隆鉴定：提取细胞RNA后，进行RT-PCR检测其表达量。
10.先做RT-PCR筛选一部分，在做western继续筛选一部分。
所需物品：1.转染试剂（Attractene Transfection Regent）；2.96孔板；3.24孔板；4.6孔板；5.6cm 盘；6.G418 7. 1mlHEPES液-精品-。
细胞转染的方法和基本原理
细胞转染的方法和基本原理细胞转染是生物学研究中常用的实验技术，用于将外源DNA、RNA或蛋白质引入到靶细胞中。
本文将介绍细胞转染的方法和基本原理。
一、细胞转染的方法1. 化学法转染：化学法转染是最常用的细胞转染方法之一。
通过利用化学物质如聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体等，将外源DNA或RNA 包裹成复合物，与细胞膜结合后进入细胞。
这种方法操作简单、成本低廉，适用于多种细胞类型。
但转染效率较低，对细胞有一定毒性。
2. 病毒载体转染：病毒载体转染是一种高效的细胞转染方法。
病毒载体可以将外源基因嵌入病毒基因组中，然后通过感染细胞的方式将基因导入细胞内。
常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒等。
这种方法转染效率高，适用于多种细胞类型，但需要特殊设备和技术，同时也有一定的生物安全风险。
3. 电穿孔法转染：电穿孔法利用高压脉冲作用于细胞膜，破坏细胞膜结构，从而使外源DNA或RNA进入细胞。
这种方法操作简单，转染效率较高，但对细胞有一定的毒性，并且只适用于某些特定的细胞类型。
4. 基因枪法转染：基因枪法是一种生理穿孔法，通过利用高压气体或火药驱动基因枪，将外源DNA或RNA以微粒形式直接射入细胞。
这种方法适用于多种细胞类型，转染效率较高，但需要特殊设备和技术，并且对细胞有一定的毒性。
二、细胞转染的基本原理细胞转染的基本原理是通过一定的方法将外源DNA、RNA或蛋白质引入靶细胞，使其在细胞内表达或功能发挥。
转染后的细胞可以用于研究基因功能、蛋白质表达及相互作用等。
细胞转染的基本原理可以分为三个步骤：吸附、内化和表达。
1. 吸附：在化学法转染中，外源DNA或RNA会与载体相结合形成复合物，通过静电作用与细胞膜结合。
在病毒载体转染中，病毒载体会与细胞膜表面的受体结合。
吸附是转染的第一步，直接影响转染效率。
2. 内化：吸附后，外源DNA、RNA或蛋白质需要进入细胞内部。
在化学法转染中，复合物通过细胞膜的内吞作用或直接渗透进入细胞质。
细胞转染方法比较
细胞转染方法比较
细胞转染方法是指将外源基因转入细胞中的一种技术，是细胞基因学
研究的基础。
它具有非常重要的研究意义，可以将DNA、RNA或蛋白质引
入细胞，从而提高研究的准确性，发展基因治疗技术，还可以实现重组技术，在生物医药方面已经发挥了巨大的作用。
常用的细胞转染方法有电穿孔、热穿孔、化学转染、动力转染、质粒
载体转染等，下面就具体介绍这些方法的优缺点及适用条件。
一、电穿孔
电穿孔是将外源DNA用电压转染到细胞表面的一种方法，采用电穿孔
转染时，首先将目的基因与含有盐的溶液混合，然后在细胞上施加脉冲电压，使基因可以透过电穿孔进入细胞。
优点是转染效率高，可以较快地将
基因转染到细胞中，而不会造成细胞的死亡和损伤，并且不需要昂贵的设备。
缺点是转染的时间短，极易受环境条件的影响，转染率往往显著降低，另外，由于电压的作用，细胞表面可能受到副作用，效果不一定很理想。
二、热穿孔
热穿孔是通过改变细胞温度以及外源基因的溶液温度，使膜的稳定性
得到改变，有助于外源基因进入细胞。
优点是转染效率较高，能够获得比
较好的转染效果，且操作简单，易于掌握。
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2.转染的应用 • 基因表达
转染最常通过使用质粒载体在培养细胞(或动物 模型)中表达目的蛋白。另外，将带有可检测的标 记物及其他修饰的蛋白质导入细胞，可用于启动子 和增强子序列或蛋白间相互作用的研究。
• 基因抑制
转染的另一个常用用途是通过RNA干扰(RNAi)抑 制特定蛋白质的表达。
二、转染的分类
细胞膜是由磷脂双分子层和镶嵌蛋白组成的，带有净负电 荷。因此，它是大分子无法通过的障碍。为了让核酸通过细胞 膜：
1、化学方法：使用载体分子中和或将阳性电荷传递 至带负电的核酸上；阳离子脂质体介导的输送、磷酸 钙共沉淀 2、生物学方法：采用已经过遗传学改造的病毒转移 非病毒基因至细胞内(又称为转导)；病毒输送 3、物理方法：将核酸直接导入细胞质或细胞核内。 显微注射、激光介导的转染
稳定转染子的选择
• 成功完成稳定转染需要高效DNA输送和筛选获得DNA的细胞的 方法。
• 筛选稳定表达转染DNA的细胞的最可靠方法之一是在用于转 染的DNA重组体或共转染至细胞的独立载体中加入选择标记 物，然后经过短暂的恢复期后，在细胞中应用适当的选择压 力。当共转染载体上表达选择标记物时，携带目的基因的载 体与携带选择标记物的载体的摩尔比应在5:1至10:1范围内， 以确保包含选择标记物的细胞也含有目的基因。 • 常用的选择标记物是可传递对各种筛选药物抗性的基因或可 以补偿转染细胞系中缺陷必需基因的基因。
阳离子脂质体介导的输送
• 特殊设计的阳离子脂质体(如LipofectamineR转染试剂)可促进 DNA和siRNA进入细胞。基本结构包括带正电荷的头基和一个或 两个碳氢链。 • 采用阳离子脂质体试剂时，带负电荷的DNA与带正电荷的脂质 体自发结合，形成DNA-阳离子脂质体试剂复合物。一般认为， 转染复合物通过内吞作用进入细胞。 • 高转染效率，适用于各种真核细胞。操作简单，可确保始终获 得可重复的结果。此外，采用阳离子脂质体试剂可以转染其他 方法无法转染的多种细胞系。
选择转染策略？
定因素是实验的时间范围和最终目标。
瞬时转染细胞一般在转染后24–96小时收集，常用于研 究基因或基因产物的短期表达效应，执行RNA干扰(RNAi)介 导的基因沉默，或者快速生成小量重组蛋白。mRNA瞬时转 染可以更快速地提供结果；因为mRNA在胞浆中表达，无需 转移到细胞核，无需转录，转染数分钟后即可在部分系统 中表达转染mRNA。
相比之下，当需要长期基因表达或转染细胞需要在多个 实验中使用时，则更多地选择稳定转染。由于将DNA载体整 合至染色体中的概率较低，因此细胞的稳定转染更麻烦、 更具挑战性，需要选择性筛选和克隆分离。因此，稳定转 染通常用于大规模的蛋白质生产、长期药理学研究、基因 治疗或长期基因调控机制研究。
三、转染的技术
病毒介导的基因转移
•
病毒载体可根据其特定的应用量身定制，但必须遵循 下列主要特性： 安全性：病毒载体有时来源于病原性病毒，应对其进行适 当的修饰，使病毒操作的风险最小化。通常需要敲除对病 毒复制至关重要的部分病毒基因组，使病毒高效感染细胞 并导入病毒载体， 低毒性：病毒载体应尽量不对其感染的细胞的生理学造 成影响。 稳定性：一些病毒具有遗传不稳定性，会迅速重排基因 组。这会对使用病毒载体的操作的可预测性和可重复性产 生不利影响。 选择性：病毒载体应包含选择标记物，如特定的抗生素抗 性，从而可以分离出摄取了病毒载体的细胞。
3、培养基
• 根据细胞类型和转染方法选择最适合的培养基（合适培 养基的信息通常可通过发表的文献以及提供细胞的机构 或者细胞库获得）。 • 必须使用新鲜培养基，尤其是当其中有些组分不稳定时。
4、血清 • 一般而言，培养基中加入血清可以提高DNA转染 效率。但是，在进行阳离子脂质体介导的转染时， 必须在没有血清存在的情况下形成DNA-脂质体复 合物，因为一些血清蛋白会干扰复合物的形成。 因此当使用含有血清的转染培养基时，应对转染 条件进行优化。 • 转染RNA至细胞时，最好在无血清存在的情况下 进行转染操作，以避免出现RNA酶污染。 5、抗生素 如果使用不含血清的培养基，则应减少抗生素 的用量，以保持细胞健康。
四、报告基因的分析
• 报告基因是其产物可用于转染后分析的基因，通常是一 种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，其表达产物非常 容易被鉴定。将其编码序列与目的基因相融合，在调控 序列下进行表达，从而利用它的表达产物标定目的基因 的表达调控。 • 理想的报告基因应是研究使用的细胞中不存在的基因， 或可以与该基因的天然形式轻松区分，检测方便，且具 有较广的线性检测范围。另外，报告基因的存在不应影 响转染细胞的正常生理学和可鉴别特性的常用报告基因通常包含荧光和化学发光蛋白。 • 表达绿色荧光蛋白(GFP)的细胞可在紫外光照射下发出绿色荧光。 需要采用专门的显微镜观察单个细胞。此外还有黄色和红色荧光 蛋白可供选择，一次可以检测多个基因。 • 荧光素酶用作实验试剂时通常是指北美萤火虫荧光素酶。荧光素 酶可以催化其底物(一般为荧光素)，根据荧光素酶基因的不同， 产生黄绿色或蓝色荧光。由于荧光素酶的生物发光无需激发光， 因此几乎不会出现自发荧光，可以实现无本底荧光。 • GUS分析(使用β-葡萄糖苷酸酶)是一种极佳的单细胞检测方法， 无需复杂设备可将细胞染成蓝色。其缺点是细胞会在此过程中死 亡。 • 蓝-白斑菌落筛选可用于细菌和真核细胞。细菌lacZ基因编码β半乳糖苷酶。加入含有特定半乳糖苷(如X-gal)的培养基后，表 达基因的细胞将X-gal转变为蓝色，通过裸眼即可观察。
• 使用选择性培养基培养时，未转染的细胞或瞬时转染 细胞都将会死亡，而表达一定水平的抗生素抗性基因 或可以补偿必需基因缺陷的细胞则可以存活。选择标 记物可保护生物体不受选择性试剂影响，这些选择性 试剂通常会杀死生物体或干扰其生长。 • 亦可利用报告基因来筛选成功转染的细胞。用于转染 子筛选的报告基因则可以轻松鉴别出包含报告基因的 细胞。
• •
•
尽管转染效率因细胞类型的不同而异，在104个转染 细胞中只有大约一个细胞可以稳定整合DNA (不论使用 的是线性还是环状DNA)。 没有一种方法可以适用于所有细胞和所有实验。必须 根据您的细胞类型和实验要求选择理想的方法，必须具 有高转染效率、低血细胞毒性、对正常生理学的影响最 小，且使用简单、可重复。
1 、瞬时转染
导入核酸只在细胞中存在一段时间，且未整合至基 因组。因此，在细胞分裂过程中，瞬时转染的遗传物质 不会传递至下一代，其会在环境因素影响下丢失或在细 胞分裂过程中被冲淡。使用超螺旋质粒DNA进行瞬时转 染的效率最高， 因为它能被细胞更高效地摄取。
2 、稳定转染
外源性DNA被整合至细胞基因组中，并可以长期存在 于转染细胞。即使导入基因在多代细胞中永久性地表达， 适用于重组蛋白生产和外源性DNA表达的下游或长期效 应分析。但是，通常只有单个或几个拷贝的外源性DNA 被整合至稳定转染细胞的基因组中。正因如此，稳定转 染基因的表达水平一般低于瞬时转染基因的表达水平。
五、影响转染效率的因素
1、细胞类型 转染实验中细胞类型的选择是常被忽略的关键因素。各细胞 类型对特定转染试剂或方法的反应各异，因此需要选择合适的 细胞类型。
2、细胞健康与活性
• 一般而言，转染之前，应至少有90%的细胞为活细胞，且 传代复苏时间应足够，而且用复苏后传代次数低于30次 的细胞。 • 在转染前至少24h传代细胞，以确保细胞能够恢复，并在 转染时处于最佳生理学状态。 • 避免污染。
细胞转染
目录
1、转染的简介 2、转染的分类 3、转染的技术 4、报告基因分析 5、影响转染效率的因素
一、转染的简介
1.什么是转染 从广义上讲，转染是采用除病毒感染外的其他方 法将核酸(DNA或RNA)人工导入细胞的过程。采用各 种化学、生物学或物理方法导入外源性核酸会改变 细胞的特性，从而实现细胞基因功能和蛋白质表达 研究。 转染后，导入的核酸可以瞬时性地存在于细胞内， 只表达一段时间且不会复制，也可以稳定地整合至 受体基因组内，随着宿主基因组的复制而复制。