实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
开菲尔粒中高产蛋白酶菌株的筛选及培养基优化
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实验十一 产蛋白酶菌株的筛选-2013
实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一、基本原理, 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
, 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
, 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
, 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶活大小。
二、实验目的, 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法, 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法三、实验器材1(菌株从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株2(溶液和试剂蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23酪氨酸，水等3(仪器和用品三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸四、操作步骤1. 培养基和试剂的配制(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶(2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
大庆师范学院本科生毕业论文蛋白酶产生菌培养条件的条件优化院(部)、专业生命科学学院生物技术研究方向微生物学学生姓名朱琳学号200901122598指导教师姓名张亦婷2013年06月01日摘要采用大庆师范学院生命科学学院花园附近土壤、农田土壤及体育场附近土壤作为样品，并从中筛选分离并得到产蛋白酶能力较高的菌株，经过初步鉴定该菌株属芽孢杆菌。
通过对其产酶条件进行优化，结果显示该菌产酶最佳碳源为质量浓度15g/L的乳糖，最佳氮源为质量浓度20g/L的尿素，最适初始pH值为6.5，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选；鉴定；蛋白酶；条件优化AbstractThe sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: carbon source is sucrose 15g/L; nitrogen source is Yeast extract 20g/L, the pH is 6.5; fermentation temperature is 35℃.Key words：Screening；Identified；Protease；Conditions optimization目录摘要 (1)Abstract (2)1 引言 ...........................................................................................................................................................2 材料与方法 (3)2.2.2 实验材料 (3)2.2.1 菌株筛选 (3)3.1 菌株筛选 (6)3.1.1 菌株的分离筛选 (6)2.3 条件优化 (7)2.3.1 不同碳源对产酶的影响 (7)2.3.3不同氮源对产酶的影响 (8)2.3.4 培养基不同初始pH值对产酶的影响 (9)2.3.5 不同温度对产酶的影响 (10)4 结论 (10)11 引言蛋白酶是催化蛋白质中肽键水解的酶，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性。
产碱性蛋白酶菌株的筛选
产碱性蛋白酶菌株的筛选碱性蛋白酶是在碱性范围内水解蛋白质肽键的酶类，一般最适pH值为9~11，属内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，主要用于加酶洗涤剂中，在制革、纺织、医药、化妆品等的生产中也有广泛的应用。
目前，全世界所生产的酶中碱性蛋白酶占到总产量的30%左右，显示出良好的使用性能和经济价值。
碱性蛋白酶广泛存在于细菌、放线菌和真菌中，其中以芽孢杆菌属的碱性蛋白酶研究的最深入。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，与动植物来源的碱性蛋白酶相比具有产酶量高，适合大规模工业生产的优点。
因此，微生物碱性蛋白酶被认为是最重要的应用型酶类。
本实验从盐碱地采集土样，从中分离出若干株产碱性蛋白酶的菌株。
培养基。
平板培养基( %) : 酵母粉1. 5，蛋白胨0. 5，氯化钠0. 5，琼脂1. 6，pH9。
分离培养基( %) : 酵母膏1. 5，脱脂奶粉0. 5，琼脂1. 6，pH9。
种子培养基%) : 葡萄糖1. 0，蛋白胨0. 5，酵母膏0. 5，KH2PO40. 1，MgSO40. 02，Na2CO31. 0，pH9。
土样采集。
选取采集地点地表植被根系周围的土壤，先除去地表浮土及植被根系，然后挖取深约5cm 的土壤样品。
样品处理。
将土样混合均匀，4℃冰箱保存。
菌株分离( 平板分离法)。
取10g土样装入90ml 无菌生理盐水的三角烧瓶中，100r /min 旋转摇床培养20min，取10 -3，10 -4，10-5稀释液分别涂布于平板培养基上，每个浓度涂布3 个培养皿。
37℃恒温箱倒置培养24h。
观察与保存: 培养24h、48h 后，挑选菌落形态、颜色不一致的菌落保存待用。
筛选采用平板划线法将保存的单菌落划线于分离培养基上。
37℃恒温培养箱中培养24h。
通过观察水解圈的大小初步判断菌株产酶能力的高低，挑选产生透明水解圈大的单菌落接2 环于装有5ml 液体发酵培养基的无菌试管中，30℃条件下旋转摇床培养24h。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文（设计）蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者：指导教师：蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟，刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院，甘肃庆阳745000)摘要：采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品，利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1，初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化，结果显示该菌最适培养时间为24h，最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖，最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏，最适初始pH值为6.0，最适发酵温度为35℃。
关键词：菌种筛选，鉴定，蛋白酶，条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions（College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China）Abstract：The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening，Identified，Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称，是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1]，也是目前世界上产销量最大的商业酶，其市场占有率约占整个商品酶销售量的60％，微生物蛋白酶从微生物中提取，不受资源、环境和空间的限制，具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件(
一株高产蛋白酶菌株的筛选及其产酶条件*林玩庄，林淑娜，陈汶聪，刘荣莲，黄可佳，黄丹敏，谢桂仁，陈宇豹，邓毛程，王瑶，李静广东轻工职业技术学院，广州，510300摘要：为了提高水产行业蛋白质资源的综合利用率，从南海海域大型鱼类的肠道中筛选蛋白酶高产菌株。
采用平板透明圈法和摇瓶发酵法进行筛选，获得一株蛋白酶高产菌株PE11。
通过菌体形态观察、生理生化实验和16S rDNA鉴定，菌株PE11被鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。
通过摇瓶发酵试验，优选出可溶性淀粉和牛肉膏分别为最佳的碳源和氮源，并确定菌株PE11产蛋白酶的最佳条件为：温度30 °C、初始pH7.0、转速200 rpm和时间36 h。
在最佳的产酶条件下，发酵液中的蛋白酶活力可达376 U/mL。
关键词：蛋白酶；高产；筛选；产酶条件Study on screening and enzyme-producing conditions of a highprotease producing strainLING Wan-zhuang, LING Shu-Na, CHEN Wen-cong, LIU Rong-lian, HUANG Ke-jia, HUANG Dan-min, XIE Gui-ren, CHEN Yu-bao, DENG Mao-cheng, WANG Yao, LI Jing(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300)Abstract：In order to improve the comprehensive utilization rate of protein resources from aquatic industry, strains having the ability to produce protease were isolated and screened from the gastrointestinal tract of large fish of South China Sea. Using flat transparent circle and shake flask fermentation test, a high producing protease strain PE11 was obtained. The strain PE11 was identified as Bacillus amyloliquefaciens through the systematic investigations of morphology, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequences analysis. By means of shake flask fermentation tests, the optimal carbon resource and nitrogen resource for strain PE11 were soluble starch and beef extract, respectively. In addition, the best conditions for protease-producing were determined as temperature of 30 °C, initial pH of 7.0 and rotation speed of 200 rpm. At the optimal condition, the highest protease activity of fermentation broth reached 376 U/mL.Key words：protease；high producing；screening；enzyme-producing condition*基金项目：广东高校特色调味品工程技术开发中心建设项目（GCZX-B1103），广东省教育部产学研结合项目（2012B091000040），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201307），广东轻工职业技术学院自然科学启动基金项目（KJ201203）。
微生物实验设计 产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
产蛋白酶菌株的筛选级分离一、实验原理自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈，水解圈与菌落直径的比值，常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
将腐烂的大豆浸泡液中的细菌接种在含有酪素的培养基上进行培养。
由于产蛋白酶菌株能在干酪素的培养基上形成无色透明圈，因此能将产蛋白菌株分离出来，分离出来的菌株经再次培养，就可获得纯种产蛋白酶的菌株。
二、实验器材1.菌种：从大豆浸泡液中获得2.培养基:(1)PDA斜面培养基：马铃薯200g，蔗糖20g,琼脂20g,水1000ml.马铃薯去皮，切成块，煮沸半小时后用纱布过滤，再加糖及琼脂，溶化后补水至1000ml，121℃灭菌30min备用。
（2）干酪素琼脂培养基：干酪素4.0g，用20ml 0.1mol/L NaOH溶液溶解后再加20g琼脂，加蒸馏水煮沸加水至1000ml 121℃灭菌30min备用。
3.试剂：无菌水。
4.仪器：天平，电磁炉，烧杯，无菌试管，无菌培养皿，高压灭菌锅，锥形瓶，接种环，涂布棒，酒精灯，恒温培养箱。
三、实验步骤1.将腐烂的大豆放入无菌水中浸泡，制成细菌悬浮液。
2.用涂布棒蘸取菌液接种于PAD培养基中，26℃培养48h。
3.倒置于酪素琼脂培养基平板上，37℃培养24h。
4.挑取培养好的菌落接种于平板上，28℃培养48h。
5.观察各菌落周围形成的透明圈的情况。
6.选取透明圈较大的三个菌落分别接种在干酪素琼脂培养基上，28℃培养48h。
7.观察受否为单菌落，若为单菌落且有透明圈，则为纯种产蛋白酶菌株。
若有杂菌，则需要重复步骤6，直到培养出纯菌为止。
参考文献[1]代玉梅.蛋白酶高产菌株的筛选鉴定及酶学性质研究[D].青岛:青岛大学,2008.[2]黄志强,林白雪,谢联辉.产碱性蛋白酶海洋细菌的筛选与鉴定[J].福建农林大学学报:自然科学版,2006,35(4):416-420.。
微生物学实验
实验十一产蛋白酶芽孢杆菌的分离（一）———芽孢杆菌的分离一、目的和要求1. 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的筛选方法。
2. 学习和掌握芽孢杆菌的分离技术。
二、实验原理芽孢杆菌于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
许多芽孢杆菌能分泌分泌蛋白酶，淀粉酶，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
三、实验器材1. 土壤样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶，腐烂稻草中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等(学生自取)。
家畜饲养、屠宰等动物性蛋白丰富的地点土壤中筛选高产蛋白酶菌株的概率更大，若条件许可，建议尽量选择这样的地点进行采样。
2. 牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml, 配制时，只加800ml，每个三角瓶分装180ml），15%脱脂奶粉溶液（脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06MPa,30min），铺平板前与加热溶化的肉汤蛋白胨培养基混合），盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒、1ml吸管（4支），10ml吸管（1支）和培养皿（10套），接种环等。
3. 水浴锅四、操作步骤1. 牛奶平板制备（4人/组）牛肉膏蛋白胨培养基（180ml）融化，待冷至55－60℃时，添加20ml无菌15%脱脂奶粉溶液混合均匀，配制终浓度为1.5%的牛奶牛肉膏蛋白胨培养基；到平板。
2. 土壤样品的处理将采集的土壤样品做成菌悬液（10-2）后置于80℃水浴中加热10～20分钟以杀死不能形成芽孢的菌体。
3. 稀释涂布分离法（1）制备样品稀释液称取10克土壤，放入盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20分钟。
蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定,原理
蛋白酶产生菌的筛选鉴定的原理是利用菌株产生的蛋白酶活性对菌落进行筛选和鉴定。
常用的方法有以下几种：
1. 筛选培养基法：将菌株接种在富含蛋白质的培养基上，待菌落形成后，置于一定条件下（如低温、酸碱pH变化、盐等），观察菌落周围是否出现蛋白质水解区域。
表现明显蛋白质水解区域的菌落可以认为是蛋白酶产生菌。
2. 培养基加酪蛋白法：将菌株接种在含有酪蛋白的培养基上，蛋白酶能够水解酪蛋白，会呈现明显的透明圈形成。
菌落形成后，利用这个特征可以筛选出蛋白酶产生菌。
3. 硫酸铜法：将菌株接种在富含酪蛋白的培养基上，在菌落周围加入硫酸铜溶液。
菌落产生的蛋白酶能使硫酸铜发生颜色变化（由蓝色变为紫色）或溶液变清晰，可以通过这种方法对菌株进行筛选和鉴定。
4. 特定基质代谢法：蛋白酶产生菌可以利用特定基质作为唯一碳源进行代谢，产生的酶能水解特定基质并产生反应产物。
利用这些反应产物的特性，可以利用化学或生物学方法进行分析和鉴定。
以上这些方法都是利用菌株产生的蛋白酶活性进行筛选和鉴定，以确定是否为蛋白酶产生菌。
这些方法灵敏度高、简单易行，
可以用于在大量菌株中筛选出蛋白酶产生菌，并对其进行鉴定和进一步的研究。
蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选
蛋白酶是一类能够水解蛋白质的酶，在许多领域具有广泛的应用价值。
下面是蛋白酶产生菌的分离鉴定及筛选的一般步骤：
1. 样品采集：
-从自然环境（如土壤、水源等）或已知含有蛋白质的样品（如食品、发酵物等）中采集样品。
2. 分离菌株：
-将样品经过适当的稀释和处理后，通过平板法、液体培养法等方式进行分离培养。
-可以采用选择性培养基，如蛋白质含量较高的培养基，以筛选出潜在的蛋白酶产生菌。
3. 蛋白酶活性筛选：
-根据蛋白酶的活性特点，可使用含有特定蛋白质底物的琼脂糖平板或液体培养基，筛选出蛋白酶活性高的菌株。
-观察菌落周围的透明圈（即蛋白酶产生的溶解区），判断菌株对蛋白质的降解能力。
4. 纯化与鉴定：
-从具有蛋白酶活性的菌株中选择一个或多个进行进一步的培养和纯化。
-使用生化方法，如SDS-PAGE电泳、酶活性测定等，鉴定蛋白酶的分子量、酶活性和特性。
5. 分子鉴定：
-对蛋白酶活性高的菌株进行16S rRNA或其他适用的基因序列分析，以确定其属于的菌属和物种。
6. 筛选优良菌株：
-结合蛋白酶活性、稳定性、产酶量等指标，筛选出蛋白酶产量高、酶性好的优良菌株。
值得注意的是，在进行分离鉴定及筛选过程中，需要严格遵守微生物实验室操作规范，采取必要的无菌操作和消毒措施，确保实验安全。
此外，还可以利用分子生物学技术对蛋白酶基因进行研究，以进一步了解蛋白酶的产生机制和调控方式。
产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定【文献综述】
文献综述生物科学产蛋白酶菌株的筛选与酶活力的测定摘要[摘要]本文主要按照实验设计步骤从海水中筛选出可以产蛋白酶的放线菌，并对获得的放线菌进行初步研究，如形态观察以及酶活力的测定。
从舟山沿海中分离得到几株产蛋白酶的放线菌，并通过酪蛋白平板培养基，水解酪蛋白试验可对菌株的产酶情况进行定性研究，酶活较高的菌株都能产生较大的水解圈。
对其中2株产酶活性较高的菌株进行了以酪蛋白为底物的紫外分光光度法进行酶活性的测定。
[关键词]：蛋白酶；分离纯化；透明圈；酶活力1蛋白酶的简介水解蛋白质肽键的一类酶的总称。
按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。
内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的肽。
外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶[1]。
按其活性中心和最适pH值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。
按其反应的最适pH值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。
工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。
根据蛋白酶对所作用的反应底物的选择性，一种蛋白酶仅能作用于蛋白质分子中一定的肽键。
种类很多，重要的有胃蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶等。
如胰蛋白酶催化水解碱性氨基酸所形成的肽键。
2蛋白酶的广泛应用蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。
例如，乳酸菌(lacticacidbacteria,LAB)是一大类能在可利用的碳水化合物发酵过程中产生大量乳酸的细菌，目前已知有200多种LAB[2]。
相当多的LAB是益生菌，其作为益生菌有如下依据：其属于肠道正常菌群，对人和动物的健康是有益的[3]。
在农业、兽医、医学以及食品工业[4、5]中是很重要的。
如果对产蛋白酶的乳酸菌种进行了筛选，并将所产的蛋白酶进行了分离纯化，就可以为酸奶的生产研制和微生态制剂的研发提供更优良的菌种。
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选
微生物实验设计-产蛋白酶菌株的筛选背景蛋白酶是一种具有很广泛的应用价值的酶类。
由于其在消化道营养吸收、生物反应器中的转化作用等方面均有重要的作用，因此蛋白酶的产生与筛选已成为当今生物技术领域中的研究热点之一。
尤其是在食品加工、污水处理、纤维素生物降解等领域，蛋白酶都有着非常广泛的应用前景。
因此，本实验拟通过对产蛋白酶的菌株进行筛选，找到高产蛋白酶的优良菌株。
材料与方法菌株的采集菌株采集方法：在集中饮水供应点，选择自然生长的水上植物为采样点，如睡莲、菖蒲、兰草等，具体点位由实验组决定。
采用无菌削皮刀在水上植物上擦拭，将擦拭物用无菌三角板置于室温营养物培养基上慢慢离心直至血清澄清。
取尽可能大的好的菌落转入入液氮甘油管中，经深冷保存。
后选取筛选菌落接种于琼脂板上。
菌株的鉴定先用生化方法进行初步鉴定，包括观察菌落形态、氧化酶试验和嗜酸性染色，确定分离菌株的生物学特性。
然后利用API系统和Biolog系统对鉴定的菌株进行进一步的鉴定，最终确定其菌种身份。
菌株的扩增将选出的菌株接种到含有碳源和氮源的液体培养基中进行预培养。
在预培养的基础上，将菌株接种到不同浓度的含有特定碳源和氮源的液体培养基中进行再培养，测定培养基中蛋白酶活性及菌株生长情况。
选择生长良好、活性高的优良菌株进行扩大培养。
菌株蛋白酶活性的检测制备含有特定底物的琼脂板进行蛋白酶活性的检测，通过观察菌落周围的荧光带，判断菌株产生的蛋白酶活性。
结果与分析通过菌株采集、鉴定、扩增和蛋白酶活性的检测，找到了多个高产蛋白酶的优良菌株。
本实验通过对菌株的筛选，找到了高产蛋白酶的优良菌株，为蛋白酶的产生与研究提供了重要的参考。
产蛋白酶菌株的分离
产蛋白酶菌株的分离一、教学目标及基本要求1. 学习从各种样品中分离微生物的操作技术2. 掌握分离微生物时定性测定产物的筛选方法3. 学习和掌握枯草芽孢杆菌的分离技术4. 掌握高产蛋白酶菌株的初筛方法二、实验原理枯草杆菌是属于芽孢杆菌属的一类细菌。
枯草芽孢杆菌的分布十分广泛，主要存在于土壤或腐烂的稻草之中。
由于能够形成芽孢，因此能够抵抗高温，低温等不良环境，所以是实验室及工业生产中主要污染菌之一，危害极大。
但是许多枯草芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、抗菌素等物质，是工业酶制剂生产的重要菌种。
例如，我国使用的BF7658枯草芽孢杆菌生产а-淀粉酶，用于淀粉水解，纺织品退浆等。
又如AS1398枯草杆菌是生产蛋白酶的重要菌株。
1. 枯草芽孢杆菌的芽孢耐热的特点。
由于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
2. 枯草芽孢杆菌的产酶特征。
利用枯草芽孢杆菌产生水解酶的特性，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
3. 枯草芽胞杆菌的形态特征枯草芽孢杆菌的细胞大小0.7×2～3 μm，营养细胞为杆状，杆端钝圆、单生或者短链，着色均匀，无荚膜，周边运动，革兰氏染色阳性。
有芽孢0.6×1～1.5 μm，芽孢中生或近中生，壁薄，不膨大，孢子呈椭圆或长筒形，常为两端染色。
菌落变化很大，枯草芽孢杆菌在麦芽汁琼脂培养基斜面上，菌落呈细皱状，干燥或颗粒状。
在土豆培养基上菌落呈细皱状，干燥，有时呈现天鹅绒状的菌苔，在液体培养基表面形成银白色的菌膜。
菌落粗糙，扁平、扩展，不透明，不闪光，表面干燥，污白色或微带黄色。
4. 枯草芽胞杆菌的生理生化特性枯草芽孢杆菌能够液化明胶，冻化牛乳，还原硝酸盐，不产生吲哚，H2S，V-P反应阳性，水解淀粉。
产蛋白酶菌株的筛选
• 每组（产碱性蛋白酶菌分离用） • 1、配置培养基： • 1）牛肉膏蛋白胨培养基: （ 配制200ml放三角 瓶，分装试管5支） • 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g • NaCl 5g 琼脂20g • 水 1000ml PH7.0-7.2 • 配置牛奶（分离用）？？ • 2）发酵培养基（每组配置350ml 分装6甁）： • 玉米粉4 ％、 黄豆饼粉3 ％、 • Na2HPO4 0.4 ％, KH2PO4 0.03 ％, • 3mol/L NaOH 调节PH9.0，100ml • 250ml三角瓶的装甁量50ml
• 第四次 • 1、初筛：将斜面培养物接种到发酵培养基； • 每个菌接2个发酵培养基中。 • 培养：37℃、200r/min（每分钟转）摇床培养 48小时 • 第五次 • 酶活力的测定： • 发酵液过滤液1ml+2 ％酪蛋白----40 ℃水浴保 温10分钟-----加0.4mol/L三氯醋酸3ml------静置 15分钟-----过滤液1ml-----0.4mol/LNa2CO35ml----Folin试剂1ml----- 40 ℃水浴保温 20分钟--------分光光度计680nm处 测OD值
四、操作步骤
• • • • • •
•
第一次 实验准备 每组准备： 1、 90ml无菌水一瓶，无菌水10支，各装9ml自来水； 2、移液管9支，用纸包好；（头上塞棉花）、涂布器 3、空白培养皿：6套 4、配制培养基： 牛肉膏蛋白胨琼脂培养基+牛奶 三角瓶的装甁量 200ml
斜面试管培养基 3支
• 5、发酵培养基：玉米粉4 ％、黄豆饼粉3 ％、Na2HPO4 0.4 ％, KH2PO4 0.03 ％, 3mol/L NaOH 调节PH到9.0， 250ml三角瓶的装甁量50ml 6甁 • 5、灭菌: 0.1MPa 20分钟
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选蛋白酶是一种能够水解蛋白质的酶类，广泛应用于医药、食品、饲料等多个领域。
因此，对蛋白酶产生菌的筛选具有重要意义。
下面将对蛋白酶产生菌的筛选进行详细介绍。
一、菌种的选取菌种的选取是筛选蛋白酶产生菌的第一步。
一般来说，优秀的蛋白酶产生菌应具备以下特点：1.适应性强：具有广泛适应环境的能力，能够在多种环境中生存繁殖；2.高酶产量：产酶量高且稳定，生产成本低；3.酶活性好：酶活性高，能够快速、高效地降解蛋白质；4.易于培养：易于培养和维护，适应不同的培养条件。
根据以上要求，我们可以选取一些常见的微生物菌株，如大肠杆菌、真菌、放线菌等。
此外，一些原产于自然界中的微生物资源也是优秀的菌株来源，在筛选蛋白酶产生菌时应予考虑。
二、菌群的分离菌群的分离是筛选蛋白酶产生菌的关键步骤。
在这一步骤中，我们需要将每一种菌株分离出来，以便进行后续的酶活性检测和分析。
常用的分离方法包括平板法、液体培养法、筛选法等。
其中平板法是最为常见的方法，其步骤如下：1.准备培养基：根据选取的菌株特性，准备适宜的培养基，以促进菌株的生长和繁殖；2.分离：将样品按照一定稀释倍数涂布在平板上，然后放入培养箱进行培养；3.单菌分离：观察培养基的著色情况，辨别每一个菌落，最后用无菌酒精燃烧消毒的针头将每个菌落刺到含有相同培养基的试管中进行液体培养；4.鉴定：确定单菌培养基量大于10^6时，进行细胞分类和鉴定。
三、酶活性检测酶活性检测是筛选蛋白酶产生菌的重要环节，可以通过掌握酶活性信息来评估菌株的产酶能力以及蛋白酶的种类和活性等。
我们可以通过以下方法进行酶活性检测：1.酶联免疫吸附测定法（ELISA）：其原理是将特异性抗体与酶偶联，加入样品中，利用抗体与酶偶联物发生特异性相互作用，用底物染色，观察染色情况以确定酶活性；2.凝胶电泳：将分离纯化的酶嵌入聚丙烯酰胺凝胶中进行分离和检测；3.酶活性测定：以酶降解底物的反应速度作为酶活性的指标，通过比色、荧光和放射等不同方式进行检测。
微生物学实验
微生物学实验(总5页) -CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1-CAL-本页仅作为文档封面，使用请直接删除实验十一产蛋白酶芽孢杆菌的分离（一）———芽孢杆菌的分离一、目的和要求1. 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的筛选方法。
2. 学习和掌握芽孢杆菌的分离技术。
二、实验原理芽孢杆菌于芽孢具有较强的抗高温能力，分离纯化时可采用热处理的方法，即通过高温加热杀死其中不生芽孢的菌种，使耐热的芽孢菌得到富集。
许多芽孢杆菌能分泌分泌蛋白酶，淀粉酶，可以选择酪蛋白或淀粉为主要营养成分的分离培养基，因菌体分泌的酶可以将大分子的蛋白或淀粉水解而在菌落周围形成透明圈。
根据透明圈直径(H)和菌落直径(C)之比值(H/C)可以初步确定酶活力，其比值越大，酶活力越高，进而可筛选出高产酶活的菌株。
三、实验器材1. 土壤样品：从地表下10~15cm的土壤或者枯枝烂叶，腐烂稻草中用无菌小铲，纸袋取土样，并记录取样的地理位置、pH、植被情况等(学生自取)。
家畜饲养、屠宰等动物性蛋白丰富的地点土壤中筛选高产蛋白酶菌株的概率更大，若条件许可，建议尽量选择这样的地点进行采样。
2. 牛肉膏蛋白胨培养基（1000ml, 配制时，只加800ml，每个三角瓶分装180ml），15%脱脂奶粉溶液（脱脂奶粉用水溶解后应单独灭菌（0.06MPa,30min），铺平板前与加热溶化的肉汤蛋白胨培养基混合），盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒、1ml吸管（4支），10ml吸管（1支）和培养皿（10套），接种环等。
3. 水浴锅四、操作步骤1. 牛奶平板制备（4人/组）牛肉膏蛋白胨培养基（180ml）融化，待冷至55－60℃时，添加20ml无菌15%脱脂奶粉溶液混合均匀，配制终浓度为1.5%的牛奶牛肉膏蛋白胨培养基；到平板。
2. 土壤样品的处理将采集的土壤样品做成菌悬液（10-2）后置于80℃水浴中加热10～20分钟以杀死不能形成芽孢的菌体。
蛋白酶产生菌的筛选
蛋白酶产生菌的筛选组别：第*组班级：生工**班组员：***指导老师：***一、实验目的学习从自然界中分离蛋白酶产生菌二、实验内容蛋白酶产生菌的分离三、实验原理许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白酶产生菌。
本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。
将初筛的蛋白酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得到产蛋白酶的芽孢杆菌。
也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。
四、实验材料和用具1.材料：土壤样品2.试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、3.仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。
五、操作步骤（一）配制所需培养基按照以下配方配制所需的培养基牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 1.5～2.0g，水 100ml，pH 7.2配制200mL奶粉培养基：牛肉膏 0.5g，蛋白胨 1g，NaCl 0.5g，琼脂 2.0g，水 100ml，pH 7.0～7.2脱脂奶粉 3g，配制200mL（二）分离1.采集土壤样品，用无菌水植被1:10土壤悬液。
2.取1:10土壤悬液5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试管放入75～80℃水浴中热处理10min以杀死非芽孢细菌。
3.取加热处理过的土壤悬液100～200μL，涂布接种到牛肉膏蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.4.对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽孢杆菌。
（三）筛选1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32℃下培养24～48h。
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实验十一产蛋白酶菌株的筛选-2013 实验十一产蛋白酶菌株的筛选
碱性蛋白酶是一类最适宜作用pH为碱性的蛋白酶，在轻工、食品、医药工业中用途非常广泛。
微生物来源的碱性蛋白酶都是胞外酶，具有产酶量高，适合大规模工业生产等优点，被认为是最重要的一类营业性酶类。
从自然界筛选获取有用的微生物资源一直是微生物学的一项重要工作，也是学习微生物学的学生应该掌握的基本技能。
一、基本原理
, 自能够产生胞外蛋白酶的菌株在牛奶平板上生长后，其菌落周围可形成明显的蛋白水解圈。
, 水解圈与菌落直径的比值常被作为判断该菌株蛋白酶产生能力的初筛依据。
不同类型的蛋白酶都能在牛奶平板上形成蛋白水解圈，细菌在平板上的生长条件和液体环境中生长的情况相差很大，因此在平板上产圈能力强的菌株不一定就是碱性蛋白酶的高产菌株。
, 碱性蛋白酶活力测定按中华人民共和国颁布标准QB747-80进行。
, 原理:Folin试剂与酚类化合物(Tyr,Trp,Phe)在碱性条件下发生反应形成蓝色化合物，用蛋
白酶分解酪蛋白生成含酚基的氨基酸与Folin试剂呈蓝色反应，通过分光光度计测定可知酶
活大小。
二、实验目的
, 学习用选择平板从自然界中分离胞外蛋白酶产生菌的方法
, 学习并掌握细菌菌株的摇瓶液体发酵技术
, 掌握蛋白酶活力测定的原理与基本方法
三、实验器材
1(菌株
从自然界筛选获得的蛋白酶产生菌株
2(溶液和试剂
蛋白胨，酵母粉，脱脂奶粉，琼脂，干酪素，三氯醋酸，NaOH，NaCO，Folin 试剂，硼砂，23
酪氨酸，水等
3(仪器和用品
三角烧瓶，培养皿，吸管，试管，涂布棒，玻璃搅拌棒，水浴锅，分光光度计，培养摇床，高压灭菌锅，尺，玻璃小漏斗和滤纸
四、操作步骤
1. 培养基和试剂的配制
(1)牛奶平板:在普通肉汤蛋白胨固体培养基中添加终质量浓度为1.5%的牛奶
(2)发酵培养基:玉米粉4%，黄豆饼粉3%，NaHPO 0.4%，KHPO 0.03%，3 mol/l NaOH 调节2424
pH到9.0，0.1MPa 灭菌20min，250ml三角烧瓶的装瓶量为50ml。
(3)pH11硼砂- NaOH缓冲液:硼砂19.08克溶于1000ml水中;NaOH 4g，溶于1000 ml水中，二液等量混合。
(4)2%酪蛋白:称取2g干酪素，用少量0.5mol/l NaOH润湿后适量加入pH11的硼砂- NaOH缓冲液，加热溶解，定容至100ml，4?冰箱中保存，使用期不超过一周。
2. 酶活标准曲线的制作
用酪氨酸配制0~100μg/mL的标准溶液，取不同浓度的酪氨酸1mL与5 mL
0.4mol/l NaCO、1 mL 23Folin试剂混合，40 ?水浴显色30 min，680 nm测定吸
收值并绘制标准曲线，求出观密度为1是相当的酪氨酸质量( μg )，及K值。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements
3. 用选择平板分离产蛋白酶产生菌株(周一下午)
-3-4-5 取10g土样混于90mL无菌水中，梯度稀释后涂布到牛奶平板上(稀释
梯度:10,10,10，两个平行，每组2块平板)，37 ?培养30h左右观察建议用地衣芽孢杆菌作为对照菌株
4. 产蛋白酶菌株的观察、划线分离与转接(周三、周四 )
对牛奶平板上的总菌数和产蛋白酶的菌数进行记录，量取水解圈与菌落直径，计算其比例，选择比例最大的2株菌。
转接到肉汤琼脂平板上进行划线分离(每组2块平板，周三)，37 ?培养过夜。
挑取单菌落斜面培养(周四下午，每组2支斜面)，同时对单菌落进行革兰氏染色和形态观察(显微镜室，载破片)。
(周三下午)
5. 用发酵培养基测定蛋白酶菌株的碱性蛋白酶活力
将斜面上培养24 h的初筛菌株接种到发酵培养基中(每人1瓶)，37 ?、
200r/min 摇床培养48h。
(下周一)
6. 酶活力的测定(下周三)
离心获得粗酶液(8000 r/m，10min)
空白对照样品
发酵液(或其稀释液)1ml 发酵液(或其稀释液)1ml
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml 2% 酪蛋白1 ml
2% 酪蛋白1 ml 40?水浴保温10min
0.4mol/L 三氯醋酸 3ml
静置15min，使蛋白质完全沉淀，然后用离心(8000 r/m，10 min)
滤液1ml
0.4 mol/l NaCO，5ml 23
Folin试剂1 ml
40?水浴保温20min ，于680nm处测定OD值
, 碱性蛋白酶活力单位U，以每毫升样品在40 ?，pH 11条件下，每分钟水解酪蛋白所产生的
酪氨酸质量()来表示。
U = K×A×N×5/10
K:由标准曲线求出光密度为1是相当的的酪氨酸质量，本实验K = 200
N:稀释倍数
A:样品OD值与空白对照,,值之差
5/10:测定中吸取的滤液是全部上清液的1/5，而酶反应时间为10 min 五、实验报告
1. 结果记录
2. 思考题
(,)在选择平板上分离获得蛋白酶产生菌的比例如何,试结合采样地点进行分析。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are
required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements
(,)在选择平板上形成蛋白透明水解圈大小为什么不能作为判断菌株产蛋白酶
能力的直接证据,
试结合你初筛和复筛的结果分析。
to prevent the accumulation of air, both ends of the tube are required the Center to bake. 6.2.5 sets should be at the bottom 200mm lashing cable head is fixed rung, with a similar cable color of plastic lashings. Cable head using "equal-width stacked" layout, or according to the size and space within the enclosure cable volume adjust, but you must ensure uniform, neat and elegant. 6.2.6 disc cabinet within cable shield layer requirements。