流式细胞仪结果分析教学讲义
流式细胞分析精品PPT课件
Keylab of Medicine School of Su
Zhou University
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流式细胞仪发展的历史
• 起源: 1934年--- 细胞计数仪
• 雏形: 1949年--- Coulter 计数器
•
1959年--- B型Coulter计数器
•
1972年: BD(Becton-Dickinson)
• ④既是细胞分析技术，又是精确的分选技术。
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• 概要说来，流式细胞术主要包括了样品的液流
技术、细胞的分选和计数技术，以及数据的采 集和分析技术等。FCM目前发展的水平凝聚了 半个世纪以来人们在这方面的心血和成果。
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高流速适用于定性测量，如免疫表型。样本 流变宽，细胞间距离缩短，这样在单位时间内流 经激光照射区的细胞数量增加，可以快速获取数 据。
低流速促使样本流变窄，单个细胞得以依次 通过，这样大多数细胞可流经激光束的中心，细 胞受激光照射的能量比较均一，因而低流速适用 于检测分辨率要求高的实验，如DNA分析。
选出来，并且可将单个或指定个数的细胞分选到特定的 培养孔或板上，同时可选配多种波长和类型的激光器， 适用于更广泛更灵活的科学研究应用。
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●流式细胞仪实物
BD-Calibur
BD FACSVantage
流式细胞仪数据分析
流式细胞仪数据分析5.1 数据采集及显示光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机可以储存处理的数字信号。
流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会〞制定。
根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。
4参数〔FSC，SSC，FITC和PE〕的单细胞分析会生成8位数据。
当单个样品累计搜集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。
数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。
单参数如FSC或FITC〔FL1〕可使用直方图，横轴表示荧光通道。
纵轴表示在该通道内搜集到的细胞数量〔如图5-1〕。
处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有一样的信号密度。
通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。
图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1〔FL1〕，Y轴显示通道2〔FL2〕。
3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量〔如图5-1〕。
习题：数据采集及显示1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。
2 二维点图用于显示参数。
3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。
如：血样本是混合细胞群，假如想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。
图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图习题：设门1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。
〔对错〕5.3 细胞亚群的数据分析数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。
如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。
如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
图5-3 选定淋巴细胞亚群设门门内细胞的数据结果可在随后的图中显示。
流式细胞统计结果-概述说明以及解释
流式细胞统计结果-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述:流式细胞统计是一项用于分析和计量细胞数量、大小、形态及其功能等特征的技术。
它是通过让细胞在流动液体中单独通过一个探测器，利用流式细胞仪检测和记录细胞的各种信息，以获得准确、可靠的统计数据。
流式细胞统计的核心原理包括光学、电子学和计算机技术。
在流式细胞仪中，细胞经过染色或标记，并被单个抽取进流动液体中。
当细胞流经探测器时，不同参数的光信号会被激发和收集，包括细胞大小、形态、表面标记物的表达等信息。
这些信息将通过光电转换器将光信号转化为电信号，并由计算机进行数据的记录和分析。
流式细胞统计在医学、生物学、生命科学研究和临床诊断等领域具有广泛的应用。
它可以帮助科学家和医生研究和了解细胞的特性和功能，如细胞分布、亚群分析、细胞周期、细胞活力等。
同时，流式细胞统计也可以用于肿瘤学研究、免疫学研究和药物筛选等领域，能够快速、准确地评估细胞的状态和功能。
尽管流式细胞统计技术在细胞分析中具有明显的优势，例如高通量、高灵敏度和多参数分析等，但也存在一些局限性。
比如，对于小细胞的检测和准确度需要进一步提高，数据的解释和分析也需要针对具体问题进行合理的统计模型和算法优化。
总之，流式细胞统计是一种重要的细胞分析技术，能够提供详尽的细胞信息和数据。
随着技术的不断发展和改进，未来流式细胞统计有望在更多领域展示其潜力，并为科研和诊断提供更全面、准确的细胞分析结果。
1.2 文章结构文章结构部分内容如下：本文主要分为引言、正文和结论三个部分。
接下来将对这三个部分进行详细介绍。
引言部分概述了本文的主题，即流式细胞统计结果。
通过对流式细胞统计的定义和原理的介绍，读者可以对流式细胞统计有一个初步的了解。
接着，文章结构部分将对本文的整体结构进行说明。
正文部分包括了流式细胞统计的定义和原理以及其应用领域的介绍。
在第2.1小节中，将详细解释流式细胞统计的定义和原理，包括流式细胞术语的解释和流式细胞实验的基本步骤。
流式细胞仪分析技术应用ppt课件
荧光抗体的选择
种属来源：人 •正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38CD45RA-CD90+CD49f+Rholow •白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+ 种属来源：鼠 •F正lk2常- 或造者血干Li细n-S胞ca分-1选+c-标Ki记t+C: LDi1n5-S0c+aC-D1+4c8--Kit+CD34•SMcaL-1L--cA-KFi9t+ACMDL1白6/3血2+病CD干3细4+胞或的c-分K选it+G标r-记1-: Lin•BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记: LinSca-1+c-Kit+
胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。 与分选速度成反比。
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第二节 数据的显示与分析
• 参数：FS,SS,FL • 数据显示方式 （单参数直方图 、双
参数散点图 、二维等高图 、假三维 等高图 、三参数散点图 ） • 设门分析技术
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一、 参数
FS：反映颗粒的大小 SS：反映颗粒的内部结构复杂程度 FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
偏转落入收集器
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（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
液中细胞的含量成正比。
• 分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞
的百分率。
• 分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过
测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
流式细胞仪分析技术及应用PPT课件
（四）石蜡包埋组织单细胞悬液制备 该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应
用范围，有利于进行临床回顾性研究和利 用。 常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂 脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。 对石蜡切片的要求较严格。
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（五）活检标本单细胞悬液制备 活检标本及各种内镜取材标本也克制备成
能对于处在快速直线流动状态 中的细胞或生物颗粒同时进行 多参数、快速定量分析和分选
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一、流式细胞仪分析的工作原理
荧光显微镜技术
激发光源改为激光
单克隆抗体与 荧光染料技术
计算机技术 处理光信号
提高检测灵敏度 和特异性
提高检测速度和 统计分析精确性
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（一）流式细胞仪基本结构
液流系统
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包括流动室（flow chamber）和液流驱动系统 作用：依次传送待测样本中的细胞到激光照射区 理想状态：细胞逐个传送到激光束的中心，而且
侧向散射光检测器
在激光束的垂直方 向，又称90°散射
SSC信号的强弱与 细胞内颗粒结构的 质量成正比，用于 检测细胞内部结构 属性
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前向散射光示意图
细胞大小
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结构复杂程度
侧向散射光示意图
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当荧光抗体或其他染料染色的颗粒通过 激光束时，染料吸收光子跃迁到激发态，返 回基态时，染料释放出能量，大部分以光的 形式释放。
分选的方式有捕获式分选和电荷式分选，目前应 用最多的是电荷式分选。
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电荷式分选1
当单细胞悬液形成液柱通过 流动室时，液柱被分割成一 连串均匀的液滴。
根据设定的被分选细胞的某 个参数由逻辑电路判断是否 被分选。
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电荷式分选2
充电电路对选定细胞液滴充 电，使其带正电荷或负电荷， 未被设定分选参数的细胞液 滴则不带电荷。
流式细胞仪结果分析78页PPT
谢谢！
36、自己的鞋子，自己知道紧在哪里。——西班牙
37、我们唯一不会改正的缺点是软弱。——拉罗什福科
流式细胞仪结果分析
36、如果我们国家的法律中只有某种 神灵， 而不是 殚精竭 虑将神 灵揉进 宪法， 总体上 来说， 法律就 会更好 。—— 马克·吐 温 37、纲纪废弃之日，便是暴政兴起之 时。— —威·皮 物特
38、若是没有公众舆论的支持，法律 是丝毫 没有力 量的。 ——菲 力普斯 39、一个判例造出另一个判例，它们 迅速累 聚，进 而变成 法律。 ——朱 尼厄斯
xiexie! 38、我这个人走得很慢，但是我从不后退。——亚伯拉罕·林肯
39、勿问成功的秘诀为何，且尽全力做你应该做的事吧。——美华纳
ห้องสมุดไป่ตู้
40、学而不思则罔，思而不学则殆。——孔子
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2020/4/18
荧光补偿
2020/4/18
四、细胞分选原理
通过流式细胞仪进行细胞分选 主要是在对具有某种特征的细胞需 进一步培养和研究时进行的。
2020/4/18
（一）分选基本原理
细胞悬液形成液流柱 压电晶体 产生机械振动
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴 不充电
弃去
含细胞的液滴 充电
波长 • 光束成形器：两十字交叉放置的透镜 • 透镜组：形成平行光，除去室内光 • 滤片：长通、短通、带通 • 光电倍增管：FS, SS（散射光），
FL1, FL2, FL3, FL4（荧光）
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光学系统示意图
Flow Tip
SS and FL Detector
FS Detector
流式细胞仪分析技术及应用
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第一节 概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术
第三节 流式细胞仪免疫分析的技术要求 一、免疫检测样品制备 二、免疫分析中常用的荧光染料与标记染色 三、免疫胶乳颗粒的应用 四、流式细胞免疫学技术的质量控制
细胞组成
细胞功能
大小 粒度 DNA, RNA含量 蛋白质含量 钙离子, PH值, 膜电位
细胞表面/胞浆/核--特异性抗原 细胞活性 胞内细胞因子 激素结合位点 酶活性
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一、工作原理
➢采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发 效率； ➢利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检 测的灵敏度和特异性； ➢用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数 信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确 性。
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前向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞 时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结 构属性。
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侧向散射光示意图
Laser
FALS Sensor
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90LS Sensor
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第一节 概述
流式细胞仪是测量染色细胞标记物荧光 强度的细胞分析仪，是在单个细胞分析 和分选基础上发展起来的对细胞的物理 或化学性质（如大小、内部结构、DNA 、RNA、蛋白质、抗原等）进行快速测 量并可分类收集的高技术。
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流式细胞仪常检测的细胞特性
偏转落入收集器
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（二）分选的技术要求
• 分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬
计算机系统 分析结果
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流式细胞仪与显微镜的区别
区别 光源 对Βιβλιοθήκη 承载工具 检测信号 放大方式 统计 结果
流式细胞仪 激光
细胞、生物粒子 鞘液及流动室 光学信号 PMT、放大电路 计算机，>5000
多参数，综合分析
显微镜 自然光、灯光 细胞、组织等
载玻片 形态及染色 目镜×物镜、光学放大 人工，200 简单，单参数
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第四节 流式细胞术在免疫学检查中的应用 一、淋巴细胞及其亚群的分析 二、淋巴细胞功能分析 三、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用
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思考题 小结
流式细胞术(flow cytometry, FCM)是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对 单个细胞理化特性进行多参数定量分析和分 选的新技术。
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1.流式细胞仪的基本结构：
（1） 液流系统 （2） 光学系统 （3） 数据处理系统
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（1）液流系统
• 由样本和鞘液组成
• 待测细胞 单个细胞的悬液 抗对其染色 受清洁气体压力 室形成样本流
荧光染料标记的单 从样品管进入流动
• 鞘液：辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是 包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心 位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。
• 每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过 波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧 光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
• 选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的 多个不同特征。
• 线性放大器和对数放大器
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荧光染料的特性 •激发波长(EXCITING) •发射波长(EMISSION)
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二、散射光的测定
细胞在液柱中与激光束相交时 向周围360°立体角方向散射的光线 信号，它的强弱与细胞的大小、形 状、胞内颗粒折射等有关，主要分
为前向散射光和侧向散射光。
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前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光 以相对轴较小角度(0.5°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞 等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
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液流系统示意图
鞘液
喷嘴
Fluorescence signals
Focused laser beam
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FCM的液流系统（如 何形成单个细胞流）
样本管
鞘液管
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（2）光学系统
• 激光光源：气冷式氩离子激光器 • 分色反光镜：反射长/短波长，通过短/长
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Laser
（3）数据处理系统
主要由计算机及其软件组成
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基本工作原理
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已标记的单细 硅化管 胞悬液和鞘液
基本过程
流动室 形成稳态 喷嘴 水平激光与之 荧光染料被
单细胞液柱
垂直相交 激发发光
荧光检测系统和
收集光信号 光电倍增管
放大 脉冲信号
散射光感受系统
测得的FS与SS信 号通过计算机处理， 可得到FS-SS图，由 此可仅用散射光信号 对未染色的活细胞进 行分析或分选。
此为血细胞分类的 基本原理，但不能分 析表面分子。
单核细胞
中性粒细胞
淋巴细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
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三、荧光测量
• 荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激 发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。