第四章 性别控制技术

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第四章
性别控制定义 性别控制技术概况
性别控制
性别控制的意义
性别控制的方法 性别控制技术前景
一、性别控制定义



畜牧生产中,肉、奶、蛋等重要经济性 状在性别间有差异,有的是限性性状。 奶 牛 蛋 鸡 长毛兔:产毛量母兔优于公兔
一、性别控制定义
在正常情况下,自然界动物群体公、母
3、免疫磁珠技术
流式细胞分离法


流式细胞术(flow cytometry,FCM)是 近年迅速发展起来的细胞或细胞颗粒定 量分析和进行细胞分类研究的新技术。 流式细胞仪(flow cytometer)又称荧 光激活细胞分类器(FACS)是流体喷射 技术、激光光学技术、电子技术和计算 机技术综合性的高科技产品。


主要组件:液流系统、激光器、荧光检 测器、散射光检测器、偏转板、细胞收 集器以及电子控制系统和计算机系统。 这种分类技术可以测定细胞的大小、数 量和类型,并可依赖荧光染色测定DNA含 量和蛋白质水平,同时根据其差异进行 分离。
流式细胞分离法
源自文库

理论基础:X精子DNA含量比Y精子多(人:差异为 2.8%,家畜:差异3.0%~4.2%)。 将精子稀释并与荧光染料Hoechst33342共培养, 染料定量结合DNA。当精子通过检索仪时被定位从 而被激光束激发,X精子放射出较强的荧光信号, 通过仪器和计算机系统扩增、分析并分辨出X精子 与Y精子。


X、Y精子分记方法的发展 物理分离法 免疫分离法 流式细胞分离法
物理分离法


沉积分离法 电泳法 层流分离法 白蛋白液柱分离法 传递逆流电流法 Y精子F小体检测
物理分离法(1)



沉积分离法:根据X精子比Y精子稍重,故沉 降速率稍快。 电泳法:X精子带有较多的净负电荷,因此, X精子向正极移动的速度比Y精子快。 层流分离法:根据X精子和Y精子具有不同的 游动方式和行为来分离精子,X精子集中在 液柱的始端而Y精子集中在较远的一端。
可增强良种选育中的选择强度,加快遗传
改良的进度;
可以排除畜群中有害基因或不理想的基因
(如避免患有伴性遗传疾病后代的出生)。
四、性别控制的方法



主要两方面,一是受精之前,二是受精 之后。 受精前的性别控制 胚胎的性别鉴定 胎儿出生前的性别鉴定 生物技术
(一)受精前的性别控制
精子的分离 调节授精环境的pH值 控制授精时间

三、性别控制的意义
目的是在动物出生前即用人工方法控制
其性别,以改变后代的自然性别比例, 进而按照人们的意愿进行特定性别的畜 禽生产,显著提高畜牧业经济效益。 对高效优质的发展畜牧业具有重要意义 可使受性别限制的生产性状(如泌乳性 状)和受性别影响的生产性状(如肉用、 毛用性状等)能获得更大的经济效益;




哺乳动物精子可分为两类,一类携带X染色 体 (X精子),一类携带Y染色体(Y精子)。 这两类精子在比重、体积、表面电荷、表 面抗原等方面略有差异。 根据这些差异,设计了诸如沉降法、离心 法、过滤法、电泳法、H-Y抗原法等分离方 法试图将这两类精子分开,达到控制后代 性别比例的目的。
精子的分离

1923年,Painter证实了人类X和Y染色体的存在,指 出当卵子与X精子受精,后代为雌性,与Y精子受精, 后代为雄性。

1955年Eichwald和Silmser发现雄性特异性弱组织相 容性抗原(male specific minor histocompatibility-Y antigen, H-Y抗原)后,许 多人致力于用H-Y抗体来控制动物性别,但后来通过 其他方法验证的结果,用H-Y抗体来分离X和Y精子及 胚胎性别鉴定都不理想。


通过核型分析来鉴定 胚胎性别,寻找不能 与 X 性染色体配对的 Y 染色体。 准确率几乎是100%
3、X连锁酶活力测定法




原理:早期雌胚中2条X染色体中的一条失活,在胚 胎基因组激活与X染色体失活的短暂时期内,2条X 染色体均可被转移,雌胚中与X关联酶浓度及活性为 雄胚的2倍。 小鼠8-细胞胚次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶(HPRT) , 结果14/15的胚胎性别与HPRT活性结果一致,其中雄 性准确率100%,雌性91%。 测定从桑椹胚到囊胚阶段小鼠胚胎6-磷酸葡萄糖脱氢 酶( G6PP)的活性,雌性准确率为72%,雄性57%。 对X染色体失活时间尚不明确,易误判。
1、性染色质鉴定法


是世界上第一种鉴定胚胎性别的方法。 Garner等人于1968年从兔胚胎中取出细胞并 对其性染色质或染色质小体进行分析。 此法较复杂且对胚胎损伤大,成功率甚低, 同时染色质小体在许多家畜胚胎细胞中很难 发现和观察。对那些可辨认性染色质(暂时失 活的X染色体)的少数胚胎来说,准确性很高。 在实际生产中没有多大的价值。
免疫学分离法
免疫亲和柱层析法 H-Y抗血清直接输入法 免疫磁珠技术

1、免疫亲和柱层析法
用这种方法分离小鼠精子进行人工授精,发现 H-Y-组获得4.2%的雄鼠(对照组为46.6%),H-Y+组 获得92%的雄鼠。
2、H-Y抗血清直接输入法
Zavos等(1983)给家兔阴道输入H-Y抗 血清,15 min后进行人工授精,获得了74%的 雌性仔兔;未输入H-Y抗血清的对照组,雌兔 率为44.4%。

1959年Welshons和Jacobs等提出Y染色体决定雄性的理论, 引起了人们从染色体上寻找性别决定基因。 1966年,Jacobs等发现雄性决定因子位于Y染色体短臂上 1989年,Palmer等找到了Y染色体上的性别决定区(sex determining region of the Y chromosome,SRY),它 的长度为35kb,编码79个氨基酸,在不同哺乳动物中有很 强的同源性。SRY序列的发现是哺乳动物性别决定理论的 重大突破。目前,用分子生物学方法确定胚胎细胞中是否 存在SRY基因来鉴定胚胎性别的技术已进入实际应用阶段。
物理分离法(2)


白蛋白液柱分离法:在粘滞的白蛋白液柱中, Y精子的游动速率比X精子快。 传递逆流电流法:用热传递和逆流沉积法结 合电流的方法来分离人精子。比较轻的Y精子 移动缓慢,从而分别收集到X和Y精子。
物理分离法(3)

Y精子F小体检测 对男性染色体染色,发现 Y染色体长臂发出荧光比其他染色体强,并 且,在分裂期间细胞中发现很量的斑点(F 小体)。39%-47%人精子呈现F小体。F小体 并非在全部哺乳动物中见到,但在大猩猩和 家畜精子中均发现了F小体,因此可用于家 畜精子分离。
(二)胚胎的性别鉴定

性染色质鉴定法 染色体组型鉴定法 X连锁酶活力测定法 雄性特异抗原鉴定法 SRY-PCR鉴定法 LAMP
早期胚胎分割方法

毛细管吹吸法 2到8-细胞期卵裂球(有的是16细胞,应在 致密化之前)
显微手术法


取囊胚的滋养层细胞或桑椹胚部分细胞
玻璃针、显微手术刀 显微操作仪简介 胚胎分割1 (模式:桑椹胚/囊胚) 胚胎分割2(2-到8-细胞期卵裂球)
注:两部片子中都不是太确切。

应用现代分子生物学技术对早期胚胎进 行快速、准确的性别鉴定是可行的,但 由于早期胚胎性别鉴定需从胚胎上取下 少量细胞,对胚胎有一定损害,经冷冻解冻处理后仅有少量胚胎存活,导致胚 胎移植的成功率下降,这就制约了提供 预知性别家畜胚胎的商业化进程。


近交系小鼠性别间皮肤移植实验: 雄性 雄性、雌性 雌性、雌性 雄性均 不发生排斥反应。 雄性 雌性时出现了排斥反应。 表明雄鼠皮植片具有一种雄性特有的细胞表面成 分。这种成分被称为雄性特异性次要组织相容性 Y抗原(male specific minor histicmpatibility-Y antigen),简称H-Y抗原。

精液在分离过程中的高倍稀释,会使精子活力下降。 而分离前洗脱精浆、稀释和分离都会降低精子质膜的 稳定性,从而导致提前获能。 虽然质膜稳定性降低可使精子能够马上具有受精能力, 能立刻用于体外受精,但另一方面却缩短了精子寿命, 使得精子在到达受精部位前或在体外保存过程中死亡。 价格昂贵 每台约25万美元。


Commercial Sperm Sorting Facility, UK
MoFlo® SX
XY Inc. Fort Collins, CO
流式细胞分离法发展前景


随着分离精子速度的提高,将来可以提供足够数量的 用于人工授精的分离精子。例如,Beltsville公司利 用新型的精子分离专用喷嘴来提高精子分离速度。在 分离纯度为90%时,每小时可分离精子6百万个;如果 纯度只是要求在75%~80%,那么速度可达到每小时2 千万个。 另一方面,由于精子分离速度慢、成本高,人们一直 探讨采用只需少量精子的输精技术。如手术输精(子 宫内、输卵管内)、人工授精(子宫深部、子宫颈 部)、体外受精(IVF)和胞质内精子注射(ICSI)。


受胎率低 精子受精力比正常精子低,解冻后的活力和顶体完 整率低等。分离过程不会影响受精,但可能会影响 早期胚胎和胎儿的发育 。 原因:荧光染色、稀释、冷冻、分离前后的保存、 分离过程中紫外线的照射及机械损伤等,都可能会 对精子产生不利影响。现已证实,分离过程会损伤 精子细胞膜,使活力、存储能力和受精能力下降。
2、染色体组型鉴定法



经典胚胎性别鉴定方法。 (1) 采集胚胎细胞样品;(2) 专门训练有 素的技术人员;(3)费时。 2名有经验的技术人员约需5小时才能鉴定 12-15枚胚胎。 难以应用于生产之中,只能主要用来验证 其它性别鉴定方法的准确率。


操作过程 :先取少量的胚胎细胞,在含有秋 水仙素的培养液中培养,使细胞的有丝分裂 停留在中期; 用低渗溶液使细胞膨胀,细胞膜破裂释放染 色体,然后固定,用姬姆萨染色后在显微镜 下观察。由于有丝分裂被阻滞在中期,故染 色体缩短,形状规则,并有特异的带型。
调节授精环境的pH值



Y精子对疲劳和酸的耐受力较差。 向前等(1996)用pH7.2的精液人工授精,结果产公犊 72.3%,pH6.8产公犊39.1%。 段恩奎等(1991)在兔输精前经阴道输入不同浓度和 构型精氨酸改变生殖道pH,结果后代雌性比率与浓 度无关,而与pH有关,pH5.22雌兔率为39.1%, pH9.83雌兔率为61.90%,但与正常性比率差异不显著。 近几年来,有许多人做此方面的实验,有成功的报 道,也有否定的观点。
控制授精时间


母牛排卵前输精易得雌性后代,近排卵时 易得雄性后代,预测和实际符合率70%。 猪:对22窝母猪试验,排卵前授精得母仔 55.6%,排卵后授精得公仔57.3%, (P<0.05)。排卵前E2、LH比排卵后高2.3、 6.3倍。
改变冻精的解冻温度

在一定温度范围内,冷冻精液的解冻温度与精 子的活力呈正相关。冻精解冻温度越高,精子 复活越快,其活力也越强,消耗的能量快而多 ,故存活时间短。这样相应的缩短了Y精子的 寿命,而延长了X精子的寿命,并增加了与卵 子结合的机会,从而提高生母率。



该法所获得的首例成活后代是经子宫内手术授 精出生的兔子。 英国剑桥动物生物有限公司最早于1993年开展 用分离精子进行牛IVF研究并获得成功。 分离精子的速度很慢 相对于人工授精的输精量(一千万个精子)而 言,它的分离速度太慢,每小时只能分离35万 个精子(2001年数据)。
流式细胞分离法
性别比例基本上近于1:1,保持性别比例 平衡是生物进化的结果。 性别控制(sex control,SC)指通过人为 干预并按人们的愿望使雌性动物繁殖出 所需性别后代的一种繁殖新技术。
二、性别控制技术的发展概况



20世纪初,McChung(1902)在研究蝗虫精细胞时,首先 提出了性别决定的染色体理论。 此后,Stevens和Wilson 用昆虫进行一系列研究后指 出,雌雄个体中不同的性染色体与性别有关,并将性 染色体定义为X染色体和Y染色体。 随后,许多研究证实,哺乳动物的正常性别是由一对 性染色体决定的。动物个体的性别取决于受精时雌、 雄配子所携带的性染色体类别。
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