蓖麻BCH基因的克隆与序列分析

蓖麻BCH基因的克隆与序列分析

冯紫洲;李平;张继星;陈永胜

【摘要】β-carotene hydroxylase(beta-carotene hydroxylase, BCH)is an anabolic plant carotenoid key enzyme, has important significance in plant resistance to environmental stress. Using RACE Technique to obtain 3' region and 5' region. Design the whole primer to obtain the whole sequence of BCH. The results showed:The gene coding re-gions consists of 912 bp, which can encode 303 amino acids. The BCH has 10 typical conserved histidine sites(h)ofβ-carotene hydroxylase protein. It belongs to the transmembrane protein. Campared the BCH with otherβ-caro-tene hydroxylase protein, it has high homology coincident index reached

73.43%.%β-胡萝卜素羟化酶（beta-carotene hydroxylase, BCH）是植物类胡萝卜素合成代谢中的关键酶，在植物抵抗逆境环境方面具有重要意义.利用RACE方法克隆了蓖麻BCH基因的3'端和5'端片段.最后设计全长引物获得蓖麻BCH全长序列.结果表明：蓖麻BCH基因的编码区的核苷酸数为912bp，推测编码303个氨基酸；具有典型的β-胡萝卜素羟化酶蛋白的10个保守的组氨酸位点（h）；属于跨膜蛋白.蓖麻BCH蛋白与其它植物的β-胡萝卜素羟化酶蛋白有较高同源性，一致指数达73.43%.

【期刊名称】《内蒙古民族大学学报（自然科学版）》

【年(卷),期】2016(031)005

【总页数】8页(P408-415)

【关键词】蓖麻;RACE;β-胡萝卜素羟化酶;克隆

【作者】冯紫洲;李平;张继星;陈永胜

【作者单位】内蒙古民族大学农学院，内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学生命

科学学院，内蒙古通辽 028043;内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽028043;内蒙古民族大学生命科学学院，内蒙古通辽 028043

【正文语种】中文

【中图分类】Q78

蓖麻（Ricinus communis L.）是大戟科（Euphorbiaceae）植物的一种，籽粒中油脂含量可达50%以上，因其含油量极高而被作为世界十大油料作物之一〔1〕.

蓖麻的各个组织器官都有丰富的工业用途〔2〕，如叶片可以养蚕；茎秆可以造纸；脱毒的蓖麻饼粕可以制成植物高蛋白饲料；蓖麻油更是生产高级润滑油的原料.因此，蓖麻产业受到越来越多的关注〔3,4〕.

β-胡萝卜素羟化酶（beta-carotene hydroxylase,BCH）是植物类胡萝卜素合成

代谢中的关键酶，催化β-胡萝卜素经中间产物β-隐黄素（β-cryptoxanthin）合

成一种玉米黄素（zea-xanthin）.强光胁迫下植物过量吸收光能时，玉米黄素能够促使植物以热能等形式释放多余的能量，抑制单线态活化氧的生成，防止光氧化对植物细胞的破坏，起到光保护的作用〔5〕.β-胡萝卜素羟化酶基因（BCH）的表达，影响着植物的抗逆性.如Lagarde等〔6〕得到了过表达该基因的蓝藻，章丽等〔7〕获得了过表达基因的盐生杜氏藻，Davison等〔8〕研究了过表达该基因的拟南芥植株，这些转基因植物抵抗强光、紫外线和高温等非生物胁迫的能力得到明显提高.许峰等〔9〕对转盐生杜氏藻BCH基因烟草的耐盐性做了较为系统地研究，发现

转基因烟草的耐盐性得到了显著提高，表明BCH基因在植物抵抗盐胁迫方面也起

着重要作用.植物BCH基因的克隆及功能研究，为进一步阐明该基因的作用机理奠定了基础，为提高作物的抗逆性提供了新的思路.

本试验利用RACE方法克隆了蓖麻β-胡萝卜素羟化酶基因，系统地对该基因进行生物信息学分析，详细地了解其蛋白生理生化性质.克隆和分析这一基因为我们研究蓖麻BCH基因结构功能方面的应用创造条件，为提高蓖麻抗逆能力提供可能，具有一定的实践意义.

1.1 材料

蓖麻种植于内蒙古民族大学工程训练中心516室，品种为通蓖5号，取新鲜叶片为供试材料.

1.2 方法

1.2.1 蓖麻叶片总RNA的提取

使用改良的Trizol提取法提取总RNA〔10〕，几乎没有DNA和蛋白质的污染，其纯度较高而具有较好的效果.

1.2.2 3'RACE扩增

根据其他植物上的BCH蛋白的保守序列设计，设计3'RACE简并引物：BMBCH3'-1：5'-TWTTRTNGGYAGMTGGMGKGYGGA-3'

（V=C/G;W=T/A/C;R=T/A;Y=C/G/A;B=C/G/T）.反应按照3'-Full RACE Core Set with PrimeScript™RTase（6106,Takara）试剂盒说明书进行.使用3'RACE Adaptor（来自3'-Full RACE Core）为反转录引物进行反转录，反应条件：42℃60m in；70℃15min；4℃保存.第一轮PCR利用引物BMBCH3'-1和

3'RACE Outer Primer（来自3'-Full RACE Core），反应条件：94℃3min；94℃30s, 55℃40s,72℃60s,20个循环；72℃10min；4℃保存.第二轮PCR利用引物BMBCH3'-1和3'RACE Inner Primer（来自3'-Full RACE Core），反应条件：94℃3min；94℃30s,58℃40s,72℃60s,30个循环；72℃10min；4℃保存.