粪大肠菌群操作细则精编版
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠菌群的测定步骤
粪大肠菌群的测定1、半个月前配好初、复发酵所需培养液2、采样时用500ml 广口玻璃瓶分开采样，牛皮纸封口3、操作（1） 培养液初发酵 单倍乳糖蛋白胨培养液：蛋白胨 10 g牛肉浸膏 3 g乳糖 5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml调节PH 为7.2—7.4（NaOH ）6%溴甲基紫乙醇溶液 1 ml 充分混匀后 10ml （三倍是5ml ）分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
单月13个地表水（每个水样需10个单倍，5个三倍），2个创业（每个水样需15个单倍）。
共190个（1900ml ）单倍，65个三倍（325ml ）。
双月10个地表水，2个创业。
共130个（1600ml ）单倍，50个三倍（250ml ）。
创业的水一个月采两次水样复发酵 EC 培养液胰胨 20 g乳糖 5 g胆盐三号 1.5 g磷酸氢二钾 4 g磷酸二氢钾 1.5 g氯化钠 5 g蒸馏水 1000ml充分混匀后 10ml 分装于试管中，盖紧塞于蒸气锅中灭菌20min （0.1—0.5kpa ），冷却后于药品储存箱保存。
三倍乳糖蛋白胨培养液： 蛋白胨 30 g 牛肉浸膏 9 g 乳糖 15 g 氯化钠 15 g 蒸馏水 1000ml 溴甲基紫乙醇溶液 3 ml（2）做样初发酵：地表水15根管为一个水样。
5根为一组。
第一排为5ml三倍培养液，加10ml水样；第二排为10ml单倍培养液，加1ml水样；第三排为10ml单倍培养液，取1ml水样稀释至10ml后再从中取1ml至装有培养液的试管。
（10、1、0.1的取样量）创业，每个水样15根单倍。
同上逐级稀释，取样量为0.1、0.01、0.001ml。
将初发酵管放入培养箱中培养，温度为37℃±0.5℃，时间为24h±2h。
观察：产酸产气为阳性，即变色且有气泡产生，可轻击试管查气泡。
复发酵：呈阳性的试管进行接种后，做复发酵。
粪大肠菌群的监测分析
1.粪大肠菌群粪大肠菌群是总大肠菌群中的一部分，用来表明水质受污染的程度，主要来自粪便。
粪大肠菌群是一类能使乳糖发酵、产酸产气的需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44.5 ℃培养24~48ｈ能发酵乳糖产酸产气。
通过对粪大肠菌群的监测，可了解水体受生活污水污染的状况。
粪大肠菌群适用于河流、湖泊等地表水、企业污水及医院废水的监测，是综合评价城镇污水，尤其是生活污水污染的一个必不可少的重要指标。
粪大肠菌群作为地表水环境质量标准唯一的一项微生物监测指标，我国多用多管发酵法进行检测，近几年也更新了好几个相关环境标准。
２样品的采集和保存2.1 采样瓶的准备和存放采集粪大肠菌群的采样瓶需要用牛皮纸封包好后，再经过高压灭菌器灭菌才能使用。
灭菌后的采样瓶里如果含有少量冷凝水，可以放在烘箱里烘干。
有条件的单位，也可以使用无菌采样瓶。
灭菌后的采样瓶也有其保存期，超过两周内未使用就必须重新灭菌。
绝大部分实验室都是在首次灭菌后不再管其使用期限。
采样瓶存放过久可能受到杂菌污染。
2.2 样品采集采样人员大多缺乏细菌学监测知识，出现很多采样不规范的现象。
如：微生物项目水样和理化水样混采；灭菌瓶开盖时间过早、水样在空气中暴露时间过长；水样采集量过满（既容易导致水样中细菌缺氧死亡，又不利于水样检测前振荡摇匀）；微生物样品和其他理化项目同时采样时，没有做到细菌样品优先采集；采样人员在采集样品时，没注意避免采样瓶受杂菌污染（手接触到瓶盖和瓶颈、采样设备不规范）。
2.3 样品运输保存在样品的运输和保存过程中，样品的冷藏是关键（温度过高过低都不利于样品的保存）。
由于仪器设备条件不够，运输过程不满足样品所需温度或者路途遥远，送检时间超过６ｈ，都会导致样品失效。
样品交接时间过长（在样品送入实验室之后，采样人员要将采样记录移交给业务室，然后由接样员对水样进行编号并将检测任务下发到监测室），导致样品没有及时分析而超过时限。
特别是，在执法监测和污染源监督性监测中，需要的采样时间长，有时还需要分时间段监测，这过程很容易造成样品超时。
粪大肠菌群操作细则
粪大肠菌群操作细则1.合理饮食饮食是维持肠道健康的关键。
建议遵循均衡饮食原则，多摄入蔬菜、水果、全谷物等富含纤维的食物。
纤维是粪大肠菌群的重要营养源，可以帮助肠道蠕动、促进粪便排出。
2.避免过度清洗在日常生活中，应避免过度清洗食物和餐具，尽量保留一些细菌。
正常的粪大肠菌群对人体有益，可以帮助调节免疫系统、抵抗病原菌的入侵。
3.避免滥用抗生素抗生素的滥用会破坏肠道中的微生物平衡，导致粪大肠菌群的丢失。
在使用抗生素时，应根据医生的建议正确使用，并在使用完毕后补充益生菌保护肠道。
4.添加益生菌益生菌是指对人体有益的细菌，可以帮助维持肠道健康。
可以通过服用含有益生菌的乳酸菌饮品或益生菌制剂来补充肠道菌群。
常见的益生菌包括嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等。
5.减少应激应激状况下，人体分泌的皮质类固醇会抑制肠道免疫功能，导致粪大肠菌群失调。
建议减少应激，保持身心放松。
6.远离不洁环境维持良好的个人卫生习惯，避免接触不洁环境，减少病原菌的入侵。
同时，定期清洁居住环境，保持空气流通。
7.检测肠道菌群通过检测肠道菌群，可以了解自身肠道菌群的情况，判断是否失调，并采取相应措施调整。
目前有很多机构提供肠道菌群检测服务。
8.定期运动适当的运动可以促进肠道蠕动，增强肠道蠕动功能。
建议每天坚持适量的有氧运动，如散步、慢跑等。
9.合理应用益生元益生元是指可以促进益生菌生长繁殖的物质，常见的益生元包括低聚果糖、低聚半乳糖等。
适量补充益生元可以提供营养物质，促进益生菌的增殖。
10.养成良好的生活习惯良好的生活习惯对维持肠道健康至关重要。
保持规律的作息时间，充足的睡眠，以及养成良好的饮食习惯，将有助于保护肠道菌群的平衡。
总之，合理饮食，合理应用抗生素，添加益生菌和益生元，减少应激，养成良好的生活习惯等都是维持粪大肠菌群健康的重要细则。
在日常生活中，我们应该加强对肠道菌群的重视，保持肠道的健康。
大肠杆菌操作细则
大肠菌群测定的操作细则大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。
食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
1 设备和材料1.1 温箱：36±1℃。
1.2 冰箱:0～4℃。
1.3 恒温水浴:44.5±0.5℃。
1.4 天平。
1.5 显微镜。
1.6 均质器或乳钵。
1.7 平皿:直径为90mm。
1.8 试管。
1.9 吸管。
1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。
1.11 玻璃珠:直径约5mm。
1.12 载玻片。
1.13 酒精灯。
1.14 试管架。
2 培养基和试剂2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。
2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。
2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。
2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。
2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。
2.6 生理盐水。
2.7 革兰氏染色液:按GB 4789.28中2.2规定。
3 操作步骤3.1 检样稀释3.1.1 以无菌操作将检样25mL(或g)放于有225mL灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内(瓶内予置适当数量的玻璃珠)或灭菌乳钵内,经充分振摇或研磨做成1:10的均匀稀释液。
固体检样最好用均质器,以8 000-10 000 r/min的速度处理1min,做成1:10的均匀稀释液。
3.1.2 用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水或其他稀释液的试管内,振摇试管混匀,做成1:100的稀释液。
3.1.3 另取1mL灭菌吸管,按上条操作依次做10倍递增稀释液,每递增稀释一次,换用1支1mL灭菌吸管。
3.1.4 根据食品卫生标准要求或对检样污染情况的估计,选择三个稀释度,每个稀释度,接种3管。
粪大肠菌群操作步骤及准备工作
粪大肠菌群操作步骤及准备工作一、准备工作：玻璃器皿灭菌：1、在热水中加入洗涤液刷洗试管及塞子，至少准备60支试管。
2、清洗10ML、1ML、0.1ML刻度吸管各2支。
3、500ML或250ML细口采样瓶2个,盖上瓶塞并用报纸包住瓶口。
把以上三种玻璃器皿放置烘箱调至温度达160-170℃，烘2小时，关机后待温度降至50℃方可拿出物品，防止遇冷空气爆裂。
注：1、2项需预先用报纸包住，再放置烘箱灭菌。
灭菌前需在采样瓶中加入0.3ML10%硫代硫酸钠溶液,以去除氯。
试剂配配制：1、配250ML单倍乳糖胆盐蛋白胨培养液。
（按说明配制，试剂瓶上有）2、配250ML三倍乳糖胆盐蛋白胨培养液。
（按说明配制，试剂瓶上有）3、配250ML EC肉汤培养液。
以上试剂配制完毕后分装于定量加液器中，试剂1移至10ML的定量加液器中，把加液器刻度调至10ML；试剂2移至5ML的加液器中，把加液器刻度调至5ML；试剂3移至10ML的定量加液器中，把加液器刻度调至10ML。
水样分析步骤：1、于20支试管中分别加入10ML试剂1，于10支试管中分别加入5ML试剂2，于15支试管中分别加入10ML试剂3，塞好塞子再用报纸把试管包好放在烧杯中置于灭菌器灭菌15-20分钟，自然冷却后取出，暂没用的试剂放置冰箱中保存。
2、于各装有5ML三倍乳糖胆蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管），分别加入10ML水样，于各装有10ML单倍乳糖胆蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管），分别加入1ML水样，于各装有10ML单倍乳糖胆蛋白胨培养液的5支试管中（内有倒管），分别加入0.1ML水样，共计15管,三个稀释度,将各管充分摇匀后,置于37℃培养箱中培养培养24小时。
3、经初发酵后观察现象，如水样呈黄色且有气泡，即产酸产气，需进行复发酵，若呈紫红色则显阴性，不需进行复发酵。
选出产酸产气的管，按稀释倍数排列好，再用经过酒精灯灼烧的接种环插入显阳性的管中搅动一下水样，然后放入已装有EC肉汤的培养液中再搅动一下，即可把菌种转移到复发酵的培养液中，每接种一次样均需灼烧一下接种环，依上操作把所有显阳性的水样均接种到培养液中，盖好瓶塞，置于44.5℃的培养箱中培养24小时后观察现象。
水质粪大肠菌群操作注意事项 作业指导书1
水质粪大肠菌群的测定多管发酵法作业指导书本试验基本操作参照《HJ/T 347--2007 水质粪大肠菌群的测定多管发酵法和滤膜法（试行）》制定此作业指导书。
1.培养基、试剂与仪器本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水；操作者必须建立“无菌概念”和掌握“无菌操作技术”，所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌，试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。
单倍乳糖蛋白胨培养液：称取23.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的玻璃倒管（杜氏小管）的20x200mm试管中，每试管10ml（注意玻璃倒管中不能有气泡，若出现气泡，可用手指轻弹玻璃管）塞紧塞子，置于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
三倍乳糖蛋白胨培养液：称取69.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中（注意煮沸步骤可能糊底，也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代），其它操作同上。
EC培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管10ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
伊红美蓝培养基：称取36.0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，分装于三角烧瓶中。
于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用。
生理盐水：在烧杯中配制适量的质量分数为0.9%的生理盐水，分装于试管中，每试管9.5mL，于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用。
（本实验室中灭菌锅蒸发量为0.5mL）培养基的存放：在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
本实验室将培养基放置在4℃冰箱中保存。
实验所需仪器：超净工作台（有条件的实验室建议使用生物安全柜）、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500mL广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环等，详见附件。
总大肠菌群分析检测实施细则
总大肠菌群分析检测实施细则总大肠菌群分析检测实施细则粪大肠菌群是细菌中的一部分，是指一群在37℃ 培养2h能发酵乳搪、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽抱杆菌。
多管发酵法一、适用范围本标准规定了用多管发酵法测定生活饮用水及其水源水中的总大肠菌群。
本法适用于生活饮用水及其水源水中总大肠菌群的测定。
二、实验室所用设备、器皿1、无菌区工作台2、恒温培养箱3、高压蒸汽灭菌器4、冰箱5、酒精灯6、天平7、电炉8、采样广口瓶 9、烧杯、玻璃棒 10、玻璃发酵管 11、试管架 12、移液管 13、锥形瓶二、培养基（1）乳糖蛋白膝培养液乳糖蛋白胨培养液蛋白胨 10克牛肉浸膏 3克乳糖 5克氯化钠 5克溴甲酚紫乙醇溶液(16g/L) 1mL 蒸馏水 1000 mL制法：将蛋白陈、牛肉膏、乳糖及氯化钠溶于蒸馏水中，调整pH为7.2——7.4，再加人1 ml 16g/l的澳甲酚紫乙醇溶液，充分混匀，分装于装有倒管的试管中，68.95kPa (115℃，10lb）高压灭菌20min，贮存于冷暗处备用。
（2）二倍浓缩乳糖蛋白膝培养液按上述乳糖蛋白陈培养液除蒸馏水外，其他成分量加倍（3）伊红美蓝培养基A 蛋白陈 10gB 乳糖 10gC 磷酸氢二钾 2gD 琼脂 20g~30gE 蒸馏水 l000mlF 伊红水溶液（20g/l) 20mlG 美蓝水溶液（5g/L) 13m制法：将蛋白陈、磷酸盐和琼脂溶解于蒸馏水中，校正pH为7.2，加人乳糖，混匀后分装，以68.95kPa (115℃ ，10lb）高压灭菌20min。
临用时加热融化琼脂，冷至50℃ ～55℃ ，加入伊红和美蓝溶液，混匀，倾注平皿。
（4）革兰氏染色液4.1结晶紫染色液成分： a 结晶紫 1g b 乙醇（95%，体积分数） 20mL c 草酸钱水溶液（10g/l）80mL制法：将结晶紫溶于乙醇中，然后与草酸馁溶液混合。
注：结晶紫不可用龙胆紫代替，前者是纯品，后者不是单一成分，易出现假阳性结晶紫溶液放置过久会产生沉淀，不能再用。
粪大肠菌群检测方法作业指导书
粪大肠菌群检测方法作业指导书(多管发酵法)1、方法原理及适用范围多管发酵技术是以最可能数（most probable number，简称MPN）来表示试验结果的。
它是根据统计学理论，通过水样不同稀释浓度多组重复生物培养阳性结果估计水体中被测生物密度的一种方法，具体是通过查MPN表获得结果的。
适用于地表水、地下水及废水中粪大肠菌群的测定。
2、培养液和试剂2.1单倍乳糖蛋白胨培养液2.2三倍乳糖蛋白胨培养液2.3EC培养液2.4氯化钠3、样品测定3.1水样接种量将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一水样接种量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10ml、1ml、0.1ml。
受污染水样接种量根据污染程度接种1ml、0.1ml、0.01ml或0.1ml、0.01ml、0.001ml等。
使用的水样量可参考下表一。
水样种类检测方法接种量（mL）1005110.110-210-310-410-5井水多管发酵法×××河水、塘水多管发酵法×××湖水、塘水多管发酵法×××城市原污水多管发酵法×××如接种体积为10ml，则试管内应装有三倍乳糖蛋白胨培养液5ml；如接种量为1ml或少于1ml，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10ml 中。
3.2初发酵试验将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如有倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
3.3复发酵试验轻微震荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。
接种后所有发酵管必须在30min 内放进水浴中。
粪培养的标准操作规程
粪培养的标准操作规程
目录
1．目的 (2)
2．范围 (2)
3．责任人 (2)
4．依据 (2)
5．内容 (2)
1
1．目的
建立大便培养的标准操作程序，确保大便标本采集的正确性和规范性。
2．范围
怀疑肠道细菌或真菌感染，需进行大便的病原学检测及分型的患者。
3．责任人
专业负责人
4．依据
《神经科诊疗规范》
5．内容
粪培养是通过对粪便的病原学检测及分型来了解消化道功能是否健全、有无异常或局部感染病灶等，以指导临床诊断治疗。
5.1操作前准备
干净干燥的普通大便杯、直肠拭子、采便管。
5.2操作步骤
1)粪便标本于急性腹泻期及未使用抗生素之前取新鲜便，不可混人尿液。
2)采集标本时应用无菌竹签挑或棉签取粪便含有粘液或脓血部分，将大便
置于干净干燥的容器中，采集标本1小时内送检。
3)无粪便而又必须检查时，可经肛门指诊采集粪便，灌肠或服油类泻剂的
粪便因过稀或混有油滴而不适合作检查标本。
小心地将拭子通过肛门括
约肌插入肛门。
轻轻旋转拭子从直肠陷窝处取材。
尽量取到病变处。
2。
大肠杆菌操作细则
大肠杆菌操作细则大肠杆菌，学名为肠杆菌属（Escherichia），是一类常见的革兰氏阴性杆状细菌，是肠道中最重要的正常菌群之一、大肠杆菌的基因组结构简单，易于研究，所以被广泛应用于生物学和医学领域的研究。
下面是大肠杆菌操作的一些基本细则。
1.试剂准备使用纯净的生化试剂，并根据实验的需要进行配制。
2.菌液的制备在无菌条件下，选择合适的培养基，如LB培养基，加入适量的试剂，如琼脂糖，混合均匀后灭菌。
将所需菌株转接至含有适量培养基的无菌试管中，静置孵育一夜，最好在37摄氏度的恒温培养箱中培养。
3.菌液的保存将培养好的菌液进行冷冻保存，-80摄氏度保存效果更好。
同时，在每次冻存之前，应检测菌液的纯度和活性。
4.菌株的接种在接种大肠杆菌之前，首先要进行洗涤步骤，去除可能存在的外源性种菌。
取一株菌落转移到无菌培养基上，进行稀释操作。
选择适当的浓度的细菌悬液，在孵育过程中注意观察。
5.培养条件大肠杆菌适合在富含养分的培养基上生长。
常用的培养基有LB培养基、M9培养基等。
培养温度通常设定为37摄氏度，培养基的pH值为7.0。
培养器的摇床速度和通气量等参数也要根据实验需求进行调整。
6.无菌操作在进行大肠杆菌的操作时，要保持无菌状态，常用的方法有酒精灯消毒，超净工作台等。
使用无菌操作的工具，避免向周围环境带入细菌。
同时在操作过程中避免直接接触菌株，以减少外源性细菌的污染。
7.菌液的收获培养一定时间后，可根据需求收获大肠杆菌菌体。
使用无菌技术配制无菌离心管，用离心机将菌液离心，沉积菌体，去除上清液。
然后用冷PBS缓冲液洗涤菌体，最后可以按需求冻存或进行后续实验。
8.表达工具的利用大肠杆菌可以使用过表达工具进行外源蛋白的表达。
常用的表达载体有pET、pGEX等。
选择合适的载体，将目标基因插入表达载体中，再将重组载体转化入大肠杆菌中，在适合的培养条件下诱导表达。
9.检测菌落和纯度对于分离获得的大肠杆菌菌株，应进行菌落检测和纯度检测。
粪肠球菌检验操作规程
粪肠球菌检验操作规程1、质量标准来源：Q/ZOK006-20122、名称：粪肠球菌汉语拼音：Fenchang Qiujun3、检验过程3.1、感官：取本品适量，置于非太阳光直射条件下的明亮处，目视检测，本品色泽为灰白色至淡棕黄色，固体外观为粉状或颗粒状，略带腥味，无发霉变质、结块及异味、异臭。
；液体外观为淡黄色至淡棕黄色，无悬浮物。
3.2、成品粒度：精密称取本品100g，置于1.19mm金属丝编制筛中，手动或机械振摇10分钟，本品应100％通过1.19mm孔径的筛网。
3.3、水分：取本品1g，精密称定，置于经105℃烘干至恒重的扁形称量瓶中，在105℃条件下干燥至恒重，减失重量应不得过9.0%。
3.5、粪肠球菌：3.5.1、试剂和培养基3.5.1.1、稀释液：0.85%生理盐水经121℃高压灭菌20分钟3.5.1.2、MRS培养基：称取蛋白胨10.0g、牛肉粉5.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、吐温80-1.0ml、七水磷酸氢二钾2.0g、三水醋酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、七水硫酸镁0.2g、四水硫酸锰0.05g、琼脂粉15.0g，将上述各组分置于1000ml纯化水中，加热搅拌使溶解，调pH值为7.2，经121℃高压灭菌20分钟，在无菌条件下注入灭菌后的平皿中，每个平皿约注入15ml培养基。
3.5.2、检测方法：在无菌条件取样25g，置于含225ml灭菌稀释液的锥形瓶中，其中置玻璃珠数颗，振摇使样品完全分散于溶液中，即为1:10的稀释液；用移液器或灭菌吸管吸取1:10稀释液1ml，置于含灭菌稀释剂9ml的离心管（或试管）中，密封，摇匀；按上述稀释次序递次稀释至适宜的稀释倍数；取2-3个适宜稀释倍数离心管，用移液器或灭菌吸管吸取0.1ml，接种至MRS培养基平皿上，每个浓度接种两个平皿，使用灭菌后的涂布棒小心涂布接种液于培养基表面，涂布好的平皿盖好后室温静置15分钟，密封并倒置平皿于37±1℃培养箱中培养48±2小时观察。
粪大肠菌群计数(食品微生物学检验)
8.5 g 1 000.0 mL
4
称取 8.5 g 氯化钠溶于 1000 mL 蒸馏水中，121 ℃高压灭菌 15 min。
GB 4789.39—2013
A.4 1 mol/L NaOH
A.4.1 成分
NaOH 蒸馏水 A.4.2 制法 称取40g 氢氧化钠溶于1000 mL蒸馏水中。
40.0 g 1 000.0 mL
A.1.2 制法
将A.1.1 成分溶解于蒸馏水中，校正pH至6.8±0.2。分装到有玻璃小倒管的试管中，每管10 mL，121 ℃ 高压灭菌15 min。
A.2 EC肉汤（E.coli Broth）
A.2.1 成分
A.2.2 制法
胰蛋白胨或胰酪胨 3号胆盐或混合胆盐 乳糖 磷酸氢二钾（K2HPO4） 磷酸二氢钾（KH2PO4） 氯化钠 蒸馏水
5 检验程序
粪大肠菌群检验程序见图1。
1
检样 25g(mL)样品+ 225mL 稀释液，均质
GB 4789.39—2013
10 倍系列稀释
月桂基硫酸盐胰蛋白胨 (LST)肉汤
36℃±1℃48h±2h
不产气
产气
EC 肉汤
44.5℃±0.2℃24h±2h
不产气
产气
粪大肠菌群阴性管
粪大肠菌群阳性管
查 MPN 表
0
2
0
6.2
1.2
18
2
3
1
36
8.7
94
0
3
0
9.4
3.6
38
3
0
0
23
4.6
94
1
0
0
3.6
0.17
粪大肠菌群操作细则精编版
粪大肠菌群多管发酵法1、培养基、试剂与仪器本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
单倍乳糖蛋白胨培养液：称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。
注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。
），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
EC 培养液：称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
培养基的存放在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
验所需仪器超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤前期准备器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。
肥料中粪大肠菌群的测定----流程
肥料中粪大肠菌群的测定----流程肥料中粪大肠菌群的测定一：前期准备一次性帽子、口罩、脚套1，移液管{10ml 量筒100ml｝160℃，4h玻璃珠160℃，4h三角瓶160℃，4h培养皿160℃，4h2，乳糖胆盐发酵培养基（用于乳糖发酵）115℃，15min乳糖发酵培养基（用于复发酵）115℃，15min伊红美蓝培养基（用于分离培养）121℃，15min无菌水121℃，15min二：实验过程无菌条件下进行：10.0g固体样品/10ml液体样品↓三角瓶（带玻璃珠，90ml无菌水）1:10=10-1↓200r/min振荡30min↓吸取10-1—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:100=10-2 ↓吸取吸取10-2—5ml，加入45ml无菌水（提前准备）1:1000=10-3↓……依次稀释得到10-4，10-5等浓度稀释液（每个稀释度必须更换无菌移液管）↓选取三个连续适宜稀释液，分别吸取1.0ml加入到乳糖胆盐发酵管内（装有乳糖胆盐发酵培养基）（每一稀释度接种3支发酵管）↓培养箱45℃，24h↓不产酸，不产气，为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3结果：产酸，颜色变；产气，导管有气泡↓分离培养：从产酸产气或只产酸的发酵管中挑取发酵液在伊红美蓝培养基平板上划线↓培养箱36℃，18-24h↓证实实验：无菌落→实验终止→<3有菌落，进行革兰氏染色。
染色反应阳性者（紫色）→实验终止→<3染色反应阴性者（红色）为粪大肠菌群阴性↓革兰氏阴性无芽孢杆菌，则挑取同样菌落接种在乳糖发酵管中（装有乳糖发酵培养基）↓培养箱44.5℃，24h↓结果，不产气为粪大肠菌群阴性→实验终止→<3产气为粪大肠菌群阳性↓根据粪大肠菌群阳性发酵管数，查MPN检索表，得出每克（毫升）肥料样品中的粪大肠菌群数。
粪大肠菌群检验记录
取9ml生理盐水于标签为1:100的50ml锥形瓶中。
（2）LST溶液的配制：取LST7.1g加水100ml（双料），溶解至透明，
倒入10ml于3只标有1g的并放有聚气管的试管中;剩余溶液加一倍水配成单料倒入标有0.01g，0.001ml的6只试管中，每只10ml,并放有聚气管(试管要求180×18mm)。
粪大肠菌群检查实验记录
品名
批号
物料编码
规格
来源
取样日期
代表量
检验日期
报告日期
检验编号
检验依据
1、粪大肠菌群检验记录
仪器设备名称：电热恒温培养箱仪器设备型号：DHP-500
生理盐水的配制：8.5g氯化钠加1000ml蒸馏水溶解待用（121℃灭菌30min）。
（1）恒温培养箱：36℃±1℃。
（2）冰箱：2℃～5℃。
（5）初发酵试验：每个稀释度接种3管月桂基硫酸盐蛋白胨（LST）肉汤。
取1:10的稀释样1ml于标有0.1g的3只试管中，
取1:100的稀释样1ml于标有0.01g的3只试管中，
取1:1000的稀释样1ml于标有0.001g的3只试管中，
（6）BGLB溶液复发酵试验：配制BGLB溶液，称取BGLB 4g溶液100ml水中，均分倒入对应产气标号的标有标示并放有聚气管的试管中，放入灭菌锅灭菌15min。用接种针粘一环产气管液于标有对应的以灭菌的BGLB溶液的试管中，于36℃的培养箱中培养48h
稀释度
接种量
产气情况
BGLB肉汤培养后产气情况
阴性对照
原液
0.1g（ml）
0.01g（ml）
0.001g（ml）
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粪大肠菌群多管发酵法
1、培养基、试剂与仪器
本标准所用试剂除另有注明外，均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水。
单倍乳糖蛋白胨培养液：
称取23.0g乳糖蛋白胨营养液于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每试管约8ml（先用移液管吸取7ml至试管中，再用滴管吸取营养液放至小玻璃管中，直至营养液溢出。
注意小玻璃管中不能有气泡，若出现气泡，应将气泡排出后再注入营养液。
），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
EC 培养液：
称取37.0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中，每管8ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液），于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
培养基的存放
在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处，存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。
当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。
验所需仪器
超净工作台、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500ml广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环2步骤
前期准备
器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）：所用采集水样的广口瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌。
广口瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸、报纸等防潮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
玻璃试管（已经装好营养液）、移液管、玻璃棒、接种环、移液枪枪头：用牛皮纸、报纸等防潮纸将其包裹好，置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15分钟。
采样：采取水样时，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10~15cm处，拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖，将采样瓶从水中取出。
如果没有水流，可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。
采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。
采好的水样，应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过
2h，否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。
4.2 水样接种量
将水样充分混匀后，根据水样污染的程度确定水样接种量。
每个样品至少用三个不同的水样量接种。
同一接种水样量要有五管。
相对未受污染的水样接种量为10mL、1mL、0.1mL。
受污染水样接种量根据污染程度接种1mL、0.1mL、0.01mL 或0.1mL、0.01mL、0.001mL 等。
使用的水样量可参考下表1。
(根据实验经验，经过紫外消毒的水样取0.1mL、0.01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。
)
表1 接种用水量参考表
如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL；如接种量为1mL 或少于1mL，则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
4.3 初发酵试验
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中。
在37℃±0.5℃下培养24h±2h。
产酸和产气的发酵管表明试验阳性。
如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。
4.4 复发酵试验
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。
在隔水式恒温培养箱中44.5℃±0.5℃温度下培养24h±2h。
培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
5、结果的计算
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目，从表2 或表3 中查得每升水样中的粪大肠菌群。
接种水样为100mL2 份、10mL10 份、总量300mL 时，查表2 可得每升水样中的粪大肠菌群；接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数，MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群。
如果接种的水样不是10mL、1mL 和0.1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量，也可查表3 求得MPN 值，再经下式计算成每100mL 的MPN 值。
6、接种过程
①接种前的准备工作
a．检查接种工具，进行环境消毒：提前半小时将无菌室的紫外灯对环境进行消毒，进入房间内关闭紫外灯。
实验开始前用75%医用酒精将台面和双手进行消毒）。
b．在欲接种的培养基试管上贴好标签，标上接种的菌名、操作者、接种日期等。
c．将培养基、接种工具和其他用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。
②初发酵接种
将移液枪调整至取样体积值，装上已消毒相应的移液枪枪头，分别取三个不同体积的水样至已灭菌消毒的装有单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中。
复发酵接种方法：斜面接种
③复发酵接种
将菌种试管与待接种的试管培养基依次排列，挟于左手的拇指与其他四指之间，用右手的无名指与小指和手掌边拔出棉塞并挟住。
置试管口于酒精火焰附近。
将接种工具垂直插入酒精火焰中烧红，再横过火焰3次，然后再放入有菌试管内，在管壁上停留片刻待其冷却。
取少许菌种置于另一支试管中，按一定的接种方式把菌种接种到新的培养基上。
取出接种工具，试管口和棉塞进行火焰灭菌。
（此操作要迅速，以免棉塞着火）
重新塞上棉塞。
烧死接种工具上的残余菌，把试管和接种工具放回原处。
表2 粪大肠菌群检数表
（接种水样100mL2 份、10mL10 份、总量300m）
表3 最可能数（MPN）表
（接种5 份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，不同阳性及阴性情况下100mL 水样中细菌数的最可能数和95％可信限值）。