2015版中国药典无菌检查法课件
2015年药典无菌检查(常州培训)
Ø 注：菌悬液在室温下2h使用,若保存在2 ～8 ℃可在24小时内使用。
2020年1月
228
9.3 培养基灵敏度检查
培养基灵敏度检查使用6株菌见下表
2020年1月
229
9.4 培养基适用性检查
培养基接种
金黄色葡萄球菌2支
硫乙醇酸盐流体培养基
铜绿假单胞菌2支
12ml（7支）
生孢梭菌2支
空白对照1支 分别接种小于100cfu金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、生孢梭菌 菌悬液各2支,另1支不接种作为空白对照,培养3天，逐日观察结果。
3)方法适用性试验按“供试品的无菌检查”的规 定及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进 行方法确认。
2020年1月
333
10.1 方法适用性试验
菌种及菌液制备 ：除大肠埃希菌
（Escherichia coli）[CMCC(B) 4 4102〕外，
金黄色葡萄球菌 、 枯草芽孢杆菌 、 生孢梭 菌、 白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查。
2020年1月
226
注：10倍梯度稀释；选择适宜的3个稀释级别；要求＜100cfu/ml。
2020年1月
227
9.2 培养基适用性检查
菌液制备
Ø 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪 大豆胨液体基中或胰酪大豆胨琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物 至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18 ～24h；
Ø供试品检查时，培养基的用量和高度同方法适 用性试验。
2020年1月
224
9、培养基适用性检查
Ø 无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨 液体培养基等应符合培养基的无菌检查及灵敏度检 查的要求。
无菌检查ppt课件
精选编辑ppt
4
三、检测环境
GB/T 14233.2-2005：无 菌室操作台或超净工作 台局部应符合洁净度100 级单向流空气区域要求。
单向流空气 、工作台面及环境应定 期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、 浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国 家标准进行洁净度确认。隔离系统应 定期按相关的要求进行验证，其内部 环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
试验组 阳性对照组
30~35℃ 不得超过5天
20~25℃ 不得超过5天
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八、验证方法——薄膜过滤法
供试品稀释、 过滤 √ —— √ —— √ ——
√
菌株
金葡 金葡 大肠 大肠 生孢 生孢
枯草
菌量
培养基
组别
流乙醇酸盐流 体培养基
最后一次冲洗 液加菌＜ 100cfu/ml
精选编辑ppt
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八、验证方法
目的：确认无菌试验的产品是否具有抑菌性；如果有，如何去除，并被证实。
无菌检查方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。
医疗器械最常使用的方法为直接培养法，薄膜过滤法适用于液体类产品或供试品已 转化为供试液的产品，本公司的产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选 用直接培养法。
3、培养基适用性检查
①无菌性检查——排出培养基本身的污染，避免无菌试验过程 中由培养基引起的假阳性
②灵敏度检查——确保培养基营养性良好，对微生物具有生长 促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引起的假阴性
注：用于无菌检查的培养基必须经过培养基适用性检查。
无菌检查法-PPT课件
供试品的无菌检查部分
1、阳性对照用量：
原：“若采用直接接种法，应增加供试品1支 （或瓶）作阳性对照用。”
修订为 ：若采用直接接种法，应增加供试品无菌 检查时每个培养基容器接种的样品量作阳性对照 用。
——因若是液体制剂，应该采用薄膜过滤法，若是 固体制剂每管接种量可能不止1支（或瓶），应 按验证的方法确定。
备注中对供试品容器装量不够接种两种培养 基的情况，明确规定最少检验数量应加倍。
感谢您的关注
供试品的无菌检查部分
培养及观察
对于培养14天后，不能从外观上判断有无 微生物生长时，删除了：“或划线接种于 斜面培养基上” 的规定。
同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判 断的规定。
结果判断部分
新增订阳性对照管和阴性对照管的实 验结果对于整体实验结果判断的作用： “ 阳性对照管应生长良好，阴性对照 管不得有菌生长。否则，试验无效。”
无菌检查法-PPT课件
方法验证试验部分
1、验证试验用菌种及菌液制备在培养基 灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿假 单胞菌，增订了大肠埃希菌。
2、验证试验中样品用量
修订为： 薄膜过滤法验证试验样品量：
“ 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜 过滤法过滤。”
直接接种法验证试验样品量： “…其中1管接入每支培养基规定量的供试品量， “
供试品的的无菌检查部分
薄膜过滤法：
1、新增规定：抗生素供试品应选择低吸 附的滤器及滤膜
2、新增规定：对每片滤膜的总冲洗量不 得过1000ml
3、新增规定：所用冲洗量、冲洗方法同 验证试验
供试品的无菌检查部分
薄膜过滤法
2015版药典无菌检查法与微生物鉴定
• 无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止各 类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。
• 无菌检查法的局限性 由于无菌是一个相对的概念， 因此，对无菌检查的结果应该有一个正确的认识－即产品 通过无菌检查仅仅意味着在该检验条件下，供试品未发现 有微生物污染，并不表示所有的产品都是无菌的。反之， 当供试品中检出微生物污染，则可以认为批产品的微生物 污染风险相当高。
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷 酸 氢 二 钾 …………………....2.5g 硫酸镁 一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
Dextrose(葡萄糖)............................................5.0 g Sodium Chloride(氯化钠).....................................2.5 g L-Cystine( L-胱氨酸) .......................................0.5 g Sodium Thioglycollate (硫乙醇酸钠)..........................0.5 g Agar( 琼脂).................................................0.75 g Resazurin( 刃天青) .........................................1.0 mg Water（水）............................................. ...1000ml
中国药典(2015年版)无菌检查法
中国药典(2015年版)无菌检查法是用于检查药典要求无菌的药品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。
如果供试品符合无菌检查法的规定，仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法。
只要供试品性质允许，应采用薄膜过滤法。
薄膜过滤法一般应采用封闭式薄膜过滤器，无菌检查用的滤膜孔径应不大于0.45微米，直径约为50mm。
根据供试品及其溶剂的特性选择滤膜材质，使用时，应保证滤膜在过滤前后的完整性。
直接接种法适用于无法用薄膜过滤法进行无菌检查的供试品，即取规定量供试品分别等量接种至硫乙醇酸盐流体培养基和胰酪大豆胨液体培养基中。
2015年版药典 无菌检查法
灵敏度检査 菌 种 培养基灵敏度检查所用的菌株传代次数不得超过 5 代(从 菌 种 保 存 中 心 获 得 的 干 燥 菌 种 为 第 0 代 ），并 采 用 适 宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验 菌株的 生物 学特 性。 金 黄 色 葡 萄 球 菌 （Staphylococcus aureus ) C C M C C (B) 26 003〕 铜 绿 假 单 胞 菌 （Pseudomonas aeruginosa ) C C M C C ( B) 10 104〕 枯 草 芽 孢 杆 菌 仏 5)〔C M C C ( B ) 6 3 501〕 生 抱 梭 菌 sporogenes) C C M C C ( B ) 64 941〕 白 色 念 珠 菌 albicans) C C M C C ( F ) 98 001〕 黑 曲 霉 n ig e r) C C M C C ( F ) 98 003〕 苗 液 制 备 接 种 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单 胞 菌 、枯草 芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨液体培养基中或胰酪大 豆 胨 琼 脂 培 养 基 上 ，接 种 生 孢 梭 菌 的 新 鲜 培 养 物 至 硫 乙 醇 酸 盐 流 体 培 养 基 中 ，30〜 35°C培 养 18〜 2 4 小 时 ；接 种 白 色 念 珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基中或沙氏葡萄糖 琼 脂 培 养 基 上 ，20〜 25°C培 养 24〜 4 8 小 时 ，上 述 培 养 物 用 PH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9% 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 菌 数 小 于 lOOcfu( 菌 落 形 成 单 位 ）的 菌 悬 液 。接 种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上， 20〜25*C培 养 5〜7 天 ，加 人 3〜 5 m l含 a 0 5 % (m l/m l) 聚山 梨 酯 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 ，将 孢 子 洗 脱 。然 后 ，采 用 适 宜 的 方 法 吸 出 孢 子 悬 液 至 无 菌 试 管 内 ，用 含 0.05% ( m l/m l) 聚 山 梨 醋 8 0 的 pH7. 0 无 菌 氣 化 钠 -蛋 白 胨 缓 冲 液 或 0. 9 % 无 菌 氣 化 钠 溶 液 制 成 每 l m l 含 孢 子 数 小 于 lOOcfu的 孢 子 悬 液 。 菌 悬 液 若 在 室 温 下 放 置 ，应 在 2 小 时 内 使 用 ；若 保 存 在 2〜8°C可 在 2 4 小 时 内 使 用 。黑 曲 霉 孢 子 悬 液 可 保 存 在 2 〜 8°C，在 验 证 过 的 贮 存 期 内 使 用 。 培 养 基 接 种 取 每 管 装 量 为 12ml的硫乙醇酸盐流体培 养 基 7 支 ，分 别 接 种 小 于 lO O c fu 的 金 黄 色 葡 萄 球 菌 、铜 绿 假 单胞菌、生 孢 梭 菌 各 2 支 ，另 1 支 不 接 种 作 为 空 白 对 照 ，培 养 3 天 ；取 每 管 装 量 为 9 m l的 胰 酪 大 豆 胨 液 体 培 养 基 7 支 ，分 别接种小 于lOOcfu的 枯 草 芽 孢 杆 菌 、白 色 念 珠 菌 、黑 曲 霉 各 2 支，另 1 支不接种作为空白对照，培 养 5 天 。逐 日观 察结果。 结 果 判 定 空 白 对 照 管 应 无 菌 生 长 ，若 加 菌 的 培 养 基 管 均 生 长 良 好 ，判 该 培 养 基 的 灵 敏 度 检 查 符 合 规 定 。
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验(直接接种法)
*********公司*********产品无菌检查方法适用性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至胰酪大豆胨培养基中或胰酪大豆胨脂培养基上，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.2接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.3接种白色念珠菌的新鲜培养物至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养24～48小时，培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数小于100cfu的菌悬液。
2.4接种黑曲霉菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基上，20～25℃培养5～7天，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。
然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌孢子悬液。
6、无菌检查直接接种法方法适用性试验6.1供试品制备：描述供试品制备过程（主要为每个样品的取样部位及用量）。
6.2试验组：取装量为 ml硫乙醇酸盐流体培养基，接种规定的供试品量（同6.1），并接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌；大肠埃希菌、生孢梭菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉按照上述步骤操作，其中大肠埃希菌、生孢梭菌加入硫乙醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉加入胰酪大豆胨液体培养基。
6.3对照组：取装量为 ml硫乙醇酸盐流体培养基3管，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、生孢梭菌；取相同装量的胰酪大豆胨培养基3管，分别接种小于100cfu枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉。
无菌检查法-2015版中国药典-电子版
无菌检查法-2015版中国药典无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药品、生物制品、医疗器具、原料、辅料、及其他品种是否无菌的一种方法。
若供试品符合无菌检查法的规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
无菌检查应在环境洁净度B 级背景下的局部A 级洁净度的单向流空气区域内或隔离系统中进行，其全过程应严格遵守无菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。
单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行洁净度确认。
隔离系统应定期按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。
日常检验还需对试验环境进行监控。
无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。
培养基硫乙醇酸盐流体培养基主要用于厌氧菌的培养，也可用于需气菌培养；胰酪大豆胨液体培养基适用于真菌和需气菌的培养。
培养基的制备及培养条件培养基可按以下处方制备，亦可使用按该处方生产的符合规定的脱水培养基。
配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的环境，若保存于非密闭容器中，一般在3周内使用；若保存于密闭容器中，一般可在一年内使用。
1. 硫乙醇酸盐流体培养基酪胨 (胰酶水解) 15.0g 酵母浸出粉 5.0g葡萄糖 5.0g 氯化钠 2.5gL-胱氨酸 0.5g 新配制的 0.1% 刃天青溶液 1.0ml硫乙醇酸钠 0.5g 琼脂 0.75g(或硫乙醇酸) （ 0.3 ml) 纯化水 1000ml除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调节pH 为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调节pH 值使灭菌后为7.1±0.2。
分装至适宜的容器中，其装量与容器高度的比例应符合培养结束后培2养基氧化层（粉红色）不超过培养基深度的1/2。
灭菌。
在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否则，须经100℃水浴加热至粉红色消失（不超过20 分钟），迅速冷却，只限加热一次，并防止被污染。
2015版药典无菌检查法与微生物鉴定
μm
A级 3520准(1)
浮游 菌 cfu/ m3
沉降 表面微生物
菌 接触碟 （f9 / 0mm）（f55 cfu mm） /4h(2) cfu /
5指手 套 cfu /手 套
<1 <1 <1 <1
B级 3520
29
352000 2900
10 5
5
5
C级 352000 2900 3520000 29000 100 50 25
2015版中国药典通则
9203 药品微生物实验室质量管理指导原则 9205 药品洁净实验室微生物监测和控制指导原则 9206 无菌检查用隔离系统验证指导原则
GMP2010年版对洁净度的规定及确认标准
悬浮粒子最大允许数/立方米
洁 静态 净
动态
度
级 ≥0.5
≥5.0 ≥0.5
≥5.0
别 μm
μm μm
比较项目
检验条件规定 人员要求 培养基、培养 条件与时间
培养基灵敏度 检查与方法验 证用菌株 检验方法 稀释剂与薄膜 过滤冲洗液
结果判断与复 试规定
ChP2010
USP35
EP7.0
总体10000级、局部100级
应在无菌条件下进行。
应在无菌条件下进行。
具备微生物专业知识，并经过无 经培训和认可 菌技术的培训
经培训和认可
硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃；20～25℃(三部 ）
改良马丁培养基 23～28℃
均培养14天，
转种后细菌培养2天、真菌培 养3天
硫乙醇酸盐流体培养基 30～35℃ 胰酪大豆胨液体培养基
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于4天
药品无菌检查ppt课件
药品无菌检查法
• 混悬液等非澄清水溶液供试品 取规定量， 等量接种至各管培养基中
• 固体供试品 取规定量，直接等量接种至各 管培养基中，或加入适宜的溶剂溶解，或 按标签说明复溶后，取规定量等量接种至 各管培养基中。
• 非水溶性供试品 加入适量的乳化剂及稀释 剂使其乳化再接种，或直接接种至含乳化 剂的培养基中
取流乙醇酸盐流体培养基（不少于15ml）6管， 分别加入金葡、大肠、生孢各2管，其中一管 接入供试品，另一管作为对照，TSB（不少于 10ml）6管，分别加入枯草、白念、黑曲各2 管，其中一管加入供试品，另一管作为对照， 培养时间不得超过5天。
结果判断：
与对照管比较，试验组的试验菌生长良好， 则说明供试品的该检验量在该检验条件下
2、直接接种
药品无菌检查法
• 薄膜过滤法 • 试验组：取每种培养基规定接种的供试品
总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一 次冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。 将培养基加至滤筒内。
• 对照组：另取一装有同体积培养基的容器， 加入等量试验菌，培养时间不得超过5天。
药品无菌检查法
• 直接接种法
药品无菌检查法
• 特点
• 无菌检验结论为一次性，药典规定为不 得复试，为什么不得复试，菌落的分布 具有不均匀性，检验过程是破坏性的， 不具有重复性。---------------对操作过程的 要求非常高。
• 过程的控制----------1、环境控制；2、操 作影响，人员、物流是否引入外源性污
过程控制
以润湿滤膜
• 油类供试品的滤膜和滤器在使用前应充分 干燥
• 冲洗量一次一般为100ml，总冲洗量不得超 过1000ml，以免膜上的微生物受损。总冲
2015版《中国药典》无菌、洁净室测定
2010 版
1.接种金黄色葡萄球菌、铜绿 假单胞菌、枯草芽孢杆菌新鲜 培养物 ----至营养肉汤培养基或营养 肉 汤琼脂培养基上 2.接种生孢梭菌的新鲜培养物 ----至硫乙醇酸盐流体培养基 中 3.接种白色念珠菌的新鲜培养 物 ----至改良马丁培养基中或改 良马丁琼脂培养基上 4.接种黑曲霉的新鲜培养物 ----至改良马丁琼脂斜面培养 基上
1
2
无菌检查的起源 无菌检查的发展历史 无菌检查法的发展宗旨
3
与静脉输液的起源和应用有关
——1665年，欧洲勃兰登堡候国御医约翰▪西吉斯 蒙德▪埃尔斯霍尔茨发表了《新灌药法及其方式方 法》 ——1831年，西欧霍乱肆虐，为了拯救在死亡线 上挣扎的病人，苏格兰医生赖特大胆启用静脉输 液疗法，他将大量煮沸过的食盐水静脉输注给霍 乱病人使大部分病人得救。 ——赖特在实践中观察到了输液产生的“注射热” ——随着显微镜的发明和微生物的发现，人们开始 了输液无菌检查的研究。
3.以国际发展趋势为主导，遵照2015年版药典编制大纲要求， 最终以二部为基础，在检验数量、检验量、阳性对照样品量、 阳性对照试验方法、培养温度等方面互相兼顾，作原则性要求 而不作具体细则规定。致力于今后逐步统一完善。
局限性
微生物污染可以发生在生 产、储存、运输、货架、 使用等环节 任何时段， 产品中微生物的污染可以 是不均匀的。
8
比较项目
实验环境要求
2010
总体1000级、局部100级
USP35
应在无菌条件下进行
EP7.0
应在无菌条件下进行
人员要求
培养基、培养 条件与时间
具备微生物专业知识，并经过 无菌技术培训
均培养14天， 转种后细菌培养2天、真菌培养3 天
2015版药典无菌检查法与微生物鉴定
Fluid Thioglycollate Medium 硫乙醇酸盐流体培 养基
培养需氧、厌氧和微需氧微 生 培养需氧、厌氧和微需氧微 生 培养需氧、厌氧微生物
物（主要是厌氧菌）
物（主要是厌氧菌）
14天于30-35 °C及20-25 °C
Pancreatic Digest of Casein(胰酪蛋白胨)....................15.0 g Yeast Extract(酵母浸出粉) ..................................5.0 g
豆木瓜蛋白酶消化物
浸出粉…….…2.0g
白酶水解物
………………………………….3.0g 葡萄糖…………....20.0g 磷 „„„„„„„„„3.0g
氯 化 钠 …..…………….…….…5.0g 酸氢二钾………..1.0g
氯化钠 „„„„„„5.0g
磷 酸 氢 二 钾 …………………....2.5g 硫酸镁 一水葡萄糖……………….……2.5g (MgSO4.7H2O)….0.5g
20～25℃ 培养不少于14天 转种后培养不少于7天
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌 、黑曲霉
只要供试品性状允许，应采用薄 膜过滤法
1、0.1％蛋白胨水溶液； 2、pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 3、其他经验证过的溶液
性状允许的样品采用薄膜过滤 ，利于抗菌影响去除
1．0.1%蛋白胨水溶液； 2．0.1%蛋白胨水溶液＋1ml 吐温80 3．动物组织消化液＋牛肉浸 膏＋吐温80
05g胰酪胨?????170g大豆木瓜蛋白酶水解物?????????30g氯化钠??????50g磷酸氢二钾?????25g葡萄糖无水葡萄糖???????25g23g目的支持广泛微生物的生长包括需氧菌专性和兼性厌氧菌真菌主要是用于培养真菌支持广泛微生物的生长包括需氧菌专性和兼性厌氧菌真菌主要是需氧菌培养条14天于3035c及202514天于3035c及20252010年版2015年版金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种到营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基金黄色葡萄球菌铜绿假单胞菌枯草芽孢杆菌大肠埃希菌的新鲜培养物接种到胰酪大豆胨液体培养基或胰酪大豆胨琼脂培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基白色念珠菌的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖液体培养基或沙氏葡萄糖琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂培养基黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基菌液制备用培养基的修订2010年版2015年版硫乙醇酸盐流体培养基
中国药典2015版无菌检查方法适用性试验（直接接种法）
中国药典2015版⽆菌检查⽅法适⽤性试验（直接接种法）*********公司*********产品⽆菌检查⽅法适⽤性试验1、样品信息2、培养基及试剂3、菌种基本信息：4、菌液制备：2.1接种⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物⾄胰酪⼤⾖胨培养基中或胰酪⼤⾖胨脂培养基上，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.2接种⽣孢梭菌的新鲜培养物⾄硫⼄醇酸盐流体培养基中，30～35℃培养18～24⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.3接种⽩⾊念珠菌的新鲜培养物⾄沙⽒葡萄糖液体培养基或沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养24～48⼩时，培养物⽤0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml 含菌数⼩于100cfu的菌悬液。
2.4接种⿊曲霉菌的新鲜培养物接种⾄沙⽒葡萄糖琼脂斜⾯培养基上，20～25℃培养5～7天，加⼊3～5ml含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液，将孢⼦洗脱。
然后，采⽤适宜的⽅法吸出孢⼦悬液⾄⽆菌试管内，⽤含0.05%（ml/ml）聚⼭梨酯80的0.9%⽆菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数⼩于100cfu的菌孢⼦悬液。
6、⽆菌检查直接接种法⽅法适⽤性试验6.1供试品制备：描述供试品制备过程（主要为每个样品的取样部位及⽤量）。
6.2试验组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基，接种规定的供试品量（同6.1），并接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌；⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌、枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉按照上述步骤操作，其中⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌加⼊硫⼄醇酸盐流体培养基，枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉加⼊胰酪⼤⾖胨液体培养基。
6.3对照组：取装量为 ml硫⼄醇酸盐流体培养基3管，分别接种⼩于100cfu的⾦黄⾊葡萄球菌、⼤肠埃希菌、⽣孢梭菌；取相同装量的胰酪⼤⾖胨培养基3管，分别接种⼩于100cfu枯草芽孢杆菌、⽩⾊念珠菌、⿊曲霉。
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（二）、无菌检查的特点和意义 由于抽样概率的限制，通过无菌检查发现产品 微生物污染的可能性极低，而当前坚持无菌检查的 意义在于： 产品上市前发现重大污染事件的最后一道关口； 通过无菌检查的执行情况可以窥视其无菌控制存 在的问题。
三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查的新理念 1.全过程控制
（二）中国药典无菌检查法的发展 1953年版 1963年版
直接接种 法 直接接种法 无阳性对照菌 三种培养基培养基 阳性对照－金葡
1977年版 培养基质量检查－金 葡、 白念。 阳性对照－金葡
培养基质量检查－藤黄、 生孢、白念。 2支（瓶） 或以上 直接接种法 4管+2管+1管 薄膜过滤法 膜剪4片，2+1+1 1990版－金葡10－6
2015版《中国药典》 无菌检查法
主要内容
一、药品无菌检查所面临的形势 二、无菌检查法的发展历史 三、无菌检查法的有关概念和新理念 四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订 五、2015年版《中国药典》无菌检查法 六、医院制剂进行微生物控制的必要性
一.药品微生物检验所面临的形势
1.医药产品的发展 2.注射用药品的挑战 3.药品微生物污染的反思 4.2015版中国药典的修订
12Biblioteka 三、无菌检查法的有关概念和新理念
（一)、 无菌检查法的有关概念
5、无菌技术 是指在微生物试验工作中，控制或防止 各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施， 其中包括无菌环境设施、无菌试验器材及无菌操作。 6、无菌检查法的局限性 若供试品符合无菌检查法的
规定,仅表明了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。也 就是无菌试验并不能用于保证整批产品的无菌性，但是它可 用于确定批产品不符合无菌要求。
四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订
1、实验环境的重大修订 2、培养基体系的重大修订 3、一、二、三部药典附录的整合修订。
四、2015年版《中国药典》无菌检查法的重大修订
3、一、二、三部药典附录的整合修订
（1）原《中国药典》三部的规定 生物制品无菌检查法规定样品接种硫乙醇酸盐流体培养 基为双份，分别置30～35℃、 20～25℃两个温度培养。以致 在取样量、检验量、接种方式、培养温度、阳性对照试验等 方面存在与二部不一致的规定。 （2）国际上生物制品无菌检查法没有作出特殊的规定。
实验环境； 培养基； 方法验证； 检验数量、 检验量； 检验方法； 培养时间； 结果判断； 一次检出。 加强应用指导。 减少方法的局限性,保证 检验结果的可靠性；
不 断 发 展
发 展 宗 旨
提高方法的检出率； 加强检验的全过程控制；
三、无菌检查法的有关概念和新理念
（一)、 无菌检查法的有关概念 （二）、无菌检查的特点和意义 (三)、无菌检查的新理念
（二）、无菌检查的特点和意义
抽样检查是无菌检查的特点 当污染率为0.1%时，抽样20支进行无菌检查，通 过无菌检查的可能性为98%. 即当污染率为0.1%时， 要有95%以上的可信度检出其无菌不合格，需至少检 验3000件。——检出的难度 抽样、破坏性检查的特点决定无菌检查只能采取 一次性检查结论，这让无菌检查非常困难！
二、无菌检查法的发展历史
（一）、国外药典无菌检查法的发展 （一）、中国药典无菌检查法的发展 （三） 、无菌检查法的发展宗旨
（一）国外药典无菌检查法的发展
1925年 1932年 1936年 1950年 1957年 1963年 1965年 1971年 1978年 1988年 1998年 2000年 2005年 英国首先使用直接接种法。 英国药典推荐使用直接接种法。 美国药典采用直接接种法。 美国药典推荐两种培养基用于需、厌气菌和真菌培养。 美国FDA和MILLIPORE公司推荐抗生素的无菌测试采用薄 膜过滤法。 英国药典收载薄膜过滤法。 美国药典对于非抑菌性药品引用薄膜过滤法。 欧洲药典第二版参照薄膜过滤法。 欧洲药典修订版推荐使用薄膜过滤法。 美国FDA规定不符合规定的样品不再复试。 英国药典规定无菌检查一次检出。 美国药典24版规定无菌检查一次检出。 ICH / PDG 的协调完成统一，保持一致。
收载封闭式过滤器
出厂－达30个/ 每种培养基 上市11支（瓶）、大容量5瓶、抗6支（瓶）
（二）中国药典无菌检查法的发展 2005年版
1、10000下局部100级，隔离系统 2、培养基适用性检查 3、方法验证试验 4、优先用封闭式薄膜过滤器 5、增加稀释液冲洗液品种。 9、延长培养时间为14天。 10、对表1 强调了“每种培养基最少检验数量”。 11、取消复试。
1985版 1990版
基本相同
85版阳性对照菌金葡1：1000
（二）中国药典无菌检查法的发展
培养基灵敏度检查－藤黄、 生孢、白念。 阳性对照：金葡10－6 ；生孢10－6 ；白念10－5 实验环境为100级洁净度，验证
1995版
1998年增补本 2000年版
阳性对照：金葡、生孢、白念均10 ～100个菌 抑细菌和抑真菌试验
环境保证 培养基保证 灵敏度检查 无菌性检查
SOP操作 过程控制
有效的方法
方法验证
有效的结果 结果判断 可靠的结论
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三、无菌检查法的有关概念和新理念
(三)、无菌检查新理念 2、实验者由严格按照标准检验,向依据统一的 原则，选择适宜的方法检验转变。 3、新方法与新技术掌握和应用 4、偏差调查与趋势分析
（二）中国药典无菌检查法的发展 2010年版主要变化： 1、对无菌检查人员提出专业要求和培训。 2、增加了可选用其它经验证的稀释液、冲洗液。 3、方法验证试验－菌：金、大、桔、生、白、黑。 ４、总冲洗量不超过1000ml。 强调检验的过程控制，保证检验结果的准确性。
二、无菌检查法的发展历史
（三） 、无菌检查法的发展宗旨
三、无菌检查法的有关概念和新理念 （一)、 无菌检查法的有关概念
1、无菌 是指某一物体或某一环境中不含有活的微生物。 用于检查药典要求无菌的药品、生物制
2、无菌检查法
品、医疗器具、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方法。 3、无菌操作 是指在无菌环境条件下，在对无菌制品或
无菌器械等进行检验的过程中，能防止微生物污染与干扰的 一种常规操作方法。