高效聚磷菌的筛选

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两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究2009

收稿日期:2008-9-19;修回日期:2008-10-17作者简介:傅宏兵(1970-),男,硕士研究生,专业方向为环境微生物技术;通讯作者:吴　涓(1969-),女,博士,副教授,研究方向为水污染控制及环境生物技术,E 2mail:wujuan@ustc .edu 。

基金项目:安徽省自然科学基金项目资助(070413132)doi ∶10.3969/j 1issn 11008-9632.20091061023两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究傅宏兵,吴　涓(安徽大学生命科学学院,合肥230039)摘　要:采用梯度驯化及平板分离技术,从巢湖底泥中筛选到两株高效聚磷菌,分别命名为P6与P8。

经过厌氧和好氧两个阶段的处理,两种菌株的聚磷率均达到80%以上。

实验结果表明,P8菌株在10℃～40℃以及pH 值4～11的较宽范围内都显示出稳定的聚磷效果,而P6菌株仅在30℃～35℃以及pH 值4～5的狭窄范围内达到较高的聚磷率。

不同碳氮源的影响实验表明,除了乳糖以外,P8菌株在所考察的多种碳氮源下都能表现出较高的聚磷率,当乙醇浓度为3.75g/L 时,聚磷率可达到92.9%;而P6菌株对碳氮源则有较严格的要求。

关键词:聚磷菌;筛选;生物量;聚磷率中图分类号:Q932335;X172文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)06-0023-04水体富营养化是全球普遍存在的严重环境问题,近些年来,随着工农业生产的高速发展和人们生活水平的不断提高,含磷的化肥、农药、洗涤剂的使用量不断上升。

水体中磷的含量日益增加。

虽然氮磷同为水体生物的重要营养物质,但是在所有的营养元素中,磷被认为是引起水体富营养化的最关键因素[1-3]。

然而,我国现有的污水处理厂主要集中于有机物的去除,对磷等营养物的去除率只达到10%～20%,其结果远达不到国家二级排放标准[4-5]。

因此,有效降低排放废水中的磷含量,已成为防治水体富营养化的重要途径之一。

高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性

邵锴,邱业先，徐婧.高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性[J ].江苏农业科学,2017,45(8) =253 -257. doi ： 10.15889/j . issn . 1002 - 1302.2017. 08. 068高效溶磷菌的筛选、鉴定及其溶磷特性邵锴，邱业先，徐婧(苏州科技学院，江苏苏州21000)摘要:为了从根际土壤中筛选出具有较高溶磷能力的菌株及优化溶磷条件,通过种子萌发初步研究溶磷促生效应。

通过稀释涂布法分离、筛选菌株,并进行ATB 细菌鉴定仪及16S rD N A 测序鉴定;采用单因子试验及正交试验优化菌株溶磷发酵条件，利用种子发芽指标测定菌株的促生能力。

结果显示，筛选出菌株B D -1的溶磷能力最强，经 ATB 细菌鉴定仪及16S rD NA 测序，该菌株被鉴定为路德维希肠杆菌。

正交试验结果表明，在温度为30丈、摇床转速为180 r /mm 、接种量为2 ml ^、初始p H 值为7.0的条件下培养7 d 的溶磷效果最好，其溶磷量为181.73 g /L 。

种子萌发试验结果表明,该溶磷菌对作物种子萌发具有一定的促进作用。

关键词:溶磷菌;微生物肥料;条件优化;解磷能力;种子萌发;鉴定;筛选;溶磷特性中图分类号：S 154. 38 + 1文献标志码：A文章编号：1002 -1302(2017)08 -0253 -04江苏农业科学2017年第45卷第8期一 253 —磷是植物生长必需的营养元素之一，植物的光合作用和体内的生化过程都必需有磷参与[1<，但其在土壤中主要以难溶性矿物态存在[3]，难溶性矿物态磷无法被作物直接吸收利用。

为提高作物产量，超过/ k /hm 2磷肥被施用于土壤中[]，部分磷肥被作物吸收利用，大部分被转化成难溶性磷返施于土壤。

大量化学磷肥的施用，伴随土壤板结、土壤酸化、土壤贫瘠化日益严重。

因此，提高土壤中磷的利用效率对降低化学磷肥的施用量具有十分重要的意义。

聚磷菌AP7的筛选及除磷特性研究

ｒ］
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聚磷菌的筛选及除磷特Ｉ研究生
张敬任丽科学学院，四川南充６７０）５０２摘要：从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株高效聚磷茵Ａ７Ｐ，经形态特征和生理生化初步鉴定该株为恶
臭假单胞菌（ｓｕｏｏａｕｉ）实验表明，菌株Ａ７有典型的厌氧释磷和好氧吸磷的特征，除磷率为７．％。Ｐｅｄｍｎｓｐｔａ。ｄＰ具０１关键词：活性污泥；聚磷菌；鉴定；除磷性能
ＤＩ１．９９Ｊｓｎ１７ —６９．０．５Ｏ７Ｏ：５６／．ｓ．６１５６２１１．００ｉ１
ｌｏａｉｎａａｅｔｒａｉｎｏｏｐｏｕｃｓｌｔｎｄＣｈｒｃｅｉｔｏｆａＰｈｓｈｒｓｏＡｃｕｍｕｌｔｎＢａｔｒａａｉｃｅｉｏ７ｗｉｈＨｉｈＣａａｉｔｆｏｐｏｕｍｏａｔｇｐｂｌｙｏｉＰｈｓｈｒｓＲｅｖｌ
要的作用。但是大多数研究学者主要研究生物除磷工艺的改进和创新，而对聚磷菌聚磷机理研究进展比较缓慢。对
ＺＨＡＮＧｎ，ＲＮＬ．ｉｇＣｌｇｉＥｉｎ，ＨＥｉ．ｕｐＮＩｈａｎ（ｏｌｇｆｉｌｉａＳｉｎｅ．ｈｎ＿ｔｒｌｉｅｓｙＮａｃｏｇＳｃｕｎ６７０）ＣｌｅｏｏｏｉｌｃｃｓＣｉａｅｍａＵｎｖｒｉ，ｎｈｎ，ｉｈａ３０２ｅＢｃｅＷｓＮｏｔ

高效聚磷菌的筛选与开发利用

◇ 科技论坛◇
科技曩向导
２０１４年２４期
高效聚磷菌的筛选与开发利用
陈作煌李燕林天元
（福建农林大学
福建
福州
３５０００１）
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
【摘要】运用生物法对污水进行处理可以说是最环保的一项污水生物治理工程，在对污水的除磷中广泛的使用了聚磷茵，聚磷菌能吸收污水中的乙酸、甲酸、丙酸及乙醇等极易生物降解的有机物质，与体内聚合的磷发生反应，形成高磷污泥后可以清理出来达到污水的除磷效果，但在实际的应用中由于聚磷茵受环境和工艺影响．会出现诸多问题需要解决．因此对如何筛选出高效的聚磷菌并很好的开发利用就尤为重要了，本文通过分析研究力争为有效的筛选分离出高效聚磷菌提供可靠的参考资料。
［２］陈亚松，金文标，闫韫，赵勇娇．高效聚磷菌的筛选及其应用ｆＪ１ｌ净水技术，
２０ｌ１４．
［３］李博，赵敏，李宝赫，刘哲君．高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析【Ｄ］．东北林业
大学学报．２００９１２．［４］连丽丽．聚磷菌的筛选及其对污水的除磷特性研究［Ｄ】．辽宁师范大学，２００９６．
４．高效聚磷菌的开发与应用
经过五次的富集培养和５次的分离纯化得到了高浓度的聚磷菌菌株．由于聚磷菌是具有超量吸收磷的微生物．因此不同菌群的吸收磷的效果也是不同的．因此要通过科学的培养筛选得到高效聚磷菌才能对污水处理起到显著效果．因此污水处理中一定要科学的选择污水淤泥中的聚磷菌作为培养基．对污水厂进行菌群投放．包括缺氧水段和富氧水段．经过投菌、沉淀、去除污泥达到净化水中磷的作用。

高效聚磷菌Alcaligenes_省略__12菌株的分离鉴定及其除磷特性_庄志刚

第34卷第3期2014年3月环境科学学报Acta Scientiae CircumstantiaeVol．34，No．3Mar．，2014基金项目：福建省财政厅资助项目（No．20130421）；福建省大学生创新创业训练项目（No．sjcxcy2012-022）；福建师范大学拔尖人才训练项目（生物学拔尖201004）Supported by the Funded Project of Finance Department of Fujian Province （No．20130421），the Innovative Entrepreneurial Training Plan for College Students of Fujian Province （No．sjcxcy2012-022）and the Ｒesearch Training Item of Top-Notch Biological Students of Fujian Normal University （Biological top-Notch 201004）作者简介：庄志刚（1991—），男，E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*通讯作者（责任作者），E-mail ：mli@fjnu．edu．cn Biography ：ZHUANG Zhigang （1991—），male ，E-mail ：zgzhuangfjnu@163．com ；*Corresponding author ，E-mail ：mli@fjnu．edu．cnDOI ：10．13671/j．hjkxxb．2014．0119庄志刚，韩永和，章文贤，等．2014．高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性［J ］．环境科学学报，34（3）：678-687Zhuang Z G ，Han Y H ，Zhang W X ，et al ．2014．Isolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulation ［J ］．Acta Scientiae Circumstantiae ，34（3）：678-687高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性庄志刚1，韩永和1，2，章文贤1，周志华1，陈佳兴1，李敏1，*1．福建师范大学生命科学学院，福州3501082．南京大学环境学院生物地球化学与环境修复实验室，南京210046收稿日期：2013-07-05修回日期：2013-09-10录用日期：2013-09-20摘要：利用经典的微生物筛选方法，从福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口淤泥中分离出1株高效聚磷菌，并结合16S rＲNA 基因序列分析进行了菌株鉴定．结果表明，该菌株为产碱杆菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．理化因素实验显示，在以乙酸钠为碳源、NH 4Cl 为氮源，当C /N 为3ʒ1，pH 为8．0，温度和摇床转速分别为35ħ和100r ·min －1时，该菌株的生长状态最好，对磷的去除能力也最强，最高除磷率可达80%．此外，该菌株能够耐受较高浓度的磷，当磷浓度超过45mg ·L －1时会产生抑制效应．同时，以聚乙烯醇（PVA ）和海藻酸盐（SA ）制备了聚磷微生物固定化小球，并考察了菌球对氮磷废水的净化效果．结果表明，氮磷的去除包括固定化材料的吸附作用及微生物的生长利用和/或贮存，显示出了良好的应用前景．关键词：聚磷微生物；产碱杆菌；筛选鉴定；特性；固定化文章编号：0253-2468（2014）03-678-10中图分类号：X172，X703．1文献标识码：AIsolation ，identification and phosphorus-removal characterization of bacteria Alcaligenes sp．strain ED-12for phosphorus-accumulationZHUANG Zhigang 1，HAN Yonghe 1，2，ZHANG Wenxian 1，ZHOU Zhihua 1，CHEN Jiaxing 1，LI Min 1，*1．College of Life Sciences ，Fujian Normal Univiersity ，Fuzhou 3501082．Biogeochemistry ＆Environmental Ｒemediation Laboratory （BEＲL ），School of the Environment ，Nanjing University ，Nanjing 210046Ｒeceived 5July 2013；received in revised form 10September 2013；accepted 20September 2013Abstract ：A phosphorus-accumulating bacteria was isolated from a drain outlet located in Gaoqi Village ，Shangjie Town ，Minhou County ，Fuzhou ，China．The strain ，named Alcaligenes sp．ZGED-12，was obtained by classic methods for screening microorganisms together with 16S rＲNA gene analysis．The culture conditions showed that the best carbon source and nitrogen source were sodium acetate and NH 4Cl ，respectively ，the optimal pH was 8．0，the optimal temperature was 35ħ，the best C /N was 3ʒ1，and the optimal shaking rate was 100r ·min －1．Under these optimized conditions ，the maximum removal efficiency for phosphorus was higher than 80%．The strain has a high tolerance for phosphorus ，but its growth was inhibited when the concentration of phosphorus was higher than 45mg ·L －1．Meanwhile ，the immobilized phosphorus-accumulating organisms beads （IMOBs ）were prepared ，and the purification efficiency of IMOBs for nitrogen /phosphorus contaminated wastewater was investigated．The results showed that removal for nitrogen and phosphorus was due to absorption on the immobilized materials and uptake /metabolism of microorganisms ，indicating a good prospective of IMOBs in the treatment of wastewater．Keywords ：phosphorus-accumulating organisms （PAOs ）；Alcaligenes sp．；screening and identification ；characteristics ；immobilization3期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性1引言（Introduction）磷超标是造成水体富营养化的主要原因之一．研究发现，当总磷浓度超过0．1mg·L－1（磷作为限制因素，m TNʒm TP＞15ʒ1），藻类会过度繁殖（Abell et al．，2010）；一般情况下，总磷浓度超过0．02 mg·L－1就有可能导致水体富营养化（韩永和等，2012）．由于水体富营养化现象日趋严重，严重破坏了人类赖以生存的自然环境，威胁着人类的健康（Ansari et al．，2011）．常规的生化处理工艺效率低，不能从根本上解决问题．近些年，微生物除磷工艺的研究得到了迅速发展，主要有A/O、A2/O、UCT、五段Bardenpho、Phostrip等（马放等，2011）．为实现微生物除磷工艺的有效实施，筛选出除磷能力较强的聚磷微生物是首要目标．此外，考虑到聚磷微生物对磷的吸收是一个厌氧释磷、好氧吸磷的过程（张培玉等，2011），有必要考察聚磷微生物对溶氧的响应．同时，微生物聚磷过程会受有机质分子大小、pH等的影响（王亚宜等，2005；2006）．因此，考察特定微生物在不同理化条件下的生长情况和除磷特性是实现微生物除磷机理研究及其在工程应用的前提条件．为获得除磷能力较强的微生物种质资源，自聚磷菌首次被Fuhs等（1975）分离以来，至今已有多种具备聚磷能力的微生物被筛选出来．多项研究表明，产碱杆菌属细菌（Alcaligenes sp．）具备这方面的能力（Flores III et al．，2007；Joo et al．，2006；Zhou et al．，2012）．此外，肠杆菌（Enterobacteriaceae）（张培玉等，2011；赵海泉等，2009）、金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus）（南亚萍等，2013）、Accumulibacter （Acevedo et al．，2012；Oehmen et al．，2005）、变形菌（Alphaprotenbacteria）（Nguyen et al．，2012；周明璟等，2012）等也是常见的聚磷微生物，甚至存在兼具反硝化功能的聚磷微生物（Qiu et al．，2012；Yang et al．，2011；杨小龙等，2011）．在此基础上，人们又开展了大量关于溶氧对聚磷菌除磷能力的影响研究（Acevedo et al．，2012；Merzouki et al．，1999；张培玉等，2011），但这些研究较少涉及不同聚磷菌在不同的厌氧时间条件下对好氧吸磷的相关作用．此外，诸如pH和有机质分子大小等理化因素对聚磷菌聚磷能力的影响也已得到较深入研究（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005；王亚宜等，2005）．然而，当前的多数研究只局限于对单一因素的考察，抑或集中于研究高浓度废水的生物处理系统，目前，聚磷微生物除磷工艺离工程应用仍有较大的距离（丁炜等，2011）．正如Covarrubias等（2012）研究表明，微生物的固定化能够为其活性持留提供保障．然而，考察固定化聚磷菌对含磷废水的修复实验尚未见相关报道．因此，继续筛选和开发具备高效除磷功能的微生物，开展聚磷微生物的固定化、活性持留及污水修复并开展综合理化因素对聚磷微生物除磷能力的影响等方面的研究对工程实践有重要指导意义．鉴于此，本研究从排污口淤泥中筛选出1株具备高效除磷能力的聚磷菌，全面考察各理化因素对菌株生长及除磷能力的影响．同时，对微生物进行固定化，并重点考察其对含磷废水的净化效果．2材料与方法（Materials and methods）2．1材料2．1．1样品来源淤泥样品采自福州市闽侯县上街镇高岐村某排污口，立即用于菌种的分离与筛选．2．1．2培养基富集培养基、筛选培养基、微量元素（张培玉等，2011），以及缺磷培养基（马放等，2011）和富磷培养基（李博等，2009）分别按文献进行配制．LB培养基（g·L－1）：蛋白胨10．00，酵母粉5.00，NaCl10．00，琼脂2．00（固基加入），pH=7．2．固定化微生物小球实验培养基（g·L－1）：丁二酸钠0.61，NaNO30．28，KH2PO40．1，KCl0．014，MgSO4·7H2O0.02，CaCl2·2H2O0．018，pH=7．2．以上所有培养基均经121ħ灭菌（碳源实验中，葡萄糖和蔗糖组115ħ灭菌）20min后使用，微量元素于灭菌前加入．2．1．3微生物固定化小球制备材料聚乙烯醇（Polyvinyl alcohol，PVA）、海藻酸盐（Sodiumalginate，SA）、硼酸（H3BO3）、无水氯化钙（CaCl2），除硼酸（分析纯）外其余均为化学纯．2．2方法2．2．1聚磷菌的分离鉴定称取0．5g新鲜淤泥，用无菌水水洗后8000r·min－1离心5min，弃上清，此过程重复3次．处理后将样品加入2．1．2节的富集培养基中，添加量及其他条件参考文献（韩永和等，2013）．培养12h后，取1．5mL菌悬液于下一磷梯度的培养基中，磷梯度依次为2、5、8、10、15和20mg·L－1（以P计）．聚磷菌含有典型的PHB颗粒和异染颗粒，经强976环境科学学报34卷化释磷、吸磷实验后，PHB颗粒可被脂溶性染料苏丹黑着色，异染颗粒可被甲苯胺蓝和次甲基蓝染成紫色，可与其他非颗粒性物质区分开来（李博等，2009；马放等，2011）．将富集驯化的菌悬液按10－110－7梯度进行稀释，涂布平板．挑取形态较特殊的单菌落进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，确定含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落，进行复筛实验．挑取经纯化的单菌落于缺磷培养基中，150r·min－1、30ħ培养12h．将菌液在8000r·min－1条件下离心5min，再将菌液转接于富磷培养基中，150r·min－1、30ħ培养至菌液变浑浊．计算各株菌的除磷率．此后，将复筛得到的聚磷菌根据文献（韩永和等，2013）的方法进行16S rＲNA的测序及系统发育分析．2．2．2理化因素对聚磷菌生长及除磷特性的影响聚磷菌具备高效除磷能力主要基于异染颗粒对磷的贮存，菌体在生长过程中也能够利用部分磷合成细胞成分．文献报道显示，聚磷菌在厌氧、缺磷条件下能够把贮存于异染颗粒中的磷释放出来，经厌氧释磷后将其投入富磷培养基中进行除磷实验能够大大提高除磷能力（Merzouki et al．，1999；张培玉等，2011；周明璟等，2012）．此外，碳源、氮源、C/N、pH、温度等都会影响聚磷菌的生长．因此，考察不同理化因素对聚磷菌生长及除磷能力的影响是必要的，这对实现聚磷菌的工程应用有重要参考价值．将菌株ED-12于LB培养基中培养12h（30ħ、150r·min－1），按5%的接种量接种于装有30mL缺磷培养基（PO3－4-P质量浓度为12．3mg·L－1）的150mL三角瓶中，30ħ、150r·min－1摇瓶培养12h；再按5%的接种量将菌悬液接种于装有30mL富磷培养基（PO3－4-P质量浓度为32mg·L－1）的150mL三角瓶中，30ħ、150r·min－1摇瓶培养．每隔一定的时间取样测定菌株ED-12的OD600及剩余的PO3－4-P浓度，计算除磷率并绘制菌株的生长曲线图．以聚磷菌的生长特性为基础，以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，以NH4Cl、（NH4）2SO4和NH4NO3为唯一氮源，同时考察了不同C/N、起始pH和摇床转速对聚磷菌生长及除磷能力的影响．在优化过程中，已优化的参数作为后续实验的条件．此外，在最优条件下，探讨了菌株ED-12对不同起始浓度PO3－4-P的去除效果，以考察其工程应用价值．PO3－4-P的起始浓度梯度设置为：5、15、30、45、60和100mg·L－1．2．2．3微生物固定化小球的制备及除氮磷初步实验微生物固定化小球的制备按以下步骤进行：①称取4g PVA（聚合度1750ʃ50）溶于90mL无菌水中，待PVA充分溶解后加入2g SA，沸水浴加热至完全溶解，冷却至室温备用；②分别称取2g反硝化菌和聚磷菌湿菌体，充分稀释于10mL无菌水中，再将稀释后的菌液加入PVA-SA体系中，充分混匀；③根据需要的小球粒径，剪去5mL移液枪枪头尖端，吸取菌体混合物，匀速滴入5%CaCl2-饱和硼酸溶液中，交联15min后，将小球用无菌水洗净，备用．以不添加菌球的组别为空白对照（Blankcontrol），以不添加微生物的固定化小球组为阳性对照（PVA+SA），按5%（m/V，g·L－1）投加小球．24h后取样测定水样的TN和TP浓度，计算脱氮除磷能力．2．3测定方法硝态氮（NO－3）和总氮（TN）的测定采用麝香草酚分光光度法（韩永和等，2013），总磷（TP）的测定采用钼锑抗分光光度法（国家环境保护总局，2002）．2．4数据处理与统计分析运用Microsoft Excel2003和Origin8．5进行数据处理、统计分析及绘图．所有实验均进行3个重复，结果以MeanʃSD表示．3结果与讨论（Ｒesults and discussion）3．1聚磷菌的分离鉴定3．1．1聚磷菌的分离纯化及复筛经富集，聚磷微生物在平板上的菌落随着磷浓度的升高而减少，当磷浓度达到20mg·L－1时，平板上已无单菌落．将磷浓度为15mg·L－1的培养基按10－1 10－7稀释，涂布平板．根据形态特征，将能够在培养基上生长的49个单菌落分成4类，分别为EA（12株）、EB（15株）、EC（8株）和ED（14株）．分别对EA、EB、EC和ED进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色，初筛得到9个染色效果较明显的聚磷菌单菌落（EA、EB和ED各3个，EC无受染现象）．随后，对EA、EB和ED共9株聚磷菌进行复筛实验．分别缺磷培养12h后，转接于富磷培养基中继续培养24h，测定除磷率，结果如表1所示．可知，ED-12对磷的去除能力最强，可达52．2%，因0863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性此，选择菌株ED-12作进一步研究．表1聚磷菌的除磷能力（起始浓度：33．9mg·L－1）Table1The phosphorus removal ability of phosphorus－accumulatingorganisms（initial concentration：33．9mg·L－1）菌株总磷浓度/（mg·L－1）去除率A-0327．219．70% A-0626．920．60% A-1027．419．10% B-0429．812．10% B-1029．213．90% B-1129．114．50% D-0616．850．40% D-0817．348．90% D-1216．252．20%3．1．2聚磷菌菌株ED-12的16S rＲNA的PCＲ扩增及序列分析经测序，获得片段长度为1463bp 的部分16S rＲNA基因序列，GenBank登录号为JX966315．在NCBI数据库的比对结果表明，该菌株与Alicaligenes sp．的相似性达98%以上，推测其为Alicaligenes sp．选择序列相关性较高的76个16SrＲNA序列，用Cluxtal X序列分析软件分析其与ED-12的序列同源可靠性，选9个可信度较高的序列用MEGA4．0软件通过N-J法构建系统发育树，确定ED-12的进化地位，结果如图1所示．图1基于16S rＲNA序列同源性构建的菌株ED-12和亲缘性相近的其他细菌的系统发育树Fig．1Unrooted phylogenetic trees based on the16S rＲNA sequence of strain ED-12and the related strains图2菌株ED-12的生长曲线及除磷特性Fig．2Growth curve and phosphorous removal characteristic ofstrain ED-123．2ED-12的生长曲线及除磷特性聚磷菌在缺氧、缺磷条件下会利用异染颗粒中的磷并合成PHB，将其转入有氧、富磷的培养基后会将PHB中的能量释放出来，以便更高效地聚磷，用于菌体生长并将剩余的磷储存于异染颗粒中（马放等，2011）．图2展示了菌株ED-12经缺磷培养后在富磷培养基中的生长情况，以及其对PO3－4-P的去除率．结果表明，在前16h，菌体生长处于延滞期，16h后进入对数期，52h后开始进入衰亡期．在整个过程中，菌体生长特征与除磷率趋势基本吻合．64h内，磷浓度从30mg·L－1左右降低到（8．12ʃ0.32）mg·L－1，去除率达73．82%ʃ1．02%．此后，总磷浓度基本保持不变．3．3不同理化因素对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响3．3．1不同碳源对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响有机物特征是影响生物反应器反硝化和除磷效果的重要因素，与反硝化微生物类似（韩永和等，2013），大部分聚磷菌只能以低级脂肪酸类的小分子有机基质作为碳源，并将其合成的PHB以能量形式储存在细胞内（王亚宜等，2006）．以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠、葡萄糖和蔗糖为碳源，菌株ED-12的生长及除磷能力结果如图3所示，菌株ED-12在以葡萄糖和蔗糖为碳源时基本不生长，对PO3－4-P的去除率低于15%．而菌株在以乙酸钠、丁二酸钠、柠檬酸钠为碳源时长势较好，且对PO3－4-P的去除率都在50%以上．其中，以乙酸钠为碳源时，菌株ED-12生长最旺盛，对PO3－4-P的去除率达到了70%以上．对比5种碳源结构与分子量，相对而言，在分子结构简单、分子量低的情况186环境科学学报34卷下，聚磷菌的生长较好，且能达到一个较高的除磷率，这与前述观点相符．此外，聚磷菌对不同碳源的利用效果可能还与其本身对碳源的亲和性或其他特性有关．图3不同碳源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．3Influence of different carbon sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．2不同氮源对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质，对蛋白质、核酸和其他一些成分的合成非常重要（Madigan et al ．，2009）．多数细菌能以氨盐作为唯一氮源，由图4可知，在以NH 4Cl 、（NH 4）2SO 4和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中，聚磷菌能够良好生长．其中，在含有NH 4Cl 的培养基中OD 600可在24h 内达到1．4左右．同时，在以上3种氮源培养基中，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除率都在45%以上（NH 4Cl 培养基最高，可达80%）．观察发现，菌株ED-12在24h 时，在以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源的培养基中只能微弱的生长，但经48h 的培养后，开始进入对数期，并能达到较高的OD 600．此外，虽然以NaNO 3和NaNO 2为唯一氮源时微生物生长情况较差，但培养基中PO 3－4-P 浓度分别降低了63．72%ʃ5.57%和34．84%ʃ2．11%，说明微生物在24h 内主要通过分解PHB 并将磷储存于异染颗粒中在后期用于菌体的生长．但Saito 等（2004）研究认为，NO －2的存在在有氧和无氧两种情况下都会抑制聚磷菌对磷的吸收．图4得出了不同的结论，其机理有待进一步研究．在以蛋白胨为唯一氮源的培养基中，菌株ED-12长势较好，但蛋白胨含有含磷杂质，因而影响了PO 3－4-P 去除率的计算．由此可知，聚磷菌ED-12菌株能够在以NH 4Cl 、NaNO 3、NaNO 2、（NH 4）2SO 4、蛋白胨和NH 4NO 3为唯一氮源的培养基中生长．根据微生物生长量、生长周期及对PO 3－4-P 的去除率，NH 4Cl 是菌株ED-12生长及发挥除磷能力的最佳氮源．图4不同氮源对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．4Influence of different nitrogen sources on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．3不同C /N 对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响碳源和氮源是微生物生长的重要物质，不同微生物对碳源和氮源的需求量不同．细菌对氮源的需求量大，真菌和放线菌等对碳源的需求量大（周德庆，2002）．在脱氮除磷工艺中，必须考虑C /N 以实现微生物对废水中氮、磷的有效利用．考察C /N 对聚磷菌ED-12菌株生长及除磷能力的影响，结果（图5）表明，随着C /N 的升高，菌体生物量增大，同时对PO 3－4-P 的去除率也随之提高，C /N 为3ʒ1时达到最大值．此后，微生物的生长及对PO 3－4-P 的去除率又随着C /N 的升高而缓慢降低，说明过高的C /N 导致氮源不足，微生物生长也因此受到了抑制．图5不同C /N 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．5Influence of different C /N on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．4不同pH 对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响在好氧条件下，聚磷菌能分别以醋酸和2863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性PO 3－4为碳源和磷源，生成聚合态磷作为储能物质，储存于细胞内并伴随着产生OH －，导致发酵液的pH 值逐渐升高（周明璟等，2012）．其聚磷过程可用式（1）表示（连丽丽，2009；周明璟等，2012）．C 2H 4O 2+0．16NH +4+1．2O 2+0．2PO 3－4→0．16C 5H 7NO 2+1．2CO 2（HPO 3）（胞内聚磷）+0．44OH －+1．44H 2O（1）有研究表明，pH 对聚磷菌聚磷过程非常重要，pH ≈8最适宜聚磷菌生长及除磷作用的发生（Filipe et al．，2001；Oehmen et al．，2005）．本研究发现，当pH 值＜7．0时，聚磷菌ED-12菌株基本不生长，对PO 3－4-P 的去除率为0；当pH ＞8．0时，会抑制菌体的生长，但对PO 3－4-P 的去除率却在持续地升高．有文献报道，pH 升高（在碱性条件下）会导致PO 3－4-P 以磷酸盐沉淀的形式析出（王亚宜等，2005）．在本研究中，当pH ＞8．0时，培养基中有沉淀产生，推测沉淀物即为文献中所报道的磷酸盐沉淀，因此出现了以上现象（升高）．图6不同起始pH 对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．6Influence of different initial pHs on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．5不同温度对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响温度是除有机物特征外影响微生物生长的另一重要因素，但王亚宜等（2006）和姜体胜等（2007）认为，温度不会影响聚磷菌发挥聚磷作用．由图7可知，随着温度的升高，聚磷菌ED-12菌株的生物量也增大，35ħ时最适宜ED-12菌株的生长．相应地，ED-12菌株对PO 3－4-P 的去除率也呈先增后减的趋势，在35ħ时达到最大值（73．14%ʃ1．65%）．由此可知，不同温度对聚磷菌ED-12菌株除磷效果的影响比对其生长的影响大得多．温度对聚磷效果存在影响，这与Panswad 等（2003）的研究结果相符，即35ħ最有利于聚磷菌发挥聚磷作用，过高或过低的温度都会抑制其效果，说明不同的微生物聚磷特性存在差异．图7不同温度对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．7Influence of different temperatures on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．3．6不同摇床转速对菌株ED-12的生长及除磷能力的影响研究表明，溶氧是影响生物除磷效果的一个重要因素（方茜等，2008；荣宏伟等，2008）．为了满足聚磷菌生物膜内对氧的需求量，加快氧的传递速率，增加活性生物膜的厚度，加快聚磷菌的好氧吸磷速率，必须提高液相主体中溶解氧的含量（荣宏伟等，2008）．此外，低溶氧有利于反硝化除磷，高溶氧有利于好氧吸磷（在含硝酸盐或亚硝酸盐培养中可以进行厌氧生长）（方茜等，2008）．如图8所示，摇床转速在0 200r·min －1之间，菌株ED-12都能生长．当摇床转速为50r ·min －1时，菌体OD 600最高，达2．60ʃ0．62；当摇床转速为100r ·min －1时，对PO 3－4-P 的去除率最高，达59.05%ʃ7.26%．在各培养条件下，菌体的生长与除磷率趋势不尽相同，说明二者是彼此独立的过程．静置培养时，储存于异染颗粒的磷被分解，用于菌体的生长，此时对PO 3－4-P 的去除率近50%，说明菌株ED-12在厌氧条件下还能将环境中的磷用于生长．好氧条件下，菌体将部分磷用于生长，并将剩余的磷储存于异染颗粒中，因此，在转速≥50r·min －1时也能维持一个较高的除磷率．观察发现，摇床转速过高未必能提高除磷率．微生物固定化小球脱氮除磷实验表明（详见3.5节），ED-12菌株在低溶氧与高溶氧时都存在除磷或聚磷作用，二者作用能力的强弱导致了图8所示的结果，即高溶氧时对PO 3－4-P 的去除率与低溶氧时相近．当摇床转速为100r ·min －1时，培养基中386环境科学学报34卷的溶氧最适合ED-12菌株对磷的反硝化去除或储存于异染颗粒中．低溶氧和高溶氧条件下，则分别表现为对磷的生长利用和积聚．因此，对废水中的磷的有效去除可以通过调节溶氧而实现，此过程包括生长利用和聚磷作用．图8不同摇床转速对菌株ED-12生长及除磷能力的影响Fig．8Influence of different shaking speeds on the growth and phosphorus removal ability of strain ED-123．4菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果聚磷菌对磷的去除包括两条途径：生长利用和异染颗粒贮磷．根据聚磷菌分离筛选原理，过高浓度的PO 3－4-P 会抑制聚磷菌的生长与繁殖．因此，考察不同起始浓度的PO 3－4-P 对聚磷菌生长的影响及相应条件下聚磷菌对PO 3－4-P 的去除效果，对分析聚磷菌生长与聚磷过程的关系及指导聚磷菌在富营养化水体中的工程应用有实际意义．如图9所示，随着PO 3－4-P 浓度的升高，菌株ED-12的OD 600呈先增后减的趋势．当PO 3－4-P 浓度为45mg ·L －1时，菌株ED-12的长势最好，过高的PO 3－4-P 反而会抑制菌体的生长．这是由于微生物生长受到了基质自抑制作用（王茹等，2013），这与聚磷菌分离筛选的结论相符．观察发现，除5mg ·L －1组，随着PO 3－4-P 浓度的升高，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除率与聚磷菌生物量成正相关（图中未显示），但PO 3－4-P 的变化浓度始终呈一递增趋势．当PO 3－4-P 浓度＞45mg·L －1时，培养基中出现了部分沉淀物．正如3．3．4节的结论，聚磷过程会释放OH －，微生物生长越快，在相同的时间内产生的OH －也越多，因此，就有越多的PO 3－4-P 形成了沉淀（王亚宜等，2005），这合理地解释了以上的现象．以上结论说明，Alcaligenes sp．ED-12对磷的吸收是一个复杂的过程，在菌体生长及聚磷过程中，不仅会受理化因素尤其是pH 的影响，溶液中的磷浓度也是影响聚磷菌生长与聚磷效果的一个关键因素．由以上分析可知，菌株ED-12对PO 3－4-P 的去除能力很强，在不同PO 3－4-P 起始浓度梯度条件下，最高去除率可达81．02%ʃ2．27%，此时的PO 3－4-P 浓度变化量为（36.46ʃ1．02）mg ·L －1．图9菌株ED-12对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果Fig．9Ｒemoval efficiency of strain ED-12on different initialconcentrations of PO 3－4-P 表2所示为典型的聚磷菌对不同起始浓度PO 3－4-P 的去除效果．由表可知，除耳葡萄球菌（Staphyloccocusauricularis ）、Accumulibacter和Competibacter 外，其他菌株对浓度＜50mg·L －1的PO 3－4-P 去除效果一般．在当前所报道的产碱杆菌除磷能力实验中，都未开展磷浓度梯度实验；除Bao 等（2007）的报道外，其余产碱杆菌菌株对浓度＜30mg ·L －1的PO 3－4-P 去除效果都低于90%．本研究所得菌株不仅在磷浓度为45mg·L －1时具有较高的去除率，当浓度高达60mg ·L －1甚至100mg ·L －1时还能维持较高的活性及去除率．因此，菌株ED-12是一株较理想的聚磷菌，具有广阔的应用前景．然而，微生物聚磷过程比较复杂，今后的研究工作可围绕精确定量菌株Alcaligenes sp．ED-12的磷吸收在生长利用及贮存方面的比例及吸收与释放的关系上．3．5固定化聚磷微生物小球除氮磷实验微生物的固定化是实现微生物活性持留的途径之一，同时，固定化也有助于目标微生物的投加与回收（Covarrubias et al．，2012）．当前应用最广泛的固定化材料是聚乙烯醇和海藻酸盐（Covarrubias et al．，2012；Munjal et al．，2002；Wu et al．，2004），固定化交联剂通常选择2% 5%的CaCl 2-饱和硼酸溶液（Long et al．，2004；Wu et al．，4863期庄志刚等：高效聚磷菌Alcaligenes sp．ED-12菌株的分离鉴定及其除磷特性2004）．表2不同微生物对磷的去除效率Table 2Ｒemoval efficiency of phosphorus for different microbes微生物PO 3－4-P 起始浓度/（mg ·L －1）PO 3－4-P 去除率参考文献金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus ）1065%南亚萍等，2013耳葡萄球菌（Staphyloccocus auricularis ）50＞90%Choi et al．，2000肠杆菌（Enterobacter sp．）10．2594．6%张培玉等，2011Accumulibacter ＆Competibacter 53．3＞80%Oehmen et al．，2005克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena ）27＜80%赵海泉等，2009约氏不动杆菌（Acinetobacter johnsonii ）1065．24%连丽丽，2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）7．590%刘亚男等，2005产碱杆菌（Alcaligenes sp．）10＞90%Bao et al．，2007产碱杆菌（Alcaligenes sp．）20．2582．3%孙梦，2011产碱杆菌（Alcaligenes sp．）28．7377．1%焦中志等，2009产碱杆菌（Alcaligenes sp．）4581%本研究图10固定化聚磷微生物小球对氮磷的去除效果Fig．10Ｒemoval efficiency for TN and TP by the immobilized-PAOsbeads根据赖子尼等（2008）的实验配方制备的固定化聚磷微生物小球的弹性与机械强度较好，对含氮磷废水的净化效果表明，菌球对磷有较强的去除能力（从（19．91ʃ1．81）mg·L －1降至（6．19ʃ0．76）mg ·L －1），同时能够去除一定的氮（从（215．82ʃ35.29）mg·L －1降至（183．42ʃ15．35）mg ·L －1）（图10a ）．二者的去除率分别达56．21%和15.01%（图10b ）．其中，固定化材料对氮的吸附比例较小，而对磷的吸附较显著（p ＜0．01），这可能与固定化材料的表面官能团及CaCl 2等对PO 3－4的亲和力强于NO －3有关．同时，固定化微生物（IMOs ）对磷的去除效果也优于氮，说明菌株ED-12可能不具备反硝化能力，对氮的利用仅是生长所需．由PVA +SA +IMOs 组与PVA +SA 组比较可知（图10b ，#表示），无论是氮还是磷，都存在显著差异，说明固定化微生物是氮磷去除的主要贡献者．4结论（Conclusions ）1）本研究成功从高岐村某排污口筛选出1株典型的聚磷微生物，鉴定发现其属于产碱杆菌属（Alcaligenes sp．）细菌，将其命名为Alcaligenes sp．ZGED-12．2）研究发现，菌株ED-12能在高磷浓度下生长，16h 时进入生长对数期．理化因素实验确定了聚磷菌ED-12的最适生长及发挥除磷能力的条件，其中，碳源、氮源和pH 对其影响最大．磷浓度实验表明，低浓度磷不利于菌株ED-12的生长，但过高浓度反而会抑制菌体生长及发挥聚磷功能，最优磷浓度为45mg·L －1．3）本研究成功实现了聚磷微生物的固定化，该固定化小球对氮磷的去除显示出了良好的效果，作用机理包括固定化材料对氮磷的物理化学吸附及微生物的吸收利用（或贮存）．其中，微生物在这个过程中起着关键作用．586。

高效聚磷菌的分离鉴定及除磷性能分析

第３２卷第５期
Ｖ０１．３２Ｎｏ．５
水
资
源
保
护
２０１６年９月
Ｓｅｐ．２０１６
ＷＡＴＥＲＲＥＳ０ＵＲＣＥＳＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ
ห้องสมุดไป่ตู้
ＤＯＩ：１０．３８８０／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４— ６９３３．２０１６．０５．０１３
ｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｈａｄｈｉｇｈｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｒｅｍｏｖｉｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｆｏｍｔｈｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｙｅｘｈｉｂｉｔｅｄｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｌｅａｓｅｉｎｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｓｔａｇｅａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｕｓｒａｂｓｏｐｔｒｉｏｎｉｎｔｈｅｏｘｉｃｓｔａｇｅ．Ｐ１ｈａｄｔｈｅｍｏｓｔｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｂｓｏｐｔｒｉｏｎａｎｄｒｅｌｅａｓｅｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓ．ＴｈｅｍａｘｉｍｕｍｐｈｏｓｐｈｏｕｓｒｒｅｍｏｖｌａｒａｔｅｓｏｆＰ１，Ｐ２，Ｐ３，ａｎｄＰ４ｗｅｒｅ７５．５１％，８．７７％，４７．２６％，ａｎｄ３０．１９％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＤＮＡ，ｉｔｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈａｔＰ１ａｎｄＰ２ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄＢａｃｉｌｌｕｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｂｏｔｈＰ３ａｎｄ

高效聚磷菌的筛选及其应用

关键词生物除磷聚磷菌筛选受污染河水污水处理厂
中图分类号：TU992.3
文献标识码：B
文章编号：1009-0177（2011）02-0019-04
Screening and Application of High Efficient Phosphate-Accumulating Organisms (PAOs)
1 材料和方法
1.1 样品来源
- 19 -
陈亚松，金文标，闫韫，等. 高效聚磷菌的筛选及其应用
Vol. 30, No. 2, 2011
现场采集深圳市布吉河底泥样品于无菌的三角瓶，加适量无菌水后用玻璃珠振荡打碎。
1.2 培养基
富集培养基成分：无水乙酸钠 5.0 g，MgSO4· 7H2O 0.5 g、CaCl2 0.2 g、（NH4）2SO4 2.0 g、KH2PO4 2~ 20 mg、蒸馏水至 1 000 mL、pH 7.2~7.4，依次增加培养基中 KH2PO4 的含量：2、5、8、10、15、20 mg。
Chen Yasong1, Jin Wenbiao2, Yan Yun2, Zhao Yongjiao2 (1. BCEG Environment Development Co., Ltd., Beijing 100192, China; 2.Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China)
经过 5 次富集培养、4 次分离纯化，得到一株高效聚磷菌 HJP07（保藏号 CGMCC NO2164）[7]。该菌株在含不同磷浓度（5、10、15、20 mg ／ L）的富集培养液的聚磷效果见表 1。

高效反硝化聚磷菌株的筛选及其生物学特性

Ｃａｉｔｒａｓｓｗｅｅｓｒｅｅｈｏｐｈｔｔｋｅｅｐｅｉｅｔ，ｗｈｅｅｎｉｒｔｓｗｅｅｄｎｔｉｉｄｔｎｄｄａｅｏｇｎｉｍｒｃｅｎｄｂｙａｐｓａｅｕｐａｘｒｍｎｒｔａｅｒｅｉｒｆｅｏ
维普资讯
第２卷第６８期
２００７年６月
哈
尔
滨
工
程
大
学
学
报
ＶｏｎＥｎｉｅｒｎｉｅｓｔｏｒａｒｉｇｎｅｉｇＵｎｖｒｉｙｏ
１５０００１）
摘要：为研究反硝化聚磷菌的生物学特性，过吸磷试验、酸盐还原产气试验及异染颗粒和Ｐ通硝ＨＢ颗粒染色辅助
检验，稳定运行的厌氧／从缺氧ＳＲ反应器中分离筛选出４株高效反硝化聚磷菌Ｈ１、９Ｈ２Ｂ６Ｈ１、４和Ｘ．ｇ经鉴定，３前
ＣｖｌＥｎｉｅｒｎＨａｂｎＥｎｉｅｒｎｉｅｓｔＨａｂｎ１００，ｉａｉｉｇｎｅｉｇ，ｒｉｇｎｅｉｇＵｎｖｒｉｙ，ｒｉ５０１Ｃｈｎ）
ＡｂｔａｔＴｏｔｙｔｏｏｃｌｈａａｔｒｓｉｓｏｄｎｔｉｙｎｇｈｏｐｔ — ｃｕｍｕｌｔｎｇｏｇｎｓｓｒｃ：ｓｕｄｈｅｂｉｌｇｉａｃｒｃｅｉｔｃｆｅｉｒｆｉｐｓｈａｅａｃａｉｒａｉｍｓ（ＤＮ—
者属于假单胞菌属（ｓｕｏｏａ）后者属于肠杆菌属（．ｔｒｂｃｅ）测定了这４株菌的生长曲线，究了温度和Ｐｅｄｍｎｓ，Ｆｅｏａｔ．ｎｒ研

高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析2009

第37卷第10期东　北　林　业　大　学　学　报Vol.37No.10 2009年10月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Oct.2009高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析李　博　赵　敏　李宝赫　刘哲君(东北林业大学,哈尔滨,150040) 摘　要　从运行稳定的S BR反应池好氧末端的活性污泥中分离筛选出1株高效聚磷菌LB4,结合生理生化特征分析和16S r DNA分子生物学技术,鉴定该聚磷菌为鲍曼不动杆菌(A cinetobacter baum annii);以E BPR工艺过程为载体,模拟将来可能采用的含可利用碳源的工业废水作为进水,探讨了不同营养条件下菌株LB4的除磷行为,初步分析了其代谢机理,研究表明:菌株LB4除磷的最佳温度为30℃、最适pH值为7.0,微量元素的有无对该菌株的除磷效能影响不大,提高生物除磷系统除磷效率的关键是提高厌氧释磷量。

关键词　聚磷菌;鉴定;除磷效能;基质代谢分类号　X703Screen i n g of Stra i n L B4w ith H i gh Capab ility of Accu m ul a ti n g Polyphospha te and Its Character isti cs/L i Bo,ZhaoM in,L i Baohe,L iu Zhejun(College of L ife Sciences,Northeast Forestry University,Harbin150040,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2009,37(10).-85～87A strain LB4,with a high capability of accu mulating phos phate,was is olated fr om activated sludge of sequencingbatch react or.The strain was identified as A cinetobacter baum annii in ter m s of its mor phol ogical and physi ol ogical featuresby16S r DNA sequence analysis.The phos phate2accu mulating effects of strain LB4were studied with industrial waste waterunder different nutriti onal conditi ons according t o the enhanced bi ol ogical phos phorus re moval p r ocess,and the metabolicmechanis m of strain LB4was als o analyzed.The op ti m u m pH and temperature for accu mulating polyphos phate were7.0and30degrees C,res pectively.The effect of m icr oele ment on phos phate re moval rate was unobvi ous.The key t o increasethe phos phate re moval capacity is t o i m p r ove the efficiency of phos phorus up take in the bi ol ogical phos phorus re moval sys2te m during the anaer obic stage.Keywords　Polyphos phate2accu mulating organis m s;I dentificati on;Capability of phos phate re moval;Metabolic mechanis m 近年来,由于生物除磷具有低能耗、低成本、少污染和高效率等优点而逐渐成为治理水体磷污染、克服富营养化的研究热点。

高效聚磷菌筛选综述

高效聚磷菌的分离、筛选和效率研究进展摘要：高效聚磷菌的获得是深入把握生物除磷的复杂机制以及优化生物除磷工艺设计的基础。

该文对比分析了近年来对高效聚磷菌的分离筛选与效率等方面的研究进展。

关键词：富营养化；生物除磷；聚磷菌Research Progress of Isolation.Screening and Efficiency of High-efficient Polyphosphate-accumulating OrganismsAbstract:Acquisition of high－efficient polyphosphate－accumulating organisms (PAOs) could lay foundation for exploring the complex mechanisms of biological phosphorus removal and optimization of its processing design. This article reviews the methods used in the isolation，screening and genetic building of high－efficient PAOs in recent year.Keywords:eutrophication; biological phosphorus removal; polyphosphate－accumulating organism我国磷矿资源丰富, 储量约14Gt,仅次于美国、摩洛哥,居世界第三位,是世界上重要的磷化工产品生产国,年产量近9Mt(以P2O5含量计)[1]。

尽管我国磷矿资源十分丰富,但大部分属沉积磷块岩矿床,以P2O5计占90%以上,这类矿石品位低,杂质多,P2O5的含量平均值只有17%-22% ,且80%磷矿含镁量偏高,嵌布粒度细[2]。

高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究

高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究引言：随着工业化进程和人口数量的不断增长，废水处理成为一个重要的环境保护问题。

氮和磷是废水中的主要污染物，其过度排放对水体生态系统产生了巨大的影响。

因此，研究高效反硝化聚磷菌的筛选、脱氮除磷条件和性能具有重要的理论意义和应用价值。

一、高效反硝化聚磷菌筛选方法在废水处理过程中应用高效反硝化聚磷菌具有很大的潜力，但在实际操作中，如何筛选出高效的菌种仍然是一个挑战。

目前，采用筛选菌群、精确鉴定和进一步培养的方法成为常用的筛选高效菌种的方法。

通过研究和对比已有的菌种，综合考虑菌株的生理特性、菌株的适应性以及菌株对果胶的利用能力等因素，可以筛选得到高效反硝化聚磷菌。

二、脱氮除磷条件的研究为了进一步提高高效反硝化聚磷菌的脱氮除磷效果，需要研究相应的条件。

首先，反硝化过程需要提供合适的碳源，可以选择易于降解的有机物来提供碳源，如果胶、乳酸等。

其次，需要有适宜的温度和pH条件。

通常，25-30°C和pH为7-8的条件是比较适宜的。

此外，还需要适量添加无机盐，如氯化钠和硫酸铵等，来提供反硝化和除磷过程所需的元素。

三、高效反硝化聚磷菌的性能研究高效反硝化聚磷菌不仅需要在脱氮除磷方面表现出良好的性能，而且需要对其他的废水处理指标具有一定的影响。

通过研究菌种的效能特点、反应动力学、通量等参数，可以评估高效反硝化聚磷菌在废水处理中的性能。

此外，还需要对其代谢产物进行分析，了解其对环境的潜在影响。

四、应用前景与实际应用高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究不仅对理论研究具有重要的意义，而且对实际应用也具有重要的价值。

目前，高效反硝化聚磷菌在废水处理领域的应用已经取得了一些成果，并逐渐得到应用和推广。

未来，随着技术的不断进步，相信高效反硝化聚磷菌在废水处理领域将发挥更大的作用。

结论：高效反硝化聚磷菌的筛选及其脱氮除磷条件和性能研究对于废水处理具有重要的理论意义和应用价值。

一株聚磷菌GP44的筛选、鉴定及其聚磷特性研究

土壤(Soils), 2009, 41 (5): 757~763一株聚磷菌GP44的筛选、鉴定及其聚磷特性研究①赵海泉，胡子全（安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：采用纯培养结合蓝白斑筛选法从巢湖和南淝河底泥中分离筛选出能聚磷（P）的 11 株解 P 细菌，好氧培养时菌体吸 P 能力测定结果表明，GP44 的菌体含 P 量达到 11.92%，具有较高的聚 P 能力，对其初步鉴定为鉴定菌株 GP44 属肠杆菌科中的克雷伯氏菌属土生克雷伯氏菌（K.terrigena）。

GP44 在废水合成培养基上最佳聚 P 温度 30℃、初始 pH 为 7.5、最佳装液量为120 ml/250 ml 和最适 C 源是葡萄糖，Mg2+、K+ 和 Fe3+ 有利于菌株 GP44 的生物除P。

关键词：聚磷菌；筛选；鉴定；聚磷特性中图分类号： X172磷（P）是水体产生富营养化的主要营养物质，水体一旦富营养化，即使切断外界N、P 营养元素也难以自净恢复。

目前，国内外污水除P技术主要有物理法、化学法和生物法3类。

物理法除P效果较好，但其只适合处理流量较小，含P量较高的工业废水，成本又过高，技术复杂，因而无法得到普遍的应用[1]。

化学法对P的去除率较高，一般可达75% ~ 85%，处理效果稳定，污泥在处理和处置过程中不会重新释放P。

但是在化学方法处理过程中使用的化学试剂常会引起二次污染，且污泥产量大，远远不能满足现在大规模控P现实情况[2]。

生物法是利用微生物的生理活动实现除P，其处理效率高，运行成本较低，污泥产量较小，减少污泥膨化，对环境造成的副作用较小。

由于藻类除P和大型水生植物普遍应用也存在一定的困难，因此目前国内外的研究学者把目光集中在微生物除P的研究中。

但是大多数研究学者主要研究微生物的除P工艺的改进和创新，而对聚磷菌聚P机理研究进展比较缓慢。

对聚P机理研究的最大障碍是聚磷菌筛选的较少，分离纯化培养较为困难，而且筛选的聚磷菌稳定性较差，且纯化分离的菌种不能在聚P工艺中表现好氧聚P和厌氧释P的聚P特性[3]。

高效低温聚磷菌的筛选及特性研究

摘
要：通过人工模拟自然降温的方式，Ａ／从０反应器驯化污泥中筛选到低温条件下聚磷效果较好的三株功
能菌株Ｐ、２Ｐ，１Ｐ、３经试验得到一种分离聚磷菌效果较好的方法一稀释混合平板法；分析研究三株茵的聚磷效
果、生化特性，测定三株茵的多维生长曲线，究了温度、Ｈ、量元素对这三株茵的生长量及除磷率的影响，研ｐ微结果表明，三株茵的生长最适温度均为１℃ ，宜的生长和除磷ｐ５适Ｈ为中性偏碱。最后用分子生物学的方法对三株菌进行鉴定，三株菌均属于不动杆菌属的约氏不动杆菌（ｉｅｂｃｅｈｓｎｉ。ＡｃｔａｔＪｎｏ）ｎｏｒｏｉ关键词：低温；聚磷菌；生长曲线；Ｈ值；ｐ温度；微量元素；菌株鉴定
ｔａｈｉｔｎｌｎｉｇｍｅｈｄｗｓｆｖｒｂｅｔｏａｅｐｏｐａｅ—ａｃｍｕａｉｇｏｇｎｓｙｓｕｙｎｎｔｅｒｐｏｐＯｌＳａ－ｈｔｔｅｄｌｉ／ｂｅｄｎｔｏａａｏａｌｏｉｌｔｈｓｈｔ — ｃｕｌｔｒａｉｍｓｂｔｄｉｇｏｈｉｈｓｈ／ｃｕｏｓｎｌ－ｃｍｕａｉｎቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｃｐｂｌｙａｄｂｏｈｍｉａｅｔｒｓｎｏｄｒｔｅｔｔｅ２ｈｇｏｈｃｒｅ，ｉｏａｔｆｃｏ，ｔｍｐｒｔｒ，ｐａｄｕｌｔａａｉｔｎｉｃｅｃｌｆａｕｅ．Ｉｒｅｏｔｓｈ４ｒｗｔｕｖｏｉｍｐｒｎａｔｒｅｅａｕｅＨｎｔｓｔａｅｅｅｎｓｖｌｅｗｅｅｓｕｉｄｔｖｌａｅｔｅｒｆｅｔｎｔｅｇｏｔｎｈｓｈｒｓｒｍｏａａｉｓｏ，ＰｒｃｌｍｅｔａｕｒｔｄｅｅａｕｔｉｆｃｈｒｗｈａｄｐｏｐｏｕｅｖｌｔｆＰ１２，ａｄＰｏｈｅｏｒｏｎ３．Ｒｅｕｔｓｌｓｓｏｈｔｔｅｏｔｌｔｍｐｒｔｒｏｈｈｅｔｉｓｇｏｈｉｂｕ５．ｈｓｈｒｓｒｍｏａｒａｌｆｕｔａｎｒｐｉｌｎｈｗｔａｈｐｉｅｅａｕｅｆｒｔｅｔｒｅｓｒｎｒｗｔｓａｏｔ１ ℃ ｐｏｐｏｕｅｖｌｒｓｒｉｓａｅｏｔｍａａｏｆｌｏｍａｉａｍｉｌｌａｉｃｎｉｏ．Ｆｎｌ，ｔｅｍｏｅｕａｉｌｇｔｏｄｐｅｅｔｙｔｅｔｒｅｐｏｐａｅａｃｍｕａｉｇｂｃｅｉｎｌｙａｋｌｏｄｔｎｉａｌｈｌｃｌｒｂｏｏｍｅｈｄｉａｏｔｄｉｎｉｈｅｈｓｈｔｃｕｌｔａｔｒａｄｄｉｙｙｓｄｆｈｎａ

高效解磷细菌的分离筛选及其与磷矿物相互作用研究的开题报告

高效解磷细菌的分离筛选及其与磷矿物相互作用研究的开题报告一、研究背景和意义随着农业生产规模的扩大和精细化管理的推广，迫切需要开发一种高效稳定的解磷微生物制剂，以降低农业生产的氮磷耗损和环境污染。

高效解磷微生物可通过利用多种途径显著提高土壤有效磷含量，提高农作物的磷利用效率，同时减轻化肥施用压力和水体富营养化，具有显著的环境和经济价值。

当前，国内外对解磷微生物的研究主要集中在筛选高效解磷菌株上，但是高效解磷菌株的筛选成为了研究的一大瓶颈，如何高效快速的筛选到高效解磷微生物，成为了解决问题的一个关键点。

因此，对于高效解磷微生物的筛选、鉴定和其与磷矿物相互作用的研究具有很大的实际应用和理论意义。

二、研究内容和方法本文旨在探讨高效解磷微生物的分离筛选及其与磷矿物的相互作用。

本研究将从以下三个方面展开：（1）样品的采集和处理。

采集不同产地的土壤和污泥样品，并进行预处理，以提高筛选高效解磷微生物的效率。

（2）高效解磷微生物的筛选与鉴定。

采用传统的菌落计数法、酶活性测定法、磷酸盐测定法、荧光定量PCR法等多种方法对样品进行高效解磷微生物的筛选与鉴定，并对其进行生理生化特性分析。

（3）高效解磷微生物与磷矿物的相互作用研究。

采用SEM、TEM、XRD、FTIR等仪器对高效解磷微生物与磷矿物之间的互作进行分析，探究微生物在解磷过程中与矿物表面的相互作用机制。

三、预期成果本研究旨在分离筛选高效解磷微生物，并探究其与磷矿物的相互作用机制。

预期将获得以下成果：（1）筛选得到多种高效解磷细菌，并进行鉴定和生理生化特性分析；（2）探究高效解磷微生物与磷矿物之间的相互作用机制，揭示微生物解磷过程中的关键环节和分子机制；（3）为高效解磷微生物的应用提供理论基础和实验依据，为缓解土壤磷资源匮乏和环境污染问题提供参考和支持。

四、研究进度安排本研究计划历时2年，主要研究任务安排如下：第一年：（1）采集样品进行预处理，并建立高效解磷微生物筛选平台；（2）筛选高效解磷微生物，并进行鉴定和生理生化特性分析；（3）研究高效解磷微生物对不同磷矿物的解磷效果及其作用机制。

e4高效解磷细菌菌株的分离、筛选及组合

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郝晶等：石灰性土壤中高效解磷细菌菌株的分离、筛选及组合
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图 !" 供试土壤中分离的解磷细菌有机磷溶磷圈 #$%& !" ’(%)*$+ , -)./ /0 ,12/.34$.$5$*% 4)+67($). 26()$*2 $2/.)678 0(/9 6-7 672678 2/$. !: 号土采自山西农业大学植物园， !; 号土采自岢岚城北玉龙村附近" </& !: 2/$. $2/.)678 0(/9 6-7 =/6)*$+). >)(87* /0 ?-)*@$ A%($+3.63(7 B*$C7(2$6D )*8 </& !; 2/$. 0(/9 E3./*% F$.1 .)%7 $* */(6- /0 G7.)* H$6D
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富营养化湖泊沉积物聚磷菌的分离鉴定及除磷特性

富营养化湖泊沉积物聚磷菌的分离鉴定及除磷特性杨㊀波1∗㊀王㊀文1㊀毕㊀磊2㊀曾清如3㊀周细红3㊀刘爱军3(1.三亚学院翟明国院士工作站,海南三亚572022;2.中国科学院生态环境研究中心环境纳米技术与健康效应重点实验室,北京100082;3.湖南农业大学资源环境学院,长沙410128)摘要:采用经典的稀释混合平板法,从昆明滇池沉积物中分离出1株高效聚磷菌,并结合16sRNA 基因序列分析进行了菌株的鉴定,在此基础上研究了其在不同理化因素条件下的除磷特性㊂研究结果表明,分离出的菌株为节杆菌属(Arthobacter sp.),将其命名为Arthobacter sp.B ㊂在富磷培养基中接种培养12h 该菌株即能完成对数增长期,在磷浓度为2mg /L ㊁温度为30~35ħ㊁pH 值为6~7㊁以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为唯一碳源和以牛肉膏㊁蛋白胨为唯一氮源时,菌株B 在培养周期内生长迅速,体系的除磷率都在80%以上,而当温度低于15ħ或高于35ħ㊁pH 值低于5或高于8时,菌株的生长受到明显抑制,除磷率也较低㊂同时研究结果发现,该菌株的生长会影响其生长环境基质的pH 值,在一定范围内,可调节pH 至其最适的生长区间㊂进一步的分析表明,该菌株利用碳源和氮源的方式和机理有别于传统的活性污泥中的反硝化聚磷菌,对蔗糖㊁葡糖糖等大分子有机碳源具有较高的利用率和亲和力,此外,该菌株不能利用铵盐作为唯一氮源来加以利用㊂关键词:聚磷菌;分离;鉴定;节杆菌属;除磷率㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀收稿日期:2019-11-18基金项目:海南省自然科学基金项目(617180);海南省重点研发计划项目(ZDYF2018144)㊂∗第一作者㊁通信作者:杨波(1981-),男,博士,副教授,主要从事环境污染与防治研究㊂yangbo810819@ISOLATION ,IDENTIFICATION AND PHOSPHORORUS-REMOVAL CHARACTERIZATIONOF PHOSPHATE ACCUMULATING ORGANISMS COLLECTEDFROM EUTROPHIC LAKE SEDIMENTYang Bo 1∗㊀Wang Wen 1㊀Bi Lei 2㊀Zeng Qingru 3㊀Zhou Xihong 3㊀Liu Aijun 3(1.Zhai Mingguo Academician Work Station,Sanya University,Sanya 572022,China;2.Key Laboratory of Environmental Nanotechnology and Health Effects Research Centerfor Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100082,China;3.College of Resource and Environment,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)Abstract :A phosphate accumulating organisms was isolated from eutrophic sediment which located in Dianchi Lake,Yunnan,China.The strain,named Arthobacter sp.B,was obtained by classic methods for screening microorganisms together with 16srRNA gene analysis.Effects of different culture conditions to the bacterial growth and phosphorus removal efficiency werestudied.The results showed that the logarithmic growth phase was completed within 12hours after incubation,the optimal temperature range was from 30ħ~35ħ,the optimal initial pH was 6~7,and the best carbon source were sucrose,glucoseor maltose,the best nitrogen source were beef extract or peptone.Under these optimized condition,the phosphorus removal efficiency was higher than 80%with maximum growth rate of the strain B.On the contrary,when the temperature was below15ħor above 35ħand the pH was below 5or above 8,which would obviously inhibit the growth of strain B,eventually ledto lower phosphorus removal efficiency.The results also showed that the strain B could affect the pH during its growth period in a certain extent,and adjusting the pH value to its optimum range was observed.The utilization mode and mechanism of carbonsource and nitrogen source for the strain was different from denitrifying phosphate accumulating organisms which existed inactivated sludge.Further study revealed that the strain B could utilize macromolecule carbon source such as sucrose,glucoseand maltose effectively.In addition,ammonium salt could not use be the sole nitrogen source to support the growth of strain B.Keywords:phosphate accumulating organisms;isolation;identification;Arthobacter sp.;phosphorus removal efficiency0㊀引㊀言水体富营养化是全球范围内主要的水体污染问题之一㊂一般认为水体中氮㊁磷等营养物质过剩是造成富营养化的主要原因,其中又以磷为主要污染因子[1-3],所以去除水体中过量的磷显得尤为重要㊂生物除磷法的基本原理是利用活性污泥中的聚磷菌(phosphate accumulating organisms,PAOs),在好氧条件下,可超出其生理需要的从污水中过量摄取磷,并以多聚磷酸盐储存于体内形成聚磷污泥,并最终通过污泥的排放达到从污水中去除磷的目的[4,5]㊂在生物除磷法中,高效聚磷菌的筛选成为了首先要考虑的问题[6]㊂为获得高效聚磷菌物种资源,至今已有多种具备较强聚磷能力的微生物被筛选出来[6-10]㊂目前,关于聚磷菌的研究,大多数集中于高浓度废水和污水的活性污泥处理系统[7,11-15],而直接从富营养化水体沉积物中分离筛选高效聚磷菌并研究其除磷特性目前报道较少㊂伍思宇等[16]和佘晨兴等[17]从天然湖库水体沉积物筛选了具有一定聚磷能力的若干种菌株,但并未就其在不同理化条件下的除磷特性做进一步的研究㊂本研究从富营养化水体沉积物中分离筛选出高效除磷的聚磷菌菌株,并研究其在不同理化因素影响下的生长及除磷特性,期望能对富营养化水体生物除磷技术提供有用的菌种资源和基础性研究支持㊂1㊀材料与方法1.1㊀材㊀料1.1.1㊀微生物沉积物来源沉积物样品分别来自昆明滇池,大理洱海和太湖梅梁湾,用于菌种的分离与筛选㊂1.1.2㊀培养基预培养基:乙酸钠0.5g,MgSO40.4g,CaSO4 0.08g,牛肉膏0.22g,NH4Cl0.15mg,K2SO4 0.018g,Na2HPO43H2O0.008g,蒸馏水1000mL,pH 7.0~7.2.富集培养基:乙酸钠5g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,KH2PO40.02g,蒸馏水1000mL, pH7.0~7.2㊂筛选培养基:乙酸钠0.5g,MgSO4 0.4g,CaSO40.08g,牛肉膏0.22g,(NH4)2SO4 0.2g,FeSO40.002g,蒸馏水1000mL,根据需要分别加入不同浓度的磷㊂富磷培养基:乙酸钠0.5g, MgSO40.4g,CaSO40.08g,牛肉膏0.22g,(NH4)2SO40.2g,FeSO40.002g,K2HPO43H2O0.0147g,蒸馏水1000mL,pH7.0~7.2㊂以上培养基均为液体培养基,且均经过121ħ灭菌20min后使用㊂1.2㊀方㊀法1.2.1㊀菌株的分离和筛选称取采集的沉积物样品2g于250mL锥形瓶中,加入100mL去离子水,摇床培养3d(30ħ, 120r/min),形成泥水混合液,然后转取泥水混合液5mL于100mL磷浓度为2mg/L的富集培养基中,于摇床振荡培养7d(30ħ,120r/min)得到驯化液,再转取2mL驯化液于75mL不同磷浓度的筛选培养基中,于摇床上振荡培养3d(30ħ,120r/min),筛选培养基的磷浓度分别为5,10,15,20,25,30mg/L(以P 计)㊂将富集驯化的菌悬液按10-1~10-7梯度进行稀释,采用混合平板法分离菌株,挑取单菌落,并对挑取的单菌株进行多次培养划线分离纯化得到纯化菌株㊂将分离纯化得到的菌株于预培养基中在120r/min㊁30ħ条件下摇床振荡培养12h㊂然后将菌液在8000r/min条件下离心5min,再将菌液转接于富磷培养基(磷含量为2mg/L)中,于120r/min㊁30ħ条件下摇床振荡培养至菌液变浑浊.然后在10000r/min转速下冷冻离心10min,取上清液测定总磷浓度,并用未接种菌株的富磷培养基做对照实验,计算各菌株除磷率,筛选出高效除磷菌株㊂将筛选出的高效除磷菌株进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色,确定含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落进行后续实验㊂1.2.2㊀菌株的鉴定采用Ezup柱式细菌DNA快速提取试剂盒提取待鉴定菌株的基因组DNA㊂扩增16S rDNA引物,正向引物:5ᶄ-GGCGGACGGGTGAGTAA-3ᶄ,反向引物: 5ᶄ-GGACTGCTGCCTCCCGTAG-3ᶄ㊂反应过程:94ħ预变性5min,94ħ30s,54ħ50s,72ħ1min,30个循环,72ħ延伸10min,然后经过凝胶电泳和PCR产物回收㊂PCR产物交于上海生工生物工程有限公司进行测序,测序结果登陆GenBank进行比对分析㊂1.2.3㊀不同理化因素对聚磷菌生长及除磷特性的影响磷浓度及培养时间对聚磷菌生长及除磷率的影响:将筛选纯化得到的菌株接种到装有100mL预培养基的锥形瓶中,在120r/min,30ħ条件下振荡培养24h,然后将预培养液按2%接种到100mL调整了磷浓度的富磷培养基中(磷浓度分别调整为2,5, 8mg/L),在120r/min,30ħ条件下振荡培养,分别于8,12,24,36和48h取培养液测定菌株生长情况,并计算除磷率㊂温度对聚磷菌生长及除磷率的影响:将上述预培养液按2%转接到装有100mL富磷培养基的锥形瓶中,在120r/min和不同温度条件下振荡培养2d,温度梯度分别设置为10,15,20,25,30,35,40ħ㊂培养完成后取培养液测定菌株生长情况并计算除磷率㊂pH对聚磷菌生长及除磷率的影响:将上述预培养液按2%转接到装有100mL富磷培养基的锥形瓶中,设置培养基的pH值分别为4㊁5㊁6㊁7㊁8㊁9㊁10,在120r/min㊁30ħ条件下振荡培养2d㊂培养完成后取培养液测定菌株生长情况并计算除磷率㊂不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响:以不含乙酸钠的富磷培养基为基础,按照1%添加量分别加入葡萄糖㊁木糖㊁蔗糖㊁麦芽糖㊁乳糖㊁乙酸钠㊁乙醇㊁可溶性淀粉作为唯一碳源配置培养基㊂同时,以不含牛肉膏和硫酸铵的富磷培养基为基础,按照1%添加量分别加入牛肉膏㊁蛋白胨㊁尿素㊁酵母粉㊁硝酸钾㊁氯化铵㊁硫酸铵作为培养液唯一氮源配置培养基㊂然后按照2%预培养液接种量,于上述不同碳源和氮源的富磷培养基中,在120r/min㊁30ħ条件下振荡培养2d,分别考察不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响㊂1.2.4㊀分析测试方法㊀总磷采用钼锑抗分光光度法(GB11893 89)测定㊂菌体的生长情况采用光电比浊法即OD值法测定[18],利用UV2300型分光光度计在波长为600nm 处测定菌悬液的吸光度值OD600,用来表示菌体的细胞浓度.异染颗粒采用Albert染色法染色,PHB颗粒采用苏丹黑染色法染色[19]㊂1.2.5㊀数据处理与统计分析实验结果用EXCEL2010进行数据处理和绘图,每组实验做3个平行,结果取其平均值,实验结果以MeanʃSD来表示㊂2㊀结果与分析2.1㊀高效聚磷菌的筛选与鉴定2.1.1㊀高效聚磷菌的分离与复筛㊀采用稀释混合平板法,通过对菌株进行富集驯化㊁划线分离与纯化,将所得菌种接种于富磷培养基进行除磷率的测定,筛选出除磷率在50%以上的7株菌,并进行PHB颗粒和异染颗粒实验,实验结果见表1㊂由表1的实验结果可知,在除磷率50%以上的7株菌中,菌株B的PHB颗粒染色和异染颗粒染色效果较明显,同时除磷率达到了78.4%,因此,选择菌株B进行后续的研究㊂表1㊀聚磷菌菌株筛选结果比较菌株名称除磷率/%PHB颗粒异染颗粒A58.4%未观察到有,较小B78.4%有,明显有,较大C76.2%未观察到有,小D65.1%有,不明显有,较小E59.1%有,不明显有,小F62.5%未观察到有,小G52.2%有,不明显有,小2.1.2㊀菌株的形态特征及鉴定㊀分离纯化的菌株B菌落的形态如图1所示㊂经观察,形成的菌落菌苔丰厚,呈亮黄色,半透明状,表面光滑有光泽,隆起,粘稠湿润㊂图1㊀菌株B的形态将测序得到的菌株16S rDNA与NCBI Genbank 数据库进行Blast比对,采用MEGA4.0对16SrDNA 结果进行比对分析,将所选菌株鉴定到属,并采用邻位链接法(Neighbor-joining)绘制系统发育树(图2)㊂NCBI数据库的比对结果表明,该菌株与Arthobacter 的相似性达98%以上,鉴定其为节杆菌属(Arthobacter)㊂2.2㊀磷浓度及培养时间对聚磷菌生长及除磷率的影响由图3可以看出,在30ħ振荡培养条件下,菌株B在3种不同磷浓度的富磷培养基中均能正常生长,培养时间12h内,OD值增加明显,说明生物量增长迅速,12h既能达到最大生物量,随后的48h内生物图2㊀菌株B 的系统发育树量基本保持稳定,但略有下降,说明菌株B 的最佳培养时间为12h 左右㊂同时,结果表明,菌株B 在3种不同磷浓度的富磷培养基中生物量差别不大,说明菌株B 在磷浓度达到一定值后,过量的磷并不会刺激其生长㊂图3㊀不同磷浓度培养条件下菌株B 的生长及除磷特性除磷实验发现,菌株B 除磷率变化趋势与其生长曲线基本相吻合㊂在磷浓度为2mg /L 时,除磷率在8~12h 内急剧上升,由51.2%上升到96.8%,除磷效果明显,12h 后除磷率略有下降,但也高达85%以上㊂在磷浓度为5和8mg /L 时,随着培养基磷浓度的升高,除磷率整体呈现下降,在培养12h 时,除磷率分别为72.2%和47.9%,除磷率下降明显㊂2.3㊀温度对聚磷菌生长及除磷率的影响每1种特定微生物都有其温度适应范围及最适温度㊂如图4所示,菌株B 在温度为30ħ时生物量和除磷率都达到最高,当温度低于15ħ时,菌株B 生物量较低,除磷率也较低,随着培养温度的上升,菌株B 的生物量和除磷率也快速增长,当温度为30ħ时,菌株B 生物量和除磷率都达到最高,而当温度超过35ħ时,菌株B 生物量和除磷率都急剧下降㊂实验结果表明,菌株B 在20ħ~35ħ之间均能正常生长,但是除磷率仅在30~35ħ维持在较高水平,说明温度对菌株B 的除磷效率的影响要大于其对生长的影响㊂图4㊀温度对菌株B 生长及除磷率的影响2.4㊀pH 对聚磷菌生长及除磷率的影响由图5可知,当接种pH <6时,菌株B 的生长受到了明显的抑制,尤其是接种pH 值<5以下菌株B 很难生长,菌株B 的最佳接种pH 为6~7,当接种pH 超过8后,随着pH 的增加生物量快速减少,说明此时生长受到明显抑制㊂同时,B 菌除磷率的变化趋势与其生长趋势基本相吻合,在接种pH 为6~7时,除磷率最高,pH 超过7后,随着pH 的上升,除磷率显著下降㊂图5㊀pH 对菌株B 生长及除磷率的影响2.5㊀不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响如图6所示,不同碳源对菌株B 的生长和除磷率影响较大㊂当以乙醇和木糖为碳源时,菌株B 生长受到明显抑制,生物量较低,除磷率也较低;当以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为碳源时,菌株B 生长迅速,其生物量和除磷率都处于较高水平㊂值得注意的是,以乳糖作为碳源时,菌株B 生长受到明显抑制,生物量很低,但是其除磷率却较高,而以可溶性淀粉作为碳源时,菌株B 的OD 600值较高,暗示生物量较大,但是除磷率却很低.另外,乙酸钠为碳源时,菌株B 生物量虽然不是最高,但是也能够正常生长,除磷率也处于较高水平㊂综合来说,在以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖为唯一碳源时,菌株B 具有较高的生长速率和除磷率,这3种碳源是菌株B 较理想的碳源㊂图6㊀不同碳源对菌株生长及除磷率的影响如图7所示,不同氮源对菌株B 的生长和除磷率具有较大的影响㊂当分别以牛肉膏㊁蛋白胨为唯一氮源时,菌株B 生长旺盛,生物量较大,同时除磷率也较高㊂当分别以硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钾和尿素作为唯一碳源时,菌株B 的生长缓慢,在培养周期48h 达不到较高的OD 600值,同时,除磷率也处于较低水平㊂当以酵母膏作为唯一碳源时,菌株生长较旺盛,在培养周期48h 内能达到较高的OD 600值,但是其除磷率却低于10%㊂图7㊀不同氮源对菌株生长及除磷率的影响3㊀讨㊀论聚磷菌含有典型的PHB 颗粒和异染颗粒,PHB 颗粒可被脂溶性染料苏丹黑着色,异染颗粒可被甲苯胺蓝和次甲基蓝染成紫色,可与其他非颗粒性物质区分开来[19]㊂目前发现的聚磷菌种类繁多,分属不同类群微生物,天然水体沉积物中发现的常见聚磷菌多为:不动杆菌属(Acinetobacter )㊁假单胞菌属(Pseudomonas )㊁芽孢杆菌属(Bacillus )㊁寡养单胞菌属(Stenotrophomonas )㊁厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter )㊁聚磷小月菌(Microlunatus phosphovorus )和甲基杆菌属(Methylobacterium )等[16,17,20-22]㊂本研究中,从富营养化水体滇池沉积物中分离筛选出的菌株B 具有明显的PHB 颗粒染色和异染颗粒染色效果,同时具有较理想的除磷效果,经鉴定其为节杆菌属(Arthobacter )㊂本研究发现,在培养基初始磷浓度为5和8mg /L 时,除磷率明显降低(图3),但并不能说明菌株B 在初始磷浓度升高条件下除磷能力减弱㊂结合图2,经过计算,菌株B 在培养时间48h 内除磷量的统计发现,体系初始磷浓度为5和8mg /L 时,其除磷量是高于初始磷浓度为2mg /L 时的体系(图8),而此时菌株B 的生物量并没有较磷浓度为2mg /L 时有明显增长,这说明菌株B 除磷能力并没有减弱㊂磷浓度升高时菌株B 表现为除磷率降低的原因在于磷浓度较低时(2mg /L),除磷量没有达到饱和,在磷浓度增加和菌株B 的生物量并没有明显增加的条件下,除磷量逐渐达到饱和,而除磷率是以初始磷浓度作为基数来进行计算的,因此结果表现为高浓度磷培养条件下除磷率降低㊂进一步的,根据图8的计算结果推算菌株B 的除磷极限初始磷浓度大约为3.7mg /L,说明当初始磷浓度低于3.7mg /L,菌株B都应能保持有较高的计算除磷率㊂图8㊀培养液初始磷浓度和除磷量的关系聚磷菌的生长受环境的pH 影响很大㊂环境pH 值会影响细胞在培养基中的氧化还原电位和带电状态,进而影响菌体对营养物质的吸收和利用以及代谢过程中酶的反应活性,最终影响除磷性能[23-25]㊂大量研究表明,活性污泥中的聚磷菌在中性或偏碱性的条件下能够占据优势地位,系统能够取得较好的除磷效果[14,26,27]㊂李楠等的研究发现,在中性(pH=7)和弱碱性(pH=8)条件运行下的生物除磷反应器中,聚磷菌在活性污泥微生物中的含量甚至能达到60%以上[14]㊂本研究中,对各梯度接种培养后48h培养基的pH的测定结果发现,在本实验培养48h时,不同pH梯度培养基的PH值发生了较明显变化,pH值梯度为5㊁6㊁7㊁8㊁9的培养液接种培养48h后培养基的pH均集中在6.3~6.6(表2),说明菌株B最适的生长pH为中性或偏弱酸性,并且菌株B的生长会影响其生长环境基质的pH值,在一定范围内,可调节pH 至其最适的生长范围,但是,pH值超过了其生长适应范围,则不能将其调节至最适生长pH区间,如本实验中的初始pH为4.0和10.0,在培养时间48h后,菌株B基本不能生长,其培养基pH值始终处于较低或较高范围㊂表2㊀菌株B培养前后培养基pH值的变化培养状态培养基pH值培养前 4.0ʃ0.2 5.0ʃ0.2 6.0ʃ0.27.0ʃ0.28.0ʃ0.29.0ʃ0.210.0ʃ0.2培养后 4.7ʃ0.2 6.4ʃ0.3 6.5ʃ0.3 6.5ʃ0.4 6.3ʃ0.3 6.6ʃ0.28.0ʃ0.1㊀㊀本研究中,将不同理化因素条件下的菌株生长量与除磷率做一相关性分析,如图9所示㊂结果表明在不同培养时间㊁不同pH和不同温度培养条件下,菌株B的除磷率和反映其生物量的OD600值呈现出明显的正相关(图9a),线性关系明显,且基本处于同一线性关系中,说明上述3个因素影响显著影响了菌株B的生长和繁殖,生物量的高低决定了体系内除磷率的高低㊂不同碳源和氮源对聚磷菌的生长和除磷效果影响很大㊂多数聚磷菌只能以低级脂肪酸类的小分子有机基质作为碳源,并将其合成的PHB以能量形式储存在细胞内[28]㊂在活性污泥法处理工艺中存在的反硝化聚磷菌,当以乙酸钠为碳源时,其除磷效果最佳,而以葡糖糖为碳源时,除磷效果较差,其原因在于活性污泥中聚磷菌吸收乙酸等小分子有机物时不依靠主动运输,而是靠被动运输或是扩散作用,不需要消耗能量,而以葡萄糖或蔗糖等大分子有机物为碳源时,不利于被微生物吸收,以致在厌氧环境下不能贮存糖原,从而无法有效转化成PHB,从而影响除磷效果[7,29]㊂本研究中聚磷菌为富营养化湖泊滇池沉积图9㊀不同理化因素条件下菌株B除磷率与生长OD600值的相关性物分离得到,结果表明当以蔗糖㊁葡萄糖和麦芽糖作为碳源时,菌株生长迅速,其生物量和除磷率都处于较高水平,以乙酸钠为唯一碳源时,生物量和除磷率也能达到较高水平,这与前述的研究结果不尽相同㊂屈建航等研究发现,从太湖分离出的一株高效聚磷菌,在葡萄糖和蔗糖作为碳源时,也能取得较高的生物量和除磷率[26],这跟本研究中的结果相似㊂大部分已报道的关于聚磷菌的研究,主要集中于活性污泥法处理工艺中,通常研究对象为反硝化聚磷菌,而从富营养化湖泊沉积物中分离的聚磷菌实为好氧聚磷菌,从上述的分析中可以发现,不同种类的聚磷菌对碳源的利用效果可能不尽相同,除了与分子量与分子结构有关以外,还可能跟菌体本生对碳源的亲和性和其他利用特性也有关系㊂氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质,对蛋白质㊁核酸和其他一些成分的合成非常重要,多数细菌能以铵盐作为唯一氮源[6]㊂本研究发现,分别以硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钾等作为唯一碳源时,菌株B 生长缓慢,除磷率也处于较低水平,说明铵盐并不能作为菌株B的唯一氮源㊂菌株B利用氮源的机理还需进一步的研究和探讨㊂本研究中,不同碳源和不同氮源培养条件下,菌株B的除磷率与OD600值并没有呈现出明显的相关关系(图9b),其中,比较特殊的碳源为乳糖和可溶性淀粉,比较特殊的氮源为酵母膏㊂以乳糖为唯一碳源时,OD600值很低,除磷率却很高㊂有研究表明,某些碳源和氮源当中存在某些含磷杂质,可能会影响除磷率的计算[6],这可能是造成本研究中菌株生长良好,而除磷率却很低的原因㊂而以可溶性淀粉为唯一碳源和以酵母膏为唯一氮源时,OD600值较高,但是除磷率却很低㊂有研究表明,在碱性条件下会导致PO4-3-P 以磷酸盐沉淀的形式析出[6,7],造成除磷率偏高的假象,但是本研究中在以可溶性淀粉为唯一碳源和酵母膏为唯一氮源时,培养基的pH值并没有处于碱性条件下,据此推测,可能是可溶性淀粉和酵母膏中的某些成分导致了磷的析出或者吸附,造成除磷率明显偏高㊂4㊀结㊀论1)采用富集培养及混合平板分离技术,从滇池沉积物中驯化筛选出了一株高效聚磷菌,经分子生物学鉴定,该菌株与Arthobacter sp.的相似性达98%以上,鉴定其为节杆菌属(Arthobacter)㊂2)菌株B在接种培养12h即能完成对数增长期,在磷浓度为2mg/L㊁温度为30~35ħ㊁pH值为6~7㊁以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为唯一碳源和以牛肉膏或蛋白胨为唯一氮源时,菌株B在培养周期内生长迅速,体系的除磷率都在80%以上,而当温度低于15ħ或高于35ħ㊁pH值低于5或高于8时,菌株的生长受到明显抑制,除磷率也较低㊂3)菌株B的生长会影响其生长环境基质的pH 值,在一定范围内,可调节pH至其最适的生长范围㊂菌株B的除磷率和其生物量呈现出明显的正相关,且基本处于同一线性关系㊂4)菌株B利用碳源和氮源的方式和机理有别于传统的活性污泥中的反硝化聚磷菌,对蔗糖㊂葡萄糖等大分子有机碳源具有较高的利用率和亲和力,同时,不能利用铵盐作为唯一的氮源来加以利用㊂参考文献[1]㊀PAERL H W,HAI X,MCCARTHY M J,et al.Controlling harmfulcyanobacterial blooms in a hyper-eutrophic lake(Lake Taihu,China):the need for a dual 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巢湖低温高效聚磷菌的筛选及其特性

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