糖化酶发酵、提取及活力测定

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糖化酶活力测定实验报告

华南农业大学综合实验报告实验项目名称：糖化酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：2学时所属课程名称：食品与发酵工业分析班级：10级生物工程1班姓名：肖佩学号：************指导老师：沈玉栋徐振林一．实验原理采用可溶性淀粉为底物，在一定的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖(还原糖)，以直接滴定法测定。

二．试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜甲溶液（使用时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2）0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。

（3）pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。

（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶三．测定步骤（1）5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min 搅拌一次。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

测定糖化酶活性的方法

酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）式中符号与前式相同，其中： 10-3—— ml换算成L。 106—— μ mol换算成mol。

反应试剂配制方法

（1）2%可溶性淀粉称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入巳沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至 l00ml，此溶液需当天配制。（2）0.2mol/L pH4.6 醋酸钠缓冲液称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.722g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。冰醋酸(CH3COOH) 1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml 和醋酸51ml混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。（3）0.1mol/L碘液称取13g碘及35g碘化钾，溶于100mL水中，稀释定容至1000mL，摇匀，贮存于棕色瓶中。
操作步骤
1. 取7个带塞的试管（其中3个测今年批次的酶活、另外3个测去年批次的酶活、1个作空白对照），分别吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸缓冲液2.5ml，混匀后于40 ℃水浴中预热10min。 2. 加入酶液0.5ml（空白对照组以煮沸失活的酶液代替）于40 ℃，反应10min；反应结束时，立即于沸水浴加热5min使酶失活(此时应将试管的塞子打开）。

糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是从淀粉、糊精、糖原等碳链上的非还原性末端（整个碳链只有一个还原端，与之相对的都是非还原端）依次水解a- 1,4 糖苷键, 切下一个个葡萄糖单元，并像β- 淀粉酶一样, 使水解下来的葡萄糖发生构型变化，形成β- D- 葡萄糖。对于支链淀粉，当遇到分支点时，它也可以水解a- 1,6 糖苷键，由此将支链淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a- 1,3 连接的碳链，但水解a- 1,4 糖苷键的速度最快，它一般都能将淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。

测定糖化酶活性的方法

对照组
I2 NaIO
完全歧化反应，无葡萄糖
NaIO3 I2
实验组
I2
NaIO
NaIO另一部分歧化反应生成NaIO3
NaIO一部分与葡萄糖反应
I2
试剂与器材
1.糖化酶试剂；
2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角瓶、 pH计、电子天平；
3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1mol/L碘液；0.1mol/L氢氧化钠溶液； 2mol/L硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5%淀粉指示剂。
式中:
B——空白滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数；
A——酶液滴定消耗的硫代硫酸钠毫升（ml）数（取3次滴定的平均值）；
N——硫代硫酸钠的当量浓度。
180.1——葡萄糖的摩尔质量。
8/5——表示从8ml酶反应体系取出5ml反应液。
2——所加酶液为0.5ml，按定义为1ml。
60/10——表示酶反应时间为10min，按定义为1h。
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2% 淀粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U）：
酶活力单位（U/ml）=（B－A）×10-3 ×（N/2）× （8/5）×106×2 ×（1/10）
式中符号与前式相同，
其中：
10-3—— ml换算成L。
106—— μmol换算成mol。
4.以0.5%可溶性淀粉为指示剂（4-5滴即可），用0.1N硫代硫酸钠溶液滴定至蓝色消失为终点。记录0.1N硫代硫酸钠消耗的毫升数：酶液样品（A）、空白对照（B）；
计算
(1)在上述条件下，1ml酶液每小时催化2%淀粉溶液生成1mg葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位：

糖化酶活力测定

次碘酸钠法：次碘酸钠法：
碘与 NaOH 作用能生成 NaIO ，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性条件下，未与 C6H12O6 作用的 NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ，便可计算出未参与反应的 NaIO ，由此推导出糖化酶催化所产生的 C6H12O6 的含量。 1.I2 与 NaOH作用: NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2.C6H12O6 与NaIO定量作用: NaIO定量作用: C6H12O6 +NaIO =C6H12O7 + NaI 3. C6H12O6反应完后,剩余的NaIO 反应完后,剩余的碱性条件下发生歧化反应: 在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 4.歧化产物在酸性条件下进一步歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I 作用生成I2: NaIO3 +5NaI +6H2SO4=3I2 +6Na2SO4+3H2O 5.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液析出的I 可用标准Na 滴定之: 滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
实验三
糖化酶活力的测定
指导老师：孙运军研究生：赵渊徐妙
一、目的和内容
目的：学习测定糖化酶活力的原理并掌握测定糖化酶活力的方法内容：１. 内容：１. 学习糖化酶活力的原理．２. 测定并计算糖化酶活力．
二、糖化酶简介以及其活性的测定原理
① 糖化酶的应用及生产 ② 糖化酶的催化原理 ③ 酶活测定方法
（2）在上述条件下， 1ml酶液每分钟催化2%淀 1ml酶液每分钟催化2%淀粉溶液水解生成1 mol葡萄糖的酶量定义为1 粉溶液水解生成1μmol葡萄糖的酶量定义为1个酶活力单位（U 酶活力单位（U）：

糖化酶的生产工艺

糖化酶的生产工艺糖化酶是一种催化糖化反应的酶，可以将淀粉、纤维素等多糖分解成简单的糖类。

由于其广泛的应用于食品、饲料、制糖、生物燃料等领域，糖化酶的生产工艺变得越来越重要。

糖化酶的生产工艺一般分为以下几个步骤：1. 酶源的筛选和培养糖化酶可以从多种微生物中获得，如真菌、细菌、酵母等。

首先需要筛选出具有高效酶活性的酶源，并进行毒力测试排除可能的有害物质。

接着，将所选的酶源进行大规模培养，为后续酶的提取和纯化做准备。

2. 酶的提取和纯化培养出的菌液会经过离心等操作将酶从菌体中分离出来。

接下来，可以利用重组工程技术将酶基因引入适当的宿主细胞进行表达和分泌。

经过多次过滤、层析、浓缩等步骤，可以获得纯化后的糖化酶产品。

3. 酶活力的测试和调整酶的活力是衡量其催化能力的重要指标，因此需要对纯化后的酶进行活力测定。

如果发现酶活力较低或不稳定，可以通过改变培养条件、酶提取和纯化过程中的参数来进行调整，如改变pH值、温度、金属离子浓度等。

4. 酶的固定化处理（可选）为了提高酶在反应体系中的稳定性和重复使用性，可以将酶固定在某种载体上，如多孔陶瓷、聚合物凝胶或生物膜等。

固定化酶可以增加酶的使用寿命和催化效率，减少废液处理的复杂性。

5. 酶活性的保存和包装为了保持酶活性和延长保存期限，酶产品通常会经过冷冻干燥或冷藏等工艺进行保存。

同时，酶产品还需要进行适当的包装，以便在运输和储存过程中保护酶的完整性和稳定性。

总结起来，糖化酶的生产工艺包括酶源的筛选和培养、酶的提取和纯化、酶活力的测试和调整、酶的固定化处理以及酶活性的保存和包装等步骤。

每个步骤都需要进行精确控制，以确保酶产品的质量和稳定性。

随着科技的发展，糖化酶的生产工艺也在不断改进，可以预见未来糖化酶的生产将更加高效、环保和经济。

糖化酶活力测定

3.取上述反应液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液 5ml，缓慢加入0.1N NaOH溶液 5ml ，(注意：加碱速度不能过快,否则过量NaIO 来不及氧化C6H12O6 而歧化为不与C6H12O6反应的 NaIO3 和NaI ,使测定结果偏低) 摇匀，在暗处放置15min后加入1N硫酸2ml；
测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α–１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温度范围是50～60℃。
因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。
6.析出的;2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况
1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O
2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应:
3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应
6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
三、试剂与器材
1.糖化酶试剂； 2.微量滴定管、滴定台、试剂瓶、试管、三角
瓶、pH计、电子天平； 3.试剂
2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸缓冲液； 0.1N碘液；0.1N氢氧化钠溶液； 1N硫酸溶液； 0.1N硫代硫酸钠溶液；0.5% 淀粉指示剂。

固体曲糖化酶活力的测定

固体曲糖化酶活力的测定实验原理：1.固体曲在酿造过程中将原料淀粉转化为可发酵糖类的重要酶源。

其中其主要作用的是糖化酶，它可将淀粉水解为葡萄糖供微生物发酵，生成酒精及其它各种相应的白酒成分。

固体曲质量好，糖化活力高，原料淀粉利用率高，出酒率也高。

故糖化酶活力的高低是衡量固体曲质量的重要指标。

2.固体曲糖化酶活力定义为：1g绝干固体曲，在30℃、PH=4.6条件下，1h内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。

其测定的方法可用修正的蓝-艾农法.实验试剂：1. 斐林试剂2. 0.1%葡萄糖标准溶液（准确称取1g无水葡萄糖(预先烘干)，用水溶解，加5ml浓盐酸，用水稀释至1000ml3. 乙酸-乙酸钠缓冲溶液（PH=4.6）4. 0.01mol/L NaOH溶液称取4g NaOH ,用水溶解并稀释至1000ml5. 2%可溶性淀粉溶液准确称取2g可溶性淀粉（预先于100～105℃烘干），加少量水调匀，倾入80ml沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水稀释至100ml.实验步骤：1. 5%固体曲沁出液的提取称取5.6702g 固体曲（以绝干曲计），置于250ml 烧杯中，加入90ml 水和10ml,PH=4.6的缓冲溶液，摇匀，于30℃水浴中保温沁取1h ，每隔15min 搅拌一次，有脱脂棉过滤，滤液为5%固体曲沁出液。

2. 固体曲糖化液的制备吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，于30℃水浴中预热10min.准确加入5ml 5%固体曲沁出液，摇匀，立即计时。

于30℃水浴中准确保温1h 。

迅速加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，终止酶解反应。

冷却至室温，用水定容至刻度。

同时制作一空白液：准确吸取25ml 2%可溶性淀粉溶液，置于50ml 容量瓶中，先加入15ml 0.1mol/LNaOH 溶液，然后准确加入5ml 空白液，用水定容至刻度。

3. 测定吸取斐林甲液、乙液各5ml ，置于锥形瓶中，准确加入5ml 空白液，并用滴定管预先加入适量的0.1%葡萄糖标准溶液（使后滴定时消耗0.1%葡萄糖标液在1ml 以内，且在1min 时间以内），摇匀，于电炉上加热至沸腾，立即用0.1%葡萄糖标准溶液滴定至蓝色消失，此次滴定操作需在1min 内完成。

05-01-037DNS法测定糖化酶活力(精)精选全文

可编辑修改精选全文完整版3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定糖化酶活力一、原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1,4-葡萄糖苷键生成葡萄糖。

在煮沸条件下，葡萄糖在碱性介质中被3,5-二硝基水杨酸(DNS)氧化成葡萄糖酸，而3,5-二硝基水杨酸被还原成红褐色的3-氨基-5-硝基水杨酸。

在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出淀粉经糖化酶水解后产生的葡萄糖总量。

由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。

反应过程如下：二、仪器、试剂1、仪器1)具塞玻璃刻度比色管：25mL×19；2)烧杯：100mL×4；3)三角瓶：100mL×1；4)容量瓶：100mL×3，50mL×3；5)刻度吸管：1mL×4；2mL×3；10mL×1；6)沸水浴；7)冰浴；8)扭力天平；9) UV —2802SH 型紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司； 2、试剂1) 1mg/mL 葡萄糖标准液准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg ，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL 容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL ，混匀，4℃冰箱中保存备用。

2) 3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂将6.3g DNS 和262mL 2M NaOH 溶液，加到500mL 含有185g 酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g 结晶酚和5g 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL ，贮于棕色瓶中备用。

三、操作步骤1、葡萄糖标准曲线的绘制取7支25mL 具塞刻度比色管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL 的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS ）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

糖化酶综合实验

实验四糖化酶综合实验（一）糖化酶摇瓶实验一、实验目的掌握糖化酶摇瓶实验的基本操作。

二、实验原理摇瓶培养是实验室常用的通风培养方法，通过将装有液体培养物的三角瓶放在摇床上振荡培养，以满足生物生长、繁殖及产生许多代谢产物对氧的需求。

三、实验材料1.菌种：黑曲霉（糖化酶生产常用菌种）2.培养基：玉米粉、豆饼粉、麸皮、水3.器材：500ml三角瓶、玻片四、方法步骤1. 配制培养基玉米粉 6%，豆饼粉 2%，麸皮 1%。

补足水分，原料浸入水中。

8层纱布+牛皮纸包扎，0.1MPa下灭菌30min。

500ml三角瓶 1瓶/小组，装液量分别为100ml 2个小组、200ml 2个小组2. 接种成熟斜面，在无菌条件下，注入10ml无菌水，振荡成孢子悬浮液。

待发酵培养基灭菌后冷却到30～32℃时，分别将孢子悬浮液接入三角瓶中，接种量为2ml，做好标记3. 培养将三角瓶固定在摇床上，培养温度为31℃，转速为200rpm，培养时间为96h4. 显微镜观察菌丝形状，测量发酵液pH，测定糖化酶活力五、实验结果1.比较两种不同装液量条件下的菌体形状特征、酶活力，将结果填入分析：由于摇瓶培养的时间未达到96小时。

所以，培养瓶内壁只出现少量黑色菌落。

但相对于100ml培养基中的菌体要多一些。

说明培养基量的多少会影响菌体的生长，培养基量多则营养多更有利于菌体快速旺盛生长，增殖。

因此，观察到的菌丝相对于100ml培养基中的菌丝多而粗。

培养时间一定要遵循菌体的生长曲线时间，不能过早或过晚结束培养。

应按照各种菌体与产物的模式，适时停止培养收集产物酶。

本实验摇瓶培养才72小时，未能使菌体充分生长，即菌数少，产酶量低，或培养时间还未达到菌体大量产酶的时段，这将影响后续酶的分离提取及活力测定。

培养基应适量，在不浪费原料的同时有能使菌体快速生长，并且控制培养基的量，将减轻酶分里提取的工作量。

（二）糖化酶活力测定一、实验目的掌握糖化酶活力测定的原理与方法。

糖化酶活力测定实验报告

（4）0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。

（5）2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL沸水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。

用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。

9 糖化酶活力测定

（2） C（Na2S2O3）=0.05mol/L 硫代硫酸钠标准滴定溶液
配制：
称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3· 5H2O)13g和碳酸钠0.1g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000mL，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。
第九型淀粉酶（一类酶）：将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括以下几种：
淀粉 β-淀粉酶：淀粉-β-1，4-麦芽糖苷酶淀粉
糖化酶：淀粉-α-1，4-葡萄糖糖苷酶
麦芽糖
淀粉异淀粉酶：淀粉-1，6-葡萄糖苷酶（真菌淀粉酶）麦芽糖
葡萄糖
概述
糖化酶是由曲霉优良菌种（Aspergilusniger）经深层发酵提炼而成。糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非还原性未端水解α-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解α-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。本产品广泛用：生产白酒、黄酒、酒精、啤酒；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。
（4）分别取上述反应液与空白液各5mL，放入 250mL碘量瓶中，准确加入C(1/2 I2)=0.1mol/L标准碘液10mL，再加入0.1mol/L氢氧化钠15mL，摇匀，暗处放反应15min。（5）取出，加入c（1/2H2SO4）= 2mol/L 硫酸溶液 2mL，用0.05mol/L硫代硫酸钠滴定至淡黄色时，加入几滴0.5%淀粉指示剂，继续滴定至无色为终点。
目的
学习糖化型淀粉酶（或液体曲酶）活力的测定方法了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义

测定糖化酶活性的方法

测定糖化酶活性的方法测定糖化酶活性的方法是通过测量糖化酶在一定条件下催化底物转化为产物的速率来确定其活性的一种实验方法。

糖化酶活性可以反映糖化酶催化糖化反应的效果和能力，因此在糖化酶的研究和应用中起到重要的作用。

下面将介绍几种常用的测定糖化酶活性的方法。

1. 连续监测法（Continuous Monitoring）连续监测法是一种通过连续监测糖化酶催化反应中底物消失或产物生成的速率的方法。

常用的连续监测方法包括紫外吸收光谱法、荧光分光光度法和电化学法等。

紫外吸收光谱法是利用糖化酶催化反应底物或产物在特定波长下的吸光度改变，通过测定光强变化来间接测定糖化酶活性。

荧光分光光度法是通过测定糖化酶催化反应中产生的荧光物质的荧光强度变化来测定糖化酶活性。

电化学法是利用糖化酶催化反应中产生的电流变化来直接测定糖化酶活性。

2. 间断监测法（Discontinuous Monitoring）间断监测法是一种通过在催化反应开始与结束时测定底物或产物的浓度变化来测定糖化酶活性的方法。

常用的间断监测方法包括酶抑制法、血红蛋白法和多糖沉淀法等。

酶抑制法是通过在糖化酶催化反应中添加一种特定的抑制剂，抑制糖化酶的活性，然后在一定时间内测定抑制前后底物或产物的浓度变化，从而间接测定糖化酶活性。

血红蛋白法是通过测定糖化酶催化反应中产生的血红蛋白含量的变化来测定糖化酶活性。

糖化酶可以将底物中的血红蛋白逐步降解，通过比较血红蛋白的降解速率来测定糖化酶活性。

多糖沉淀法是通过将糖化酶催化反应中的产物与多糖结合形成沉淀，然后通过测定沉淀的质量来测定糖化酶活性。

3. 反射光度法（Reflectance Photometry）反射光度法是一种通过测量糖化酶催化反应中产生的反射率变化来测定糖化酶活性的方法。

在糖化酶催化反应中，底物被转化为产物后，产物的光学性质会发生变化，测量其反射率的变化可以确定糖化酶活性。

总之，测定糖化酶活性的方法很多，选择合适的方法应根据实验的具体目的、测量条件、仪器设备和操作方便性等因素来综合考虑。

糖化酶制剂测定方法QBT1803-93

糖化酶制剂测定方法QBT1803-93 湖北立业生物制品有限公司文件类型技术文件批准人余少文Q/LYTM02-01-16 文件编号实施日期 2006(10(1糖化酶测定方法1/3 执行部门质控部页码1. 试验方法(除酶活力项目外，其它项目按QB/T1803-93标准执行) 1.1 酶活力测定1.1.1 定义1ml液体酶(或1g固体酶粉)，于40?、PH4.6的条件下，1小时分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为一个酶活力单位，以u/ml(u/g)表示。

1.1.2 原理糖化酶有催化淀粉水解的作用，能从淀粉分子非还原性末端开始，分解α,1.4葡萄糖苷键生成葡萄糖。

葡萄糖分子中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量的次碘酸钠，酸化后析出碘，再用硫代硫酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。

1.1.3 试剂和溶液1.1.3.1 乙酸,乙酸钠缓冲溶液 (PH4.6)称取乙酸钠(CHCOONa?3HO)6.7g，溶于水中，加冰乙酸(CHCOOH)2.6ml，用水定容323至1000ml。

配好后用PH计校正。

1.1.3.2 硫代硫酸钠标准溶液C(NaSO)=0.05mol/L 223a 配制:称取硫代硫酸钠(NaSO5HO)12.4克和碳酸钠0.1克溶于煮沸后冷却的蒸溜223.2水中，定容至1000ml，储于棕色瓶中密闭保存，配制后放置一星期标定使用。

b标定:碘酸钾法称取预先在100,105?烘至恒重的分析纯碘酸钾(KIO)3.567克，溶于1000ml蒸馏水3中，即成0.1mol/L碘酸钾溶液。

然后吸取10ml于150ml三角瓶中，加入0.5克碘化钾(KI)，溶解后加入1mol/LHSO2ml，用待标定的0.05mol/L NaSO溶液来滴定，滴至淡黄色时，24 223加1%淀粉指示剂2,3滴，继续滴定至无色为终点。

c 计算:碘酸钾溶液的摩尔浓度×10NaSO 溶液的摩尔浓度= —————————————— 223消耗NaSO的ml数 2231.1.3.3 碘标准溶液碘溶液C(1/2 I)=0.1mol/L 2a 配制:称取碘化钾(KI)36克溶解在100ml蒸馏水中，再加入碘(I)12.691克溶解2稀释至1000ml贮于棕色瓶。

(三)糖化酶的分离和提取.

（三）糖化酶的分离和提取一、实验目的掌握酶工程中的一些分离和提取方法。

二、实验原理酶的分离提取首先要除去发酵液中的悬浮固形物，获得澄清的酶液；然后进行适当浓度的浓缩；其次将酶沉淀，然后收集沉淀；干燥、磨粉、获得粉状制剂。

黑曲霉糖化酶是一种胞外酶，提纯工艺比较简单。

首先采用过滤法将菌体等杂质除去，继而对滤液进行浓缩，最后将酶沉淀出来，对沉淀物进行干燥，加工成成品。

糖化酶的沉淀可采用硫酸铵盐析法，也可采用有机溶剂如乙醇沉淀。

三、实验材料1.液体培养将黑曲霉从斜面转接到液体三角瓶，28度，200rpm培养96h2.溶液及试剂盐酸、无水乙醇、硫酸铵等3.器材漏斗、离心机、抽滤泵、抽滤瓶、蒸发器、布氏漏斗、天平、干燥箱、定量滤纸四、方法步骤1.发酵液过滤取成熟的发酵液，在漏斗中用滤布过滤除去菌体。

菌体用２０ml水洗涤，抽滤。

合并清夜，量总体积2.浓缩和沉淀将总滤液放入蒸发器中浓缩到1/3～1/5体积，测定酶活。

将浓缩液均分为二，一份用盐酸调节ph至3.5。

在10～20℃条件下加入3.5倍冷冻的无水酒精，边加边搅拌，即可发现酶的沉淀现象。

沉淀物用布氏漏斗抽滤，并称酶泥的重量另一份按55g/100ml加硫酸铵，静止盐析1h。

沉淀物用布氏漏斗抽滤，称酶泥的重量3.干燥与加工将上述步骤中得到的酶泥放入干燥箱，在40℃下以热风干燥。

将干燥的制品磨粉即得成品。

将成品称量并测定酶活。

五、结果分析2.糖化酶的得率得率=（酶泥酶活*酶泥重量）/（浓缩液体积*浓缩液酶活）=（3321.82*0.9715）/（40*113.0805）= 71.35%3.分析从数据可知糖化酶得率较高，为71.35%，由此可知糖化酶得率较好，次实验方法可行，但还可以又进一步改进的余地。

糖化曲的制备及其酶活力的测定

《发酵食品工艺学》理论课教学大纲学时：36学分：2制订者：陈晓红审核者：徐幸莲一、课程性质：食品科学与工程本科专业必修课二、教学目的与要求：发酵食品工艺学是一门综合性及实践性很强的课程，内容既以微生物生理及其发酵的生化机制、微生物遗传育种、代谢调节等理论为基础，又以化工原理、发酵动力学、发酵技术及设备等工科内容为支撑，要求学生通过本课程的学习，深入探讨发酵食品的微生物作用机制、发酵与酿造的调控等理论，了解发酵食品生产的工艺原理、产品的形态、种类及其卫生与安全等方面的基本知识，掌握发酵食品生产的工艺设计和品控措施、发酵生产的一般工程计算、新产品开发思路等技能。

以适应食品研究开发、生产经营管理、质量控制等各行业对人才知识结构的需求。

三、课程内容改革内容上删减了部分总论内容，增加了固液态发酵的特点及调控、曲的微生物及生物化学、功能性发酵食品与食品添加剂、发酵食品的安全性、世界新型发酵食品等方面内容。

理论教学采用实物投影、胶片投影、多媒体课件相结合的方法，实验实践教学分为三大模块：发酵工厂参观实习（实践）、基本技能和技巧训练、综合设计模拟试验。

四、理论教学内容与学时安排第一章绪论（2学时）1、什么是发酵、酿造2、发酵食品的渊源及其文化内涵3、发酵的微生物和工程技术发展史4、发酵食品工程及产品特点5、发酵技术的发展趋势及研究热点第二章发酵与酿造食品的一般工艺和原理（3学时）第一节发酵的基本要素及调控（1学时）1、发酵基质2、环境条件3、发酵微生物第二节发酵生产一般工艺（1学时）1、发酵工艺类型2、固液态发酵的工艺过程3、固液态发酵的特点第三节发酵食品形成的一般生化历程（1学时）1、原料降解2、目的产物转化3、产物再平衡第三章发酵微生物及发酵剂（4学时）第一节通常参与发酵的微生物（第一、二节共1学时）第二节生产用菌种的选育及保藏1、菌种选育的一般程序和方法2、生产菌种的保藏原则及措施第四节发酵剂的类型及制备（第三、四节共3学时）1、生产发酵剂的概念及类型2、直投式发酵剂简介3、生产用发酵剂生产及使用原则第五节曲的微生物学及生物化学1、中国曲的特点及存在形式2、种曲和曲3、曲的生产工艺第四章发酵与酿造过程调节控制（3学时）第一节发酵过程的代谢变化1、与代谢变化有关的参数2、代谢变化和代谢曲线第二节深层液态发酵过程调控1、基质浓度的变化及控制2、温度变化及控制3、溶氧浓度及控制4、pH变化及控制5、泡沬的产生及消除6、发酵终点的判断7、无菌检查及异常发酵处理8、发酵的染菌及防止第三节固态发酵过程调控1、固态发酵工程的特点2、固态发酵工程技术沿革3、固态发酵过程调控参数4、酿造调控第五章酒精发酵与酿酒工艺学（10学时）第一节酒精发酵（一、二节共3学时）1、酒精发酵原料2、与酒精发酵有关的微生物3、酒精发酵生化机制4、酒精发酵工艺5、酒精蒸馏与精馏第二节白酒酿造1、中国名酒简介2、白酒的种类、风味物质成分和品质评价3、白酒酿造工艺4、酒类陈酿的机理及催陈方法第三节葡萄酒酿造（3学时）1、世界名酒及其历史简介2、葡萄酒的分类方法3、葡萄原料及制汁调整4、参与发酵的微生物及发酵机制5、葡萄酒发酵工艺第四节啤酒酿造（3学时）1、啤酒种类及其品质2、啤酒酿造原料4、麦汁制备5、发酵工艺6、过滤和灌装第五节黄酒酿造（1学时）1、黄酒的种类2、黄酒原料及曲3、黄酒工艺第六章醋酸发酵与酿醋工艺学（4学时）第一节醋酸发酵工艺1、参与的微生物2、醋酸发酵的工艺类型3、醋酸的提取及后加工第二节食醋生产工艺1、食醋的成分和功能性2、生产用原料及预处理3、食醋的固态发酵工艺4、食醋的液态深层发酵工艺第七章酱油及豆制品发酵工艺学（6学时）第一节酱类与酱油酿造（第一、二节共4学时）1、酱类与酱油酿造原料2、酱类与酱油酿造的微生物及菌群演替3、酿造理论4、酱油酿造工艺及新技术应用5、制酱工艺第二节腐乳制造工艺1、腐乳制造技术沿革2、腐乳类型及产品特点3、腐乳的原料及处理5、腐乳生产中常见问题及解决措施第三节豆豉及纳豆（1学时）1、豆豉的产品特性2、传统豆豉生产过程及微生物菌群演替3、纳豆的产品特性4、纳豆菌及纳豆生产第六节丹贝生产工艺（1学时）1、生产原料及预处理2、丹贝生产工艺3、丹贝发酵过程控制4、丹贝及其衍生产品的功能性第八章微生物性功能食品与食品添加剂（2学时）第一节功能性发酵制品1、微生物多糖2、活性肽3、功能性发酵乳制品和肉制品第三节微生物性食品添加剂1、黄原胶2、红曲及食用微生物色素3、乳酸菌素及生物防腐剂4、细菌纤维素5、微生物性风味物质第九章发酵食品的安全性（2学时）第一节发酵食品安全性问题起源第二节微生物代谢产物安全性1、霉菌发酵产品安全性2、细菌发酵产品安全性3、微生物发酵的旁路代谢产物安全性《发酵食品工艺学》实验教学大纲学时：18学分：1制订者：陈晓红审核者：徐幸莲一、面向专业：食品科学与工程二、实验内容和学时分配：本实验课共有9个实验，其中验证性实验3个，设计性实验2个，综合性实验4个。

实验十四糖化酶活力的测定

实验十四糖化酶活力的测定一、实验目的1、学习糖化型淀粉酶(或液体曲)酶活力的测定方法。

2、了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

二、实验原理糖化型淀粉酶可催化淀粉水解生成葡萄糖。

本实验在一定条件下用一定量的糖化型淀粉酶作用于淀粉，然后用碘量法测定所生成的葡萄糖的含量来计算淀粉酶的活力。

碘量法定糖原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄搪具有还原性，其羰基易被弱氧化剂次碘酸钠所氧化：I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2ONaIO+C6H12O6=NaI+CH2OH(CHOH)4COOH+NaI体系中加入过量的碘，氧化反应完成后用硫代替硫酸钠滴定过量的碘，即可推算出酶的活力。

I2＋2Na2S2O3 = Na2S4O6＋2NaI三、仪器、原料和试剂仪器吸管(25mL，5mL，2mL，10mL)、定碘瓶(500mL)、碱式滴定管、烧杯、恒温水浴锅、分析天平。

原料：AS3.4309黑曲霉斜面试管菌；麸皮、稻壳。

试剂1. 2％可溶性淀粉溶液：准确称取2克可溶性淀粉(预先于100~105℃烘干至恒重约2小时)，加少量蒸馏水调匀。

倾入80毫升左右的沸蒸馏水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100毫升。

2. 0.05 mol/L碘液：称取25克碘化钾溶于少量水中，加入12.7克碘，溶解后定容至1000毫升。

3. pH4.5的1mol/L醋酸缓冲液：称取8.204克无水醋酸钠，先在少量水中溶解，定容至1000毫升。

取分析纯冰醋酸5.78毫升定容至1000毫升。

以上两种溶液按醋酸和醋酸钠的体积比为25：22混合即为所要求之缓冲液。

4. 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：称取分析纯氢氧化钠4克溶解并定容至1000毫升。

5. 1 mol/L硫酸：吸取分析纯浓硫酸(比重1.84)55.5毫升，缓缓如入944.5毫升水定容至1000毫升。

6. 0.01 mol/L硫代硫酸钠：称取26克硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)和0.4克碳酸钠，用煮沸冷却的蒸馏水溶解并定容至1000毫升，配制后放置三天再标定。

糖化酶活力测定(1)

测定糖化酶的方法有次碘酸钠法、兰–爱农法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和对硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）等方法。本试验测定糖化酶活力采用次碘酸钠法。糖化酶以可溶性淀粉为底物在一定条件下进行反应,反应生成得葡萄糖用次碘酸钠法定量测定。以单位时间内分解α –１，４糖苷键生成葡萄糖所需的酶量为酶的活力单位。当酶的反应条件不相同时,酶活力单位定义也有所差别。糖化酶的最适pH范围是4～5,最适应温度范围是50～60℃。
在这一系列的反应中，1mol葡萄糖与 1mol NaIO 作用，而1molI2 产生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖与1molI2 相当。 6.析出的I2 可用标准Na2S2O3 溶液滴定之: I2 +2Na2S2O3 =Na2S4O6 +2NaI
没有葡萄糖的情况 1.I2 与 NaOH作用: I2 +2 NaOH=NaIO +NaI +H2O 2、NaIO在碱性条件下发生歧化反应: 3 NaIO=NaIO3 +2 NaI 3、总反应 3I2+6 NaOH =NaIO3+5NaI+3H2O 4.歧化产物在酸性条件下进一步作用生成I2: NaIO3 +5NaI +3H2SO4=3I2 +3Na2SO4+3H2O
次碘酸钠法

碘与NaOH作用能生成NaIO(次碘酸钠,弱氧化剂),而C6H12O6 (葡萄糖)能定量地(1:1)被 NaIO氧化.在酸性条件下,未与C6H12O6 作用的NaIO可转变成I2 析出,因此只要用Na2S2O3 标准溶液滴定析出的I2 ,便可计算出 C6H12O6 ,的含量.以上各步可用反应方程式表示如下:
实验三糖化酶活力的测定