南方医科大学微生物实验报告

2016年南方医科大学医学微生物学实验报告

日期 2016年5月22号

一、实验目的

1、掌握培养基制备的原则和一般方法。

2、掌握病原菌的分离与培养方法。

3、掌握油镜的正确使用、细菌涂片标本的制备、革兰氏染色法，熟悉细菌基本形态。

4、熟悉几种常用的细菌生化反应的名称、原理、方法、结果分析及用途。

5、掌握血浆凝固酶试验的原理、方法及用途。

6、熟悉药物敏感性试验方法的种类、原理及应用，掌握纸片扩散法。

7、掌握玻片凝集试验的原理、方法、结果观察与判断。

二、实验器材

1、天平、称量纸、干粉培养基、锥形瓶、量筒、15支试管、试管架、试管筐、5ml刻度吸管、平皿、洗耳球、酒精灯

2、脓汁标本1支，粪便标本1支；伊红美兰平板2个，营养琼脂平板2个，伊红美蓝平板2个，接种环，酒精灯

3、斜面4支、细菌分离培养物（上次实验平板）

4、斜面培养物4支，营养肉汤4支，生理盐水2支，镜油瓶、拭镜纸1套，吸水纸1 本，载玻片4张，染色瓶，染色架

5、斜面培养物4支，营养肉汤培养物（菌液）4支，半固体琼脂4支，营养琼脂平板4 个，糖发酵管1套，抗菌素纸片1套，眼科镊子2把

6、半固体培养物4支，药敏试验培养物4个，微量发酵管培养物1套。

三、方法与步骤

1、培养基的制备：

（1）营养琼脂培养基的制备：称量11.4g琼脂，置于三角烧瓶中，加入300ml蒸馏水，分2瓶装，用于倒平板。

（2）营养琼脂培养基的制备（用于制作斜面）：称量2.9g琼脂，置于三角烧瓶中，加入75ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管5ml。

（3）肉汤培养基的制备（用于制作液体培养基）：称量1.1g琼脂，置于三角烧瓶中，加入50ml蒸馏水，放在电炉上，煮沸1次，分15支小试管装，每支试管5ml。

（4）半固体琼脂培养基的制备：称量1.7g琼脂，置于三角烧瓶中，加入60ml蒸馏水，放在电炉上，先后煮沸3次，分15支中试管装，每支试管4ml。

2、细菌的分离培养

平板划线分离法

甲→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）乙→脓汁标本→营养琼脂平板(黄色）

丙一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）丁一粪便标本一伊红美蓝平板(紫色）

步骤：①接种环烧灼灭菌。②取标本3～6ul。③平板采光，当看到平板表面象镜面有反光的时候，保持这个角度，划线时就能看清划线痕迹，以便控制划线。

④接种环与平板呈30～40度角，在平板表面上方，以曲线的形式，作大幅度来回连续划线，边划边退，线段要划得长而密集，每区划线不少于30条。⑤烧掉接种环上多余的标本。⑥转动平板，通过第一区5～7次，使接种环重新沾上少量细菌，同样的方法划第二区。⑦转动平板，接种环通过第二区1次，划第三区。

⑧转动平板，接种环通过第三区1次，划第四区。⑨划第五区。

3、细菌的纯培养

斜面接种分工

甲→普通平板→黄色菌落→1支斜面乙→普通平板→白色菌落→1支斜面

丙→EMB平板→紫黑菌落→1支斜面丁→ EMB平板→粉红菌落→1支斜面

方法：接种环→套住菌落→轻刮取菌→接种环取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉→条细菌接种线→再伸入底部，自下向上，作蜿蜒划线→细菌涂布接种在斜面培养基的表面→斜面正面上2/3作标记：组号、颜色→收集平板-灭菌桶内（平板底部朝下，盖朝上放置）→速送灭菌室→高压蒸汽灭菌→洗刷。

4、细菌的形态学检查

涂片→干燥→固定→染色

(1)涂片→干燥→固定

甲→黄色，紫黑。乙→白色，粉红。

丙→黄色，紫黑。丁→白色，粉红。

方法：涂片：①接种环取盐水3ulX2滴，水滴间距小于2cm;②取菌苔少许（1mm 小菌落半个）与盐水混勻，涂成大于lcm2;③涂毕→环移至涂膜中央侧立，待环内菌膜破裂，接种环烧灼灭菌。→干燥→固定：手持载玻片→端，涂膜朝上，两个涂膜快速通过火焰外层3次，时间2〜3秒钟。

(2)革兰染色

涂片→干燥→固定→结晶紫→初染1分钟→水洗→卢戈碘液→媒染1分钟→水洗→ 95%乙醇→脱色约20秒钟—7尺洗—稀释品红—复染1分钟—水洗—吸干，

镜检。

油镜使用方法：10X物镜—看清标本—滴加香柏油—100X油镜—浸泡油中→模糊物象→细调节调焦，观察物像→记录结果→关闭电源→擦镜纸拭去香柏油—擦镜纸沾少许乙醇和乙醚（7:3)混合液擦拭→擦镜纸擦拭油镜。

5、液体培养基接种（肉汤接种）

甲→金黄色，乙→白色，

丙→紫黑，丁→粉红。

方法：（1)接种环斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接种；（2)在管壁上，将接种环内的菌膜拍破。退出接种环，烧灼灭菌；（3)标记：组号，颜色6、细菌的生化试验等

（1）细菌的糖发酵实验：

①在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记

②在紫黑色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记

③在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有葡萄糖的发酵管中，并做好标记

④在粉红色的斜面培养基取适量菌落接种在含有乳糖的发酵管中，并做好标记

步骤：①用砂轮在糖发酵管液面上方2～3cm处，切割一道切痕。②两手握住发酵管将管子折断。管口烧灼灭菌。③接种针斜面取菌，伸入培养基内，在管壁上，上下研磨接种。退出接种针，烧灼灭菌。④管口朝向相同，放置在平皿内。

（2）抗菌素敏感性试验

纸片扩散法

甲→黄色菌液乙→白色菌液

丙→紫黑菌液丁→粉红菌液

方法：①先取→环菌液；②沿平板直径拉一条细菌接种线；③再取一环菌液；④旋转平板90度角，拉另一条接种线，使两条细菌接种线呈“十字形”；⑤然后在平板上半部，作连续来回密集划线，每次划二分之一平板；⑥旋转平板90度角，二次密集划线；⑦旋转平板90度角，三次密集划线；⑧旋转平板90度角，四次密集划线；⑨设三点，呈等边三角距离；⑩点距离平板边缘约15mm;⑪作标记：青、先、庆；⑫镊子尖嘴朝下，夹取相应药物纸片的边缘，平贴在已设定的位置上，轻轻按压纸片。