-生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
生物化学实验报告(实验五)
天津科技大学生物化学实验报告专业：班级：姓名学号组别第组实验项目同组人完成时间年月日【实验名称】《垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质》【实验目的】学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋白质的分子量的原理和基本操作技术。
【实验原理】蛋白质的性质：三种物理效应：、、。
1、2、3、成绩：教师签字：批阅日期：聚丙烯酰胺凝胶电泳的四个不连续：、、、。
1、2、3、4、蛋白质的分子量与电泳迁移率之间的关系是：Mr=K(10-b·m)logMr=LogK—b·Rm式中Mr——蛋白质的分子量；logK——截距；b——斜率；Rm——相对迁移率。
实验证明，蛋白质分子量在15,000～200,000的范围内，电泳迁移率与分子量的对数之间呈线性关系。
蛋白质的相对迁移率Rm＝蛋白质样品的迁移距离／染料(溴酚蓝)迁移距离。
这样，在同一电场中进行电泳，把标准蛋白质的相对迁移率与相应的蛋白质分子量对数作图，由未知蛋白的相对迁移率可从标准曲线上求出它的分子量。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)法测定蛋白质的分子量具有简便、快速、重复性好的优点，是目前一般实验室常用的测定蛋白质分子量的方法。
【材料与设备】1.仪器设备DYCZ-24D垂直板电泳槽(北京市六一仪器厂),电泳仪,微量移液器2.材料烧杯(250mL、500mL)、量筒(500mL、250mL)、培养皿3.主要试剂（1）标准蛋白混合液：内含磷酸化酶(Mw94,000)，牛血清蛋白(Mw67,000)，肌动蛋白(Mw43,000)，磷酸酐酶(Mw30,000)和溶菌酶(Mw14,000)（2）30％凝胶贮备液：Acr30g，Bis0.8g,加蒸馏水至100mL（3）分离胶缓冲液(1.5mol／L):Tris18.15g,加水溶解,6mol/L HCl调pH8.9,定容100mL（4）浓缩胶缓冲液(0.5mol／L):Tris6g,加水溶解，6mol/L HCl调pH6.8，并定容到100mL（5）5×电极缓冲液(pH8.3)：SDS lg，Tris6g，Gly28.8g，加水溶解并定容到1000mL。
血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳
在血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，如果出现异常的蛋白条带，如过亮、过暗或异常迁移率，可 能提示某些疾病或生理变化。这些异常条带可能与炎症、感染、肿瘤或代谢紊乱等病理状态相关，需 要进一步的临床和实验室检查以明确诊断。
结果分析
总结词
结合临床信息和实验室数据，对血清蛋白聚丙烯酰胺 凝胶电泳结果进行分析。
应用
聚丙烯酰胺凝胶电泳广泛应用于蛋白质组学、生物医药等领域，用于分 离、鉴定和纯化蛋白质，了解蛋白质的组成和功能。
02 实验原理
CHAPTER
血清蛋白的分离原理
分子筛效应
聚丙烯酰胺凝胶作为分子筛，能够根据蛋白质分子量大小进行分离，分子量小 的蛋白质容易进入凝胶孔洞，移动距离短；分子量大的蛋白质不容易进入凝胶 孔洞，移动距离长。
实验结果可靠性验证
对比已知标准品
通过与已知标准品进行比较，可以验证实验结果的准确性。 如果实验结果与标准品一致，则说一样品进行检测，并将结果 进行比较。如果不同方法得到的结果一致，则说明实验结 果是可靠的。
统计学分析
通过统计学分析，可以评估实验结果的可靠性和准确性。 例如，可以采用方差分析、回归分析和相关系数等方法对 实验结果进行统计分析。
总结词
通过观察分离出的血清蛋白条带，可以了解蛋白质的种类和数量。
详细描述
在聚丙烯酰胺凝胶电泳结果中，可以清晰地看到不同分子量和电荷的蛋白质被分离成不同的条带。根据条带的亮 度、清晰度和数量，可以初步判断血清中蛋白质的种类和数量。
异常蛋白条带的解读
总结词
异常蛋白条带的出现可能提示某些疾病或生理变化。
血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳
目录
CONTENTS
• 介绍 • 实验原理 • 实验步骤 • 结果解读 • 实验注意事项
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白
03
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳具有高分辨率和分离范围广的优点，广泛应用于蛋 白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
03
实验材料与设备
实验材料
01
02
03
04
05
血清样品
丙烯酰胺和N,N'- 分离胶和浓缩胶 甲…
电泳缓冲液
Байду номын сангаас
染色液和脱色液
用于电泳分离的血清样品 ，应保证新鲜、无菌，且 无杂质。
用于制备凝胶的原材料， 应保证纯度高、无杂质。
电泳仪
用于电泳分离的设备，应保证 性能稳定、精度高。
电源
用于提供电泳仪所需的电流和 电压，应保证安全、稳定。
电子天平
用于称量实验材料，应保证精 度高、稳定性好。
04
实验步骤与操作
实验前的准备
准备试剂
准备凝胶板
确保所有试剂都已正确配制，包括丙烯酰 胺、N,N'-甲叉双丙烯酰胺、TEMED、 Tris-HCl、甘氨酸、过硫酸铵等。
用于电泳分离的不同浓度 的凝胶，应保证性能稳定 、无杂质。
用于维持电泳过程中的pH 值和离子强度，应保证质 量稳定、无杂质。
用于染色和脱色分离后的 凝胶，应保证无毒、无害 、无污染。
实验设备
垂直电泳槽
用于放置凝胶和电泳缓冲液的 容器，应保证密封性好、不易 变形。
离心机
用于制备血清样品，应保证性 能稳定、易于操作。
结合其他技术
结合质谱分析、免疫印迹等其他技术，对分离出的蛋白质进行定性和 定量分析，以更深入地了解蛋白质的性质和功能。
应用于临床研究
进一步研究血清中特定蛋白质与疾病之间的关系，探索其在临床诊断 和疾病监测中的应用价值。
血清蛋白的电泳的实验报告
血清蛋白的电泳的实验报告
血清蛋白的电泳实验报告
血清蛋白是人体血液中最主要的蛋白质成分之一，它们在维持血液渗透压、运
输营养物质和调节免疫功能等方面发挥着重要作用。
电泳是一种常用的实验技术，可以通过电场作用下将蛋白质分离成不同的带状，从而对血清蛋白进行分
析和鉴定。
在本次实验中，我们使用了聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对血清蛋白进行了分离。
首先，我们将血清样品加入到电泳凝胶槽中，然后施加电场使蛋白质在凝胶中
移动。
由于不同蛋白质的大小、电荷和形状不同，它们在电场作用下会以不同
的速度移动，最终形成不同的带状。
通过观察电泳结果，我们可以看到血清蛋白在凝胶上形成了多个明显的带状。
根据已知的标准蛋白质的电泳迁移率，我们可以对这些带状进行鉴定和定量分析。
通过比较实验样品的电泳图谱和标准样品的电泳图谱，我们可以确定血清
中不同蛋白质的含量和种类。
在实验中，我们发现血清蛋白主要可以分为白蛋白、球蛋白、转铁蛋白等多个
带状，它们在电泳图谱上呈现出清晰的分离和特征性的迁移率。
这些结果为我
们进一步了解血清蛋白的组成和功能提供了重要的参考。
总的来说，血清蛋白的电泳实验为我们提供了一种快速、准确地分析血清蛋白
的方法，对于临床诊断和疾病治疗具有重要意义。
通过对血清蛋白的电泳分析，我们可以更好地了解人体内蛋白质的组成和功能，为疾病的诊断和治疗提供科
学依据。
希望通过我们的努力，可以为医学科研和临床实践带来更多的启发和
突破。
血清蛋白的分离——聚丙烯酰胺凝胶电泳法
血清蛋白的分离——聚丙烯酰胺凝胶电泳法【摘要】目的 1.、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
2、掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。
3、比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。
方法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法对血清蛋白进行电泳分离，最后与醋酸纤维薄膜电泳的条带进行比较。
结果聚丙稀酰胺凝胶电泳法电泳鸡血清蛋白，在凝胶染色后出现了5条染色带。
结论聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白的效果要比醋酸纤维薄膜电泳好得多。
【关键词】聚丙烯酰胺凝胶电泳法、电泳、血清蛋白近年来我国家禽发生禽流感病状很严重，为了更好的预防和治疗禽流感，我们决定先采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法初步的鉴定鸡血清中含有几种蛋白质，因为大多数病毒都是依赖蛋白质为原料进行复制增多的。
然后再用考马斯亮蓝R250对电泳出来的凝胶进行染色、鉴定。
同时，也为了比较聚丙酰胺凝胶电泳法与醋酸纤维素薄膜电泳法分离血清蛋白的效果。
对象与方法一、对象1、检测标本：选取一只健康的鸡，杀鸡取血置于一个大烧杯内，用分离法分离血清。
2鸡血清的提取：采用高速离心机对原血进行高速离心，上清液就是鸡血清。
二、方法1、原理（1）盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。
盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。
因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。
上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。
上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。
实验十一 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质
实验十一聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、目的1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳技术；2、掌握同工酶遗传标记的分析方法。
二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis)，是以聚丙烯酰胺凝胶为作为支持介质的一种常见电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺聚合而成，聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种：化学聚合法和光聚合法。
化学聚合法以过硫酸铵（AP）为催化剂，以四甲基乙二胺（TEMED）为加速器。
在聚合过程中，TEMED催化过硫酸铵产生自由基，后者引发丙烯酰胺单体聚合，同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联，从而形成三维网状结构。
由于同工酶的酶蛋白分子的大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。
在适宜酶催化反映的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。
同工酶的鉴定过程通常如下：1、从植物样品中提取粗酶液；2、聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开；用专一作用底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶谱。
同工酶技术是通过电泳和组织化学方法进行特异性染色而把酶蛋白分子分离，并将其位置和活性直接在染色区带以酶谱的形式标记出来。
分离同工酶的方法有：电泳法、层析法、酶学法和免疫学其中以电泳法最为普遍，电泳法中又以垂直平板聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨率为最好。
聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种物理效应：1、样品的浓缩效应；2、凝胶的分子筛效应；3、一般的电泳分离的电荷效应。
三、仪器、设备、药品及材料仪器、设备：电泳仪、电泳槽、离心机、移液管、装凝胶用的玻璃管（内径为5mm、长度为90mm）。
垂直板电泳装置图药品：三羟甲基氨基甲烷（Tris）、四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺（Acr）、价差双丙烯酰胺（Bir）、甘氨酸、过硫酸铵（AP）、蔗糖、溴酚蓝、联苯胺、过氧化氢。
生物化学实验五《聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白》课件
➢ 分辨率高 ➢ 用于复杂和特殊样品的分离
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不连续电泳的四种不连续体系
➢凝胶的不连续 ➢缓冲液成份的不连续 ➢缓冲液pH值的不连续 ➢电压梯度的不连续
不连续电泳的三种物理效应
➢ 样品的浓缩效应 ➢ 凝胶的分子筛效应 ➢ 电荷效应
电泳的过程三种效应同时存在，对蛋白样品起协同作用，使样品各组 分按照带电量、分子质量及形状按一定的顺序分离。
7
三、实验步骤
封槽
清洁、干燥的小玻管一端，用Parafilm贴封后垂直放在管架上
8
制胶和灌胶
分离胶：A:C:D:E＝1:2:3:2（V/V） 浓缩胶：B:C:D:E＝2:1:5:2（V/V）
➢ A: pH8.9 Tris/Hcl缓冲液
➢ B: pH6.7 Tris/Hcl缓冲液
➢ C: 30% Acr-Bis贮存液
电泳
➢ 连接电极，上负下正； ➢ 浓缩胶：3mA／管，分离胶：4mA／管； ➢ 待示踪染料接近凝胶管底部约0.5cm处，切断电源。
剥胶
取下凝胶管，用注射器吸取一定量的蒸馏水，将针头插入胶柱-与管内壁之间 ，边注水边旋转玻管，直至胶柱与管壁分离，然后用洗耳球轻轻在玻管的一 端加压，使凝胶柱从玻管缓慢滑出，将凝胶柱置于干净的试管内，用蒸馏水 冲洗几次。
实验五 聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳分离血清蛋白 动物医学院动物生化教研室
1
一、实验目的
① 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的原理； ② 学习聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； ③ 了解血清蛋白的主要成份。
2
二、实验原理
➢ 不连续系统聚丙烯酰胺凝胶电泳中，蛋白样品通过浓缩胶的浓 缩按分子大小排列成层，然后进入分离胶，随着电泳的不断进行 ，不同大小、电荷的蛋白质分子逐渐被分开。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白[实验目的](1)学习聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳原理。
(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
(3)比较醋酸纤维薄膜电泳与聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离血清蛋白的操作效果。
[实验原理]带电质点在电场作用下，会向两极移动；带正电荷的移向负极，带负电荷的移向正极，这种现象称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(简称AP)或核黄素的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
[实验试剂]1、待测样品：新鲜血清2、制备分离胶、浓缩胶有关试剂：(1)凝胶缓冲液：称取1 mol/L HCl 48ml,Tris(三羟基氨基甲烷)36.6g,TEMED 0.23mL,加重蒸馏水至80mL 使其溶解，调pH8.9，然后加重蒸馏水定容至100mL ，至棕色瓶，冰箱储藏。
(2)分离胶贮液，一般有两种配法：ⅰ28％Acr-0.735％Bis贮液：丙烯酰胺28.0克，甲叉双丙烯酰胺0.735克,加重蒸馏水使其溶解然后定容至100mL.ⅱ30％Acr-0.8％Bis贮液:Acr30.0克,Bis0.8克,加重蒸馏水使其溶解定容至100mL.以上两种溶液需用棕色试剂瓶盛放,4℃储存,一般可放置一个月左右.(3)分析纯过硫酸铵(AP)(AR)0.14g加重蒸水100mL,棕色瓶,4℃储存仅能用一周,最好当天配置.上述三种试剂用于制备分离胶.(4)浓缩胶缓冲液:称取1mol/LHCL48mL,Tris5.98g,TEMED 0.46mL,加重蒸水至80mL,调pH6.7,用重蒸水定容至100mL,棕色瓶4℃储存.(5)浓缩胶贮液:称取Acr10g，Bis2.5g，加重蒸水溶解定容100mL，过滤后至棕色瓶4℃贮存。
生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。
本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。
【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。
这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理如下：
1. 加SDS：将蛋白质样品加入含有十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液中，SDS会与蛋白质发生作用，使蛋白质分子均匀地被带负电荷，同时SDS也会破坏蛋白质分子的三维结构，使其变成线性结构。
2. 空间分离：将样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶由于聚合物的交联作用而形成连续的三维通道结构，蛋白质分子在通道中发生空间分离。
3. 电泳：在聚丙烯酰胺凝胶中通入电流，蛋白质分子会受到电场力的作用，向电极移动，越小的蛋白质分子移动的越远，形成一条由大分子向小分子递减的带状图案。
4. 可视化：将凝胶染色或与荧光染料结合，可以在凝胶上清晰地看到分离出的蛋白带，根据分离的结果可以分析蛋白质的分子量和相对含量。
06 生物化学实验--SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量
SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质分子量【目的】1 . 掌握 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的操作方法。
2 . 熟悉 SDS-PAGE 测定蛋白质分子量的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动, 称为电泳。
不同蛋白质分子具有不同的大小、形状, 在一定的 pH 环境中带有不同的电荷量, 因而在一定的电场中所受的电场引力及介质对其的阻力不同, 二者的作用结果使不同蛋白质分子在介质中以不同的速率移动, 经过一定的时间后得以分离, 这就是电泳分离蛋白质及核酸生物大分子的基本原理。
聚丙烯酰胺凝胶电泳就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时, 蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小, 形状和所带的电荷量有关, 为了使其只与蛋白质分子的大小有关, 从而利用蛋白质在介质中的迁移率来测定蛋白质的分子量, 就需要消除蛋白质分子的形状和所带电荷量的不同对迁移率的影响或减小到可忽略不计的程度。
SDS 是十二烷基硫酸钠（ sAium dAecyl sulfate ）的简称, 它是一种阴离子表面活性剂, 加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键和疏水键打开, 并结合到蛋白质分子上（在一定条件下, 大多数蛋白质与 SDS 的结合比为 1.4 g SDS/ 1 g 蛋白质）, 使各种蛋白质 -SDS 复合物都带上相同密度的负电荷, 其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量, 从而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别, 使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素, 于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线, 可求得未知物的分子量。
SDS 与蛋白质结合后引起蛋白质构象的改变。
SDS- 蛋白质复合物的流体力学和光学性质表明, 它们在水溶液中的形状, 近似于雪茄烟形状的长椭园棒, 不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样（约为 18? , 即 1.8 nm ）, 而长轴则随蛋白质分子量成正比的变化。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离血清蛋白质
目的 1 强化学生对电泳基本原理的理 解与记忆。 2 熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 蛋白质的基本原理、学会操作。
原理
带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电 泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向 正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷 的多少取决于分子性质及其所在介质的pH 及其组成。混合物中各组分在电场中的泳 动速度，首先和本身所带的净电荷多少、 分子量大小和形状有关。一般来说，带电 越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的， 则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在 一定时间内，由于各组分移动距离的不同， 而达到分离鉴定各组分的目的。
实验结果分析
胶槽1
94 000 62 000 43 000
2
3
31 000 20 100 14 400
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱
注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
思考题
该实验中如何去除蛋白质间电荷效应的？ 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用?
注意事项
1．丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤，呼吸道 等吸收，故操作时一定要注意防护。 2．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不 清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 3．对多种蛋白而言，电流大则电泳条带清晰， 但电流过大，玻璃板会因受热而破裂。 4.过硫酸铵溶液最好为当天配置，冰箱里储存 也不能超过一周。
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人 工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺 (Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)在催化剂作用下，聚合交联 而成的含有酰胺基侧链的脂肪族 大分子化合物。
实验三__聚丙烯酰胺凝胶电泳
四、操作步骤：
1.凝胶柱的配制： 配胶-立柱-灌胶-水封-静置-去水层 （1）配胶——配制分离胶溶液。
分离胶缓冲液 单体交联剂 蒸馏水 催化剂 加速剂 2.0mL 4.34 mL 13.48 mL 0.2 mL 0.05 mL
最后加
总体积20.07 mL，丙烯酰胺浓度6.5%。
（2）立柱：取8×0.5 cm的玻璃管，一端用封 口膜封好，垂直插入橡皮垫子中，并将之稳 定于架子上。 （3）灌胶：用胶头滴管吸取配置好的分离胶 溶液，插入玻璃管底部，沿管壁缓缓注入胶 液至离上端约1cm处。如有气泡，可轻轻叩打 玻管，排除气泡。管的下方不要漏胶。
2．样品液的制备：取血清 0.05ml，加入样品 稀释液0.95 mL，内含溴酚蓝作为示踪染料， 混匀备用。
3．电泳 装柱-加液-加样-封液-电泳 （1）装柱：选择合适的凝胶管，去掉下端的 封口膜，垂直插入上层电泳槽的橡胶塞孔中， 留有适当的高度（要使凝胶表面露出橡皮 塞），若有没插满的孔要用实心的橡皮塞堵 塞。每个孔都要塞紧，防止漏液。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：以此凝胶作为支持物 的电泳技术，称为聚丙烯酰胺凝胶电泳，简 称PAGE。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。 具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。血 清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成 12～25个组分。因此适用于不同相对分子质 量物质的分离，且分离效果好。 根据有无浓缩效应可分为：连续系统与 不连续系统，其中不连续系统因具有浓缩效 应，分离条带清晰度及分辨率较佳应用更为 广泛，本次试验应用的为不连续系统。
分 离 胶
分 离 胶
（2）电荷效应：在均一电势梯度和pH的分离胶中， 由于各种蛋白质分子的等电点不同，在同一pH的分 离胶中所带有效电荷不同，因而迁移率也就不同。 根据电泳的基本原理，带电荷越多，运动速率就越 快，经过一段时间的电泳分离，各种蛋白质就按泳 动速率快慢顺序排列成一个一个圆盘状的蛋白质区 带。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质Separating Serum Protein by PAGE一、目的1.把握聚丙烯酰胺凝胶电泳的大体原理2.学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的操作技术二、原理聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis,简称PAGE）,是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采纳电泳基质的不持续体系（即凝胶层的不持续体系、缓冲液离子成份的不持续性、pH的不持续性及电位梯度的不持续性），使样品在不持续的两相间积聚浓缩成薄的起始区带（厚度1—2mm），然后再进行电泳分离。
聚丙烯酰凝胶电泳的进程中有三种物理效应：（1）样品的浓缩效应，（2）凝胶的分子筛效应，（3）一样电泳的电荷效应。
使样品分离成效好，分辨率高。
例如人血清用醋酸纤维素薄膜电泳（）能够分成5—7个成份，而用聚丙烯酰胺凝胶电泳那么可分成20—30条带清楚的成份。
下面就聚丙烯酰胺凝胶电泳说明三种物理效应的原理。
1、样品的浓缩效应：由于电泳基质的4个不持续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩然后再被分离。
（1）凝胶层的不持续性：两层不同的凝胶，其作用如下：浓缩胶：为大孔胶，样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序慢慢在其与分离胶的界面积聚成薄层。
分离胶：为小孔胶，样品在其中进行电泳和分子筛分离。
（2）缓冲液离子成份和电位梯度的不持续性：在浓缩胶当选择，电泳槽缓冲液pH为，HCl几乎全数释放出Cl-,甘氨酸（等电点在；羧基解离 pKa1=, 氨基—NH3+解离pKa2=）在此条件下有极少部份的分子（1—%）解离成为甘氨酸负离子NH2CH2COO-在下，大部份蛋白质都以负离子形式存在（大多数蛋白质等电点接近于）。
这三种离子都带有相同电荷，当电泳系统通过必然电流后三种离子同时向正极移动，而且它们的有效泳动率按以下顺序排列。
（有效泳动率=泳动率m·解离度d）m Cl d Cl>m蛋d蛋>m甘d甘依照有效率泳动率的大小，最快的称为快离子，最慢的称为慢离子，电泳刚开始时，两种凝胶都含有快离子，只有电泳槽中电泳含慢离子，电泳开始后，由于快离子的泳动率最大，就会专门快超过蛋白质，因此，在快离子的后面形成一离子浓度低的区域即低电导区。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质一、实验目的：1、学习聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
2、掌握圆盘电泳的操作方法。
二、实验原理：1.聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺( Acr )单体和少量交联剂N,N-亚甲基双丙烯酰胺( Bis )在催化剂过硫酸铵( Ap )和加速剂四甲基乙二胺( TEMED )的作用下发生聚合反应而制得的。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
即凝胶的浓度决定凝胶筛孔的平均直径，凝胶的交联度决定凝胶筛孔的最大直径。
2.采用不连续系统（即缓冲液成分、pH及凝胶孔径不连续）聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过浓缩效应、分子筛效应、电荷效应，将血清中各蛋白质成份依其分子大小、电荷多少不同而进行高效分离。
3.连续系统缓冲液的pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场力的作用下，主要靠电荷及分子筛效应得到分离4.不连续系统①浓缩效应：a.凝胶层孔径不连续:浓缩胶大孔径，具有浓缩效应；分离胶小孔径，具有分子筛效应。
b.pH值不连续:电泳缓冲液pH=8.3;浓缩胶pH=6.7;分离胶pH=8.9。
c.缓冲液离子不连续:电泳液中Gly-(慢离子);凝胶中CI+(快离子);Pr介于二者之间。
d.电位梯度不连续：电泳时，氯离子跑得最快，留下一段低电导区，产生高电位梯度(电位与电导率成反比),使甘氨酸离子追赶氯离子，蛋白质夹在中间而被压缩。
蛋白质是大分子物质，此时解离度又不大，自然状态下电荷密度不高，但在等速电泳界面，为满足各横断面电流相等的要求，唯一可能就是分子相互靠近，以达到与Cl-离子、Gly-离子相同的电荷密度，于是发生浓缩效应。
②电荷效应：v=Eq/6πrη③分子筛效应：样品组分根据其分子量大小不同而分离，分子量小的泳动速度大。
三、实验步骤：1.准备电泳管每人取电泳管1支，标好号码，玻棒堵住底部，加1—2滴40％蔗糖于底端。
2.分离胶制备吸取1号2ml、2号4ml、水2ml，在桑玻氏管中混匀，用真空泵抽气至无气泡为止，抽气后加3号8mL，混匀备用。
电泳技术之聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清蛋白质一、电泳的概念带有电荷的离子在电场中称动的现象称为电泳。
电泳技术的发展：1937年Tiselius利用U形玻管进行血清蛋白电泳后用光学系统使各种蛋自所形成界面折光率差别成为曲线图象，发现血清蛋白可分为4~5高峰，即白蛋白、α(α1和α2)、β和γ球蛋白，使电泳技术开始应用于临床研究。
但这类电泳仪结构较复杂，价值昂贵不易推广。
1940年代，Kӧnig和Wieland等发明用滤纸作为支持物，使电泳技术大为简化，而且可使许多组份相互分离为区带，所以这类电泳被称为区带电泳，而Tiselius 的电泳装置则称界面自由电泳，纸上电泳发明后在临床上到广泛的应用。
1950年发展为琼脂凝胶电泳。
1953年又发展为电泳后用免疫沉淀线检测的免疫电泳。
1955年Smithies以淀粉胶为支持物进行血清蛋白电泳分离，结果可分为十余条区带，这是由于淀粉胶尚具有分子筛作用使蛋白更有效地分离，淀粉胶的制备不易标准化是该法的缺点。
1959年Davis发明聚丙烯酰胺凝胶电泳，聚丙烯酰胺具有耐热、透明、化学性质稳定等优点，并可以不同浓度的丙烯酰胺单体聚合为各种不同大小孔径的凝胶，即可制备各种不同孔径的分子筛，对于蛋白质和核酸等大分子物质的分离提供了有用的技术。
六十年代以来又出现了等电聚焦电泳和等速电泳等新电泳技术。
二、电泳的基本原理设一带电粒子在电场中所受的力为F，F的大小决定于粒子所带电荷Q的电场的强度X，即：F= QX又按Stoke氏定律，一球形的粒子运动时所受到的阻力F’与粒子运动的速度v、粒子的半径r、介质的粘度η的关系为：F’= 6πrηV当F＝F’时，即达到动态平衡时：QX= 6πrηV移项得：V／X= Q／6πrηV/X表示单位电场强度时粒子运动的速度，称为迁移率(mobility)，也称为电泳速度，以ｕ表示。
由公式可见，粒子的迁移率在一定条件下决定于粒子本身的性质，包括其所带电荷及其大小和形态。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质技术实验分析
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质技术实验分析聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）一、目的要求（1）学习电泳原理和技术（2）学习和掌握SDS－聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质技术二、实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺（简称Acr）单体和少量交联剂甲叉双丙烯酰胺（简称Bis）通过化学催化剂（过硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED）作为加速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的高聚物。
聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网状结构。
具有浓缩效应、电荷效应、分子筛效应。
血清蛋白在聚丙烯酰胺凝胶电泳一般可分成12～25个组分。
因此适用于不同相对分子质量物质的分离，且分离效果好。
聚丙烯酰胺凝胶作为电泳材料的特性人工合成聚丙烯酰胺凝胶的化学体系的组成及功能：Acr：丙烯酰胺Bis：甲叉双丙烯酰胺AP：过硫酸铵——化学催化剂TEMED：四甲基乙二胺——加速剂SDS是一种阴离子去垢剂，SO32-带负电荷。
在含有强还原剂的SDS溶液中可形成SDS-蛋白质复合物。
由于结合大量带负电荷的SDS，好比蛋白质穿上带负电的“外衣”，蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了。
从而起到消除各蛋白质分子之间自身的电荷差异的作用。
三、实验材料（一）试剂1、30%丙烯酰胺混合液（Acr:Bis 为29:1）称取丙烯酰胺（Acr）29g及甲叉丙烯酰胺（Bis）1.0g，用去离子水溶解并稀释至100ml，贮棕色瓶中于4℃保存，可用一个月。
2、1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml、三羟甲基甲烷（Tris）36.6g，加双蒸馏水至80ml使其溶解，调pH至8.8，然后用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
3、1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液取1mol/L HCL溶液48ml，Tris5.98g，加双蒸馏水至80ml，调pH6.8，用双蒸馏水稀释至100ml，置棕色瓶中，4℃贮存。
4、Tris-甘氨酸电泳缓冲液称取Tris 6g、甘氨酸28.8g，加蒸馏水850ml，调pH至8.3，加蒸馏水到1000ml，4℃贮存。
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-生物化学实验--聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质————————————————————————————————作者：————————————————————————————————日期：聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离血清蛋白质【目的】1 ．掌握圆盘电泳分离血清蛋白的操作技术。
2 ．熟悉聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理。
【原理】带电粒子在电场中向着与其自身电荷方向相反的电极移动，称为电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳（ PAGE ）就是以聚丙烯酰胺凝胶作为电泳介质的电泳。
在电泳时，蛋白质在介质中的移动速率与其分子的大小，形状和所带的电荷量有关。
聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，是由丙烯酰胺（ Acr ）单体和少量交联剂 N,N- 亚甲基双丙烯酰胺（ Bis ）在催化剂过硫酸铵（ Ap ）和加速剂四甲基乙二胺（ TEMED ）的作用下发生聚合反应而制得的（其化学结构式见第 2 篇第 1 章）。
聚丙烯酰胺凝胶具有网状结构，其网眼的孔径大小可用改变凝胶液中单体的浓度或单体与交联剂的比例来加以控制。
根据血清蛋白分子量的大小，学生实验一般选用 7 ％聚丙烯酰胺凝胶分离血清蛋白质。
不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳利用浓缩效应、分子筛效应和电荷效应的三重作用分离物质（见第 2 篇第 1 章），使样品分离效果好，分辨率较高。
一般醋酸纤维薄膜电泳只能把血清蛋白质分离出 5 ～ 7 条带，而聚丙烯酰胺凝胶电泳却能分离出十几条到几十条来（图 3-4 ），是目前较好的支持介质，应用十分广泛。
图 3-4 血清蛋白聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱根据凝胶支持物的形状不同，分为垂直板电泳和盘状电泳两种，二者原理相同。
本实验采用的盘状电泳是在直立的玻璃管中，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系，使样品在不连续的两相间积聚浓缩（浓缩效应）成厚度为 10 -2 cm 的起始区带，然后再利用分子筛效应和电荷效应的双重作用在分离胶中进行电泳分离。
【器材】1 ．电泳仪直流稳压电源，电压 400 ～ 500V ，电流 50mA 。
2 ．垂直管型圆盘电泳装置目前这类装置的种类很多，可根据不同的实验要求选择其中的一种。
这类装置均由两个基本的部分组成，一部分为载胶玻璃管，须选用内径均匀（ 5 ～ 6mm ） , 外径 7 ～ 8mm ，长 80 ～ 100mm 的玻璃管作为材料，也可以使用更细的玻璃管。
另一部分为电泳液槽，可分为上下两槽。
电泳时，上下两槽通过凝胶柱沟通电流（图 3-5 ）。
图 3-5 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A 为正面， B 为剖面 )3 ．大号试管和中号试管4 ．微量移液器5 ． 5ml 注射器和 9 号注射针头6 ．洗耳球、滤纸条、封口膜等【试剂】1 ．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺一般性的分析工作，用分析纯的 Acr 和 Bis 即可，精细的分析工作，尤其是分子量的测定和定量分析，需商品 Acr 和 Bis 进行重结晶，进一步纯化。
2 ． N ， N ， N ＇， N ＇—四甲基乙二胺（ TEMED ）商品 TEMED 即可，低温，避光保存。
3 ． 10% 过硫酸铵溶液（ AP ， W/V ）10g 过硫酸铵定容到 10ml ，最好使用新鲜配制的溶液。
4 ．染色液取三氯乙酸 200 g 加水 500ml ，然后加入 10 g 考马斯亮蓝 R 250 用玻璃棒搅拌，待完全溶解后，再加入蒸馏水加至 1000ml 。
5 ．脱色液的配制取三氯乙酸 100 g 加蒸馏水溶解后加至 1000ml 。
6 ．储备液的配制电极缓冲液、凝胶缓冲液及凝胶储备液配制见下表：浓缩胶缓冲液Tris 5.98g1mol/L HCl 48ml加蒸馏水至 100mlPH 6.7 凝胶储液Acr 30.0gBis 0.8g加蒸馏水至 100ml分离胶缓冲液Tris 36.3g1mol/LHCl 48ml加蒸馏水至 100mlPH 8.9 凝胶储液Acr 30.0gBis 0.8g加蒸馏水至 100ml10 × 电极缓冲液Tris 6gGly 28.8g加蒸馏水至 1000mlPH 8.3储液配制好后放冰箱 4 ℃ 冷藏备用，用时 10 倍稀释，学生用时大约 3 天需更换一次。
7 ．凝胶液的配制分离胶和浓缩胶的配制见下表：7% 分离胶配制（ ml ）3% 浓缩胶配制（ ml ）双蒸水13.5 双蒸水 5.7凝胶储液7 凝胶储液 1 PH 8.9 缓冲液7.5 PH 6.7 缓冲液 1.31%TEMED 2 1%TEMED 2总体积30 总体积108 ． 20% 蔗糖100ml 取蔗糖 20g ，加少许蒸馏水溶解，最后加至 100 ml 。
9 ．加样缓冲液的配制 ( PH6.7 )取 1mol 盐酸 4.8 ml ， Tris 0.6g ， 20% 蔗糖溶液 40ml ，加水至 80ml 充分混匀后，再加入 0.02g 溴酚蓝， 4 ℃ 保存备用。
【操作】1 ．凝胶系统的聚合和制备一般先制备分离胶，然后再在分离胶上面制作浓缩胶。
（ 1 ）电泳玻璃管的准备取一根洁净的电泳玻璃管，垂直放在青霉素瓶盖的凹穴中或用封口膜密封，备用。
（ 2 ）分离胶（小孔胶）的制备取分离胶 3ml 放入试管，加入100μl 10% Ap 溶液混匀后使用。
用微量移液器抽取胶液小心迅速加入到玻璃管内，当加到液面距离电泳玻璃管上口 2cm 时停止（约 1.6ml ）。
注意在加的过程中不要混进空气，用过的注射器和针头要及时用水清洗，防止堵塞。
再在其上面小心覆盖 0.5cm 高的蒸馏水层（约 0.2ml ）以隔绝空气，并防止柱表面的弯月面。
加水过程中不要用力过猛，防止将液面胶液冲起。
刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志分离胶聚合已经开始，应使玻璃管垂直静置约 15~20 分钟后，完成凝胶的聚合过程。
然后用滤纸小心吸去表面的水层，切勿破坏胶面的完整性。
（ 3 ）浓缩胶（大孔胶）的制备取浓缩胶 1ml 放入试管，加入50μl 10%Ap 溶液混匀后使用。
用微量移液器吸取少量浓缩胶缓冲液漂洗一下分离胶的胶面，用滤纸吸取残留的缓冲液，滤纸尽量不要接触胶表面。
再加入约 1cm 高的浓缩胶（约 0.25ml ），表面也覆盖一层蒸馏水。
刚加入水层时在水层和胶面的交接处可见一明显的折光面，此折光面会逐渐消失，等再次出现时标志浓缩胶聚合已经开始，聚合 20~30 min 后除去上面的水层，同样不要破坏胶面的完整性。
吸去水层后用电泳缓冲液漂洗胶面，再用电泳缓冲液注满至管口，在室温下放置10~20 min 后即可使用了。
2 ．样品的制备和点样（ 1 ）样品的准备：取兔血清 0.5ml ，加入 3ml 加样缓冲液混合。
可在 4 ℃ 冰箱保存 2 周。
（ 2 ）点样：将制好的胶管装入电泳槽中调节高度并塞紧，防止电泳中产生漏液。
然后分别在电泳槽的上下槽体内注入电泳缓冲液，下槽的液面应没过玻璃管的下管口（注意不要有气泡存在）和电极丝；上槽的液面应没过玻璃管口 0.5~ 1cm 。
用微量注射器吸取50μl 样品；标准蛋白样品 1 份（蛋白质含量1mg/ml ，溶于加样缓冲液中）小心的加入玻璃管内，注意不要让样品溢出管口。
4 ．电泳（ 1 ）电流电压条件圆盘电泳：直流稳流电流强度通常为 4mA/ 管。
（ 2 ）电泳时间一般约需 3 小时。
样品中溴酚蓝电泳至距分离胶前缘约 1cm 处时即可停止电泳。
5 ．剥胶电泳结束后，取下玻璃管，用带长针头的注射器（内盛蒸馏水）从浓缩胶一端紧贴玻璃管壁缓慢插入针头，一面注入蒸馏水一面缓慢旋转玻璃管。
靠水流的压力和润滑作用使凝胶和玻璃管的内壁分开，待水流从另一端流出时，再慢慢将针头退出（注意操作中不要把胶条搅碎）。
然后用洗耳球轻轻在胶管的一端加压，将胶条从玻璃管中缓慢滑出。
6 ．染色和脱色剥胶完毕后，将胶条放入染色液中过夜（ 16 小时以上）。
将胶条以自来水冲洗两次，然后在脱色液中脱色约 5 分钟，共两次。
7 ．结果分析脱色完全后，从脱色槽中取出凝胶（小心折断或撕裂），观察区带的数量及迁移率。
如果需定量，可进行区带扫描，计算出各区带中蛋白质的含量。
【注意事项】1 ．制胶时必须以封口膜将管下口封严密，加 AP 后立即灌胶。
2 ．灌凝胶时不能有气泡，以免影响电泳时电流的通过。
3 ．电泳时，电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错，以免样品反方向泳动，电泳时应选用合适的电流、电压，过高或者过低都会影响电泳效果。
4 ．电泳时，为保证电泳结果满意，最好使用新稀释的缓冲液。
5 ．丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺均为神经毒剂，对皮肤有刺激作用，操作时宜带手套，纯化应在通风柜中进行。
【思考题】1 ．聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，有何优缺点？2 ．哪些因素可以影响凝胶的聚合？3 ．为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的 40 ％蔗糖溶液？蔗糖及溴酚蓝各有何用途？附：1 ．不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制，见表 3 -2 。
表 3-2 不同浓度聚丙烯酰胺凝胶的配制分离胶浓度试剂名称配制 30ml 不同浓度分离胶液所需试剂量（ ml ）配制10ml 3%浓缩胶7% 10% 12% 15% 20%分离胶储备液缓冲液77.5107.5127.5157.5207.5浓缩胶储备液缓冲液------------------------------1.01.251%TEMED 蒸馏水213.3210.328.325.320.325.65以上各液加入后，为了去除抑制凝胶聚合的氧，在加入 Ap 之前应进行抽气处理。
10% 过硫酸胺0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.12 ．几种染料的性能及染色原理（ 1 ）氨基黑 10B(amino black 10B)C 22 H 13 O 12 N 6 S 3 Na 3 ， MW=715,λmax=620 ～ 630mm 。
氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。
是最常用的蛋白质染料。
缺点是灵敏度不太高，对 SDS—蛋白质染色效果不好，对不同的蛋白质着色度不同，色调不一（有蓝、黑、棕等）。
（ 2 ）考马斯亮蓝 R 250 (Comassie brilliant blue R 250 ) ：C 45 H 44 O 7 H 3 S 2 Na ， MW=824 ，λmax=560 ～ 590mm ，原理与氨基黑相似，灵敏度比氨基黑高 5 倍。
尤其适用于 SDS 电泳微量蛋白质染色。
但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白质的染色不合乎 Beer 定律。
（ 3 ）考马斯亮蓝 G 250 ：比考马斯亮蓝 R 250 多 2 个甲基， MW=854 ，λmax=590 ～ 610mm 。
染色的灵敏度不如 R 250 ，但比氨基黑高 3 倍，优点在于它在三氯乙酸中不溶解成胶体，能选择地染蛋白质而几乎无本底色。