染色体标本制作与观察实验报告

【实验题目】

染色体标本制作与观察

【实验目的】

1、掌握小鼠睾丸细胞染色体标本的基本制作过程和Giemsa染色法，了解各操作步骤的原理。

2、了解常用实验动物染色体的数目及特点。

3、认识不同生物染色体的特征，学会做染色体组型图。

【实验材料与用品】

1.?器材：显微镜、载玻片、盖玻片、镊子、手术剪、解剖盘、胶头滴管、离心管、离心机、

小烧杯、冰箱、酒精灯、小烧杯等?

2.?材料：小鼠

3. 试剂：蒸馏水、0.9%?NaCl溶液、0.3%?KCl溶液，固定液（甲醇：冰醋酸=3:1）、

秋水仙素

【实验原理】

一、制作染色体标本的先决条件

✍细胞具有旺盛的分裂能力：选择活跃的组织，如胸腺、骨髓、睾丸、小肠；或施加药物使

细胞分裂（PHA）

✍设法得到大量的分裂中期细胞：利用秋水仙素

二、染色体

染色体是基因的载体。真核细胞染色体的数目和结构是重要的遗传特性之一。制备染色体标本是细胞学最基本的技术之一，优良的染色体制片是进行染色体显带、组型分析、原位杂交等的先决条件。

染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞、、和组织培养的细胞中制备染色体。本实验采用的方法是从小鼠的睾丸细胞中获取。

染色体的形态结构在细胞增殖周期中是不断的运动变化的，一般在有丝分裂中期，染色体形态最典型、最易辨认和区分。因此，制备染色体标本获取的是中期细胞。

染色体特征：数目、长度（绝对长度、相对长度）、着丝粒位置（M/SM/ST/T)、随体与次缢痕的数目大小和位置、带型分析

描述染色体的四个参数：?

①?相对长度=（每条染色体的长度）/（单倍常染色体之和+X染色体）*100，相对长度可以

用来表示每条染色体的长度。?

②?臂指数=（长臂的长度）/(短臂的长度)，臂指数可以用来确定臂的长度。

③?着丝粒指数=（断臂长度）/（染色体全长）*100，着丝粒指数可以决定着丝粒的相对位

置?。

④?染色体臂数（NF），根据着丝粒的位置来确定。

三、操作原理

小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织（由于分裂活动旺盛，睾丸也可）利用睾丸细胞的制片技术虽然需要离心以及细致的操作，但基本程序并不复杂。在小鼠睾丸中，细胞有丝分裂和减数分裂比较旺盛，因此不需要体外培养就可以直接得到分裂中期细胞。通过小鼠睾丸得到染色体比较简便，一般不需要无菌操作。用秋水仙素作为有丝分裂的抑制剂，将其注入到小鼠腹腔中，可以阻止分裂细胞纺锤体的形成。

由于小鼠睾丸细胞分裂活动旺盛，具有高度的分裂能力，本次实验通过前处理、低渗、固定、制片染色等步骤制得染色体标本，可观察到许多处于分裂中期的染色体，可以进行染色体组型分析。

Giemsa染色法的染色结果：细胞核染成紫红色、细胞质和核仁染成蓝紫色

四、制作染色体标本的意义

了解染色体的特征（形态、大小、数目）——绘制染色体组型图?

染色体组型：把真核动物一个体细胞各染色体按长度、形状、着丝粒位置排列成一定顺序。? 染色体核型：某一物种特有的一组或一套染色体的形态特征。??

染色体组型图的应用?

①?鉴别生物种类：兔44条；小鼠40条；大鼠42条；鸡78条；猫38条；狗78条；马64?

②?遗传病的诊断和研究：三体综合征（含三条21号染色体）、卵巢退化症（含45条染色体，比正常人缺少一条性染色体）、睾丸退化症（含47条染色体，比正常人多一条X 或Y染色体）等。因此，我们可以给孕妇抽取羊水检查器胎儿的染色体，做遗传病早期诊断。?

染色体标本的制作?

1）PHA：促细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞

2）秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，大量细胞停止在分裂中期

3）低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间距拉大，易于分散开

4）空气干燥：使细胞和染色体展开

5）固定：用carnoy’s solution（甲醇：冰醋酸=3：1）作用使蛋白质变性，对于染色体内的组蛋白来讲，变性后硬度增加，保持了染色体的即时形态，对细胞膜蛋白来讲，变性使细胞膜硬度增强。形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。

6）视野中染色体可能是20或40条左右，因为细胞可能处于减数第一次分裂和减数第二期分

裂时期。?

【实验步骤】

一、小白鼠染色体标本制作步骤

(1）?取雄性小鼠，以每克体重4ug注射秋水仙素，14-16h后，用断头法处死小鼠，取出睾

丸用生理盐水（0.9%?NaCl溶液）洗去血污。?

（2）?将睾丸放入装有1mL?0.3%?KCl溶液的小烧杯中剪碎至液体呈乳白色。?

（3）用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%?KCl溶液至4mL。?

（4）37℃静置30min，低渗处理。?

（5）以800-1000r/min离心8分钟。?

（6）?弃上清液，加入2mL甲醇.冰醋酸固定液（3:1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细

胞，固定8min。?

（7）?再以800-1000r/min离心8分钟。?

（8）?弃上清液，加入1mL甲醇·冰醋酸固定液制成细胞悬液，固定5min。?

（9）?取去洁净的低温预冷载片，取出后立即用吸好细胞悬液的滴管在距载玻片10-15cm 的

高度滴下2-3滴细胞悬液，从载玻片一边向另一边轻轻吹气，同时轻轻敲打载玻片，以

使细胞均匀分布，促使染色体展开。?

（10）?用滤纸擦去载片上的多余液体，空气干燥。

（11）用Giemsa染色20-30分钟，细水流反面冲洗载玻片以洗去多余染液，自然晾干。（12）镜检。低倍镜下寻找分散良好，染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态，

找到处于细胞分裂中期的染色体。?

【实验结果与分析】

I.实验结果

图1:40倍镜下观察染色体组图2:40倍镜下观察结果

II.实验分析

结果分析：?

本实验采用的是小鼠的睾丸细胞，在40倍镜下观察，视野中可见许多未成熟的精子（如图1），另外能够找到很多处于分裂间期和前期的染色体，其凝集程度不是很高；分析可知，处于减数第一次分裂的中期的细胞是二倍体，可观察到20对即40条染色体，有些在进行减数第二次分裂中期，这样的细胞是单倍体，应有20条染色体。

观察中会出现少于20条染色体的情况，或者多于20条少于40条的情况，可能原因：

1）在制备细胞悬液过程中有染色体的丢失。如用吸管吹散细胞时用力过大造成细胞破裂，

使得染色体弥散在溶液中，在随后的离心中将会丢失。

2）在距离载玻片一定高度滴片时因高度过高，使得染色体过于分散而导致丢失。

3）滴完片在敲打载玻片的过程中导致染色体的丢失。

4）染色时，由于在染液中染了30min，部分染色体可能会随染液丢失。

实验中没有观察到完全展开好的染色体，染色体大多呈棒状而不是V字形，这说明在对染色体展平的步骤没有做好，以后应改进。?