变性与复性

稀释复性法
正交法优化复性条件
稀释复性法
变性蛋白质浓度对复性的影响
稀释复性法
复性缓冲液pH对复性的影响
稀释复性法
复性温度对蛋白质复性的影响
பைடு நூலகம் 稀释复性法
复性时间对蛋白质复性的影响
稀释复性法
精氨酸浓度对蛋白质复性的影响
稀释复性法
盐酸胍浓度对复性的影响
稀释复性法
不同蛋白质因其结构和变性条件及程度的差异， 复性条件和影响因素不同，结果也不同。 研究控制复性条件和因素的目的是最大限度抑制 聚集反应，促进正确折叠反应，达到最大的复性率。 伸展蛋白质分子的聚集反应是两个分子或多个分 子之间的反应，在动力学上属于二级以上的反应， 而正确折叠反应是单个蛋白质分子的自我组装过程， 动力学多属于一级反应。 两者相比，聚集反应与蛋白质浓度的关系更大。 在低浓度进行复性有利于控制聚集反应。
促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力
蛋白质从伸展的多肽链折叠成特定的天然构象 在总体上受到热力学或/和动力学控制。而在折叠的 具体过程中是受到各种作用力的综合作用进行折叠。 维系蛋白质构象与促进蛋白质折叠的作用力本质上 是一致的，二者的区别是前者在维系天然的静态中 起作用，而后者在多肽链折叠的动态过程中起作用。 总体上看，二者都可分为四种主要类型： • 疏水相互作用 多肽链处于水环境时，其非极性侧链基团为避开 极性分子而形成疏水核心，是“疏水折叠”
复性有关理论
蛋白质从去折叠状态向折叠状态即天然状态 转变的过程中，必须经历一个高自由能的过渡态。
蛋白质复性过程中能量变化示意图
复性有关理论
在这个过渡态中蛋白质可有多种构象形式，而天 然状态蛋白质可能有一种或有限的几种构象状态存在。 蛋白质的再折叠是依据最小能量原则进行的，假 设蛋白质的天然构象是能量最小的构象，变性态蛋白 质分子会自发的向这个最小能量状态转变。这就是 “热力学假说”。 该理论认为：蛋白质天然构象形成具有协同性， 其能量差别足以区别天然构象和其它构象。大部分蛋 白质的天然构象应是能量最小构象。
复性有关理论
大量研究还发现，许多蛋白质在体外的变性复 性过程并非完全可逆，且体外复性速度远比体内低， 多肽链折叠过程中受到许多因素的限制，如S-S键重 排和脯氨酰顺反异构等都是折叠反应的限速步骤， 实际多肽链在折叠过程受到动力学控制。 蛋白质在折叠过程中会有两种途径相互竞争，一 种是正确折叠形成天然构象的途径，另一种是错误 折叠成稳定的非天然构象的途径。蛋白质多肽链的 正确折叠是一些因素在折叠动力学过程中起到控制 作用。
蛋白质的复性
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目前发展的复性方法： 稀释复性 透析、透滤复性 分子伴侣指导复性 色谱法复性： 凝胶过滤色谱复性、离子交换色谱复性 、 疏水色谱复性、亲合色谱复性 反胶团复性 双水相复性
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蛋白质的复性
一个有效、理想的折叠复性方法应具备以下特点： • 活性蛋白质回收率高； • 正确复性产物易于与错误折叠蛋白质分离； • 折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品； • 折叠复性方法易放大； • 复性过程耗时少。 就工业应用，要求折叠复性过程要快速、低成本、高 效。 虽然蛋白质折叠复性方法很多，但就某种蛋白质仍需 通过实验确定最佳方法和条件。
蛋白质结构
蛋白质如何从具有一级结构的肽链形成具有生物 功能的三级结构的机制是由DNA到有生物学功能蛋白 质之间唯一没有解决的问题。 其研究具有重大理论意义，对利用基因工程生产 活性蛋白质有重要指导意义。 研究蛋白质的溶液构象、折叠途径是揭示新生态 肽链折叠过程的基础。 蛋白质的较低级的结构是形成更高级结构的基础， 而高级结构可能对低级结构有进一步的调整和完善作 用。
稀释复性法
通常，复性的蛋白质浓度为10~50μg/mL。 存在蛋白质浓度低复性率高，蛋白质浓度高复性 率低的矛盾。 操作方式 一次性稀释：操作方式，速度 分段稀释：一般采用两步法，先将变性剂浓 度降低到一中间浓度，最后再完全除去。 连续稀释：变性蛋白质溶液与复性溶液按一定 比例连续混合，复性。 分段和连续稀释法的复性回收率高于一次性稀释。
包涵体的分离
1.用表面活性剂和NaCl 混合物洗两次 3.标准蛋白质 5.表面活性剂洗两次 6.细胞破碎物
包涵体的溶解
包涵体的溶解需要打断蛋白质分子内和分子间 的共价键（二硫键）、离子键、疏水作用及静电作 用等，使多肽链伸展。 因此，包涵体的溶解需要强的变性剂，如尿素、 盐酸胍或硫氰酸盐，或表面活性剂，如SDS、十六烷 基三甲基铵氯化物、肌氨酸、正十二烷基肌氨酸钠 等； 对于含半胱氨酸的蛋白质，还需加入还原剂，如 巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫基赤藓糖醇、 半胱氨酸、谷胱甘肽等使S- S键断裂。
促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力
过程的主要动力，同时也是维系多肽链折叠状态的 主要作用力。另外，全部或部分暴露在水环境中的 非极性侧链基团也有明显地疏水相互作用，在多肽 折叠的早期中间体中起重要作用。 • 氢键 蛋白质内有非常多的氢键，具体某一氢键对蛋白 质的构象的贡献很小，但所有的氢键的力量加起来 就是一个非常重要的作用，不同氢键对蛋白质构象 的影响大小也不同，但，至少在二级结构，如α-螺 旋和β-折叠的形成与维系起重要作用。
包涵体的溶解
由于金属离子具有催化氧化作用，需加金属离 子螯合剂，如EDTA、EGTA。 温度一般25℃~30℃，以促进溶解。 也有用70%甲酸溶解包涵体。 在细胞周质内形成的包涵体，可采用原位溶解法。 即在发酵结束时向培养基中加入变性剂和还原剂， 在碱性条件下进行包涵体原位溶解（增加细胞膜的 通透性，使包涵体溶解出来），无需采用其它破碎 细胞方法，再采用双水相萃取除去细胞碎片，获得 包涵体溶解液。
蛋白质复性时聚集反应的抑制
复性中最重要的是抑制复性过程的聚集反 应。 最常用的是使用聚集反应的抑制剂，其原 理为： 稳定正确折叠蛋白质的天然结构， 降低错误折叠蛋白质的稳定性， 增加折叠复性中间体的溶解度， 增加非折叠蛋白质的溶解度， 减少复性中间体接触发生聚集反应。
蛋白质的复性
复性简单地说就是脱除变性剂使溶解的包 涵体蛋白质的伸展肽链折叠成正确的空间结构。
蛋白质的折叠复性过程及聚集体的产生
蛋白质的复性
在复性过程中，处于伸展状态的肽链，因暴露在 外面的疏水侧链基团之间的相互作用而使这些分子很 容易发生聚集反应，形成沉淀，这是大多数蛋白质复 性率低的一个主要原因。 好的复性方法应能够最大程度的抑制蛋白质的聚 集反应，促进蛋白质向折叠成正确的空间结构方向反 应。 探索高效、方便的蛋白质复性方法对于基因工程 产品和理论研究均有重要意义。 实践证明，由于蛋白质自身的复杂性和多样性， 没有那一种复性方法适用于所有的蛋白质。
促进与维系蛋白质折叠和天然构象的作用力
• 盐键 多肽链上的众多带正负电荷的侧链基团之 间或与环境中的正负离子之间的静电作用对蛋 白质的稳定性有较大影响，在蛋白质构象形成 过程中也起到重要作用。 • 二硫键 是侧链基团之间唯一的共价键，对蛋白质 天然构象及折叠过程中形成的中间体具有很强 的稳定作用，在蛋白质折叠过程中起到关键作 用。
变性与复性
变性过程总伴随着蛋白质的物理、化学、生物 学性质的变化，如溶解度改变、体积变大、黏度增 加、扩散系数降低、生物活性降低或消失等。 蛋白质变性时肽链伸展而失去特定的空间结构， 这一过程称为肽链的伸展或去折叠。随着这一过程 的进行，整个分子也由天然蛋白质紧密的、球状或 近球状结构伸展为松散的无一定空间结构的链状分 子。 许多变性蛋白质在去除变性因素后，可自发地恢 复它原来的空间结构和生物活性，这称为变性蛋白 质的再折叠或复性。
稀释复性法
这是目前最简单的蛋白质复性方法。将少量的变 性蛋白质溶液以一定比例滴加到复性缓冲液中，达到降 低变性剂浓度的目的，使处于变性伸展状态的蛋白质分 子在溶液中自发地折叠成天然的活性结构。 为获得好的复性结果，必须进行复性条件优化。因 复性原理不清楚，只能通过实验来确定。一般可采用正 交法。 影响复性的条件主要有：变性蛋白质溶液组成及浓 度、复性缓冲液的组成（离子种类、氧化还原试剂、螯 合剂）、离子强度、pH、氧化还原电位、复性温度、 稀释倍数、混合方式速度等。
复性有关理论
“动力学假说”与“热力学假说”并不互相否 定，而是互相补充与修正，对不同蛋白质而言，二 者在蛋白质多肽链折叠过程中所起的作用大小不同， 各有特点。总体上，蛋白质的折叠遵循“热力学假 说”，从高能态向低能态转变的过程又受动力学控 制。一些小分子单结构域蛋白质的折叠过程相对简 单些；热力学控制下能容易地进行可逆的变性、复 性；结构比较复杂的蛋白质，特别是涉及S-S键重排， 脯氨酰顺反异构限速步骤的折叠反应，总体上受热 力学控制，但折叠途径即动力学控制比较重要。
包涵体对分离纯化的影响
有利方面： • 蛋白质表达量高； • 抗剪切和较高温度，对破碎细胞的方法和条件要求低； • 包涵体密度大，易分离； • 包涵体的蛋白质纯度较高； • 后续蛋白质分离纯化较容易。 不利方面： • 需变性复性； • 活性蛋白质收率低。
包涵体的分离
• 破碎细胞，可耐受较高温度和破碎条件； • 离心沉淀包涵体，离心力较低，除去碎片； • 洗涤包涵体，包涵体的目的蛋白质含量为80% 左右，含有酯类，蛋白，可用含低浓度的变性 剂，如尿素、盐酸胍、Triton X-100，脱氧胆 酸钠的缓冲液反复洗涤，黏度高时可用DNAse、 溶菌酶处理，甚至于可用稀NaOH溶液洗涤， 获得较纯的包涵体。
蛋白质结构
蛋白质的结构层次
蛋白质结构
其中，二级结构和折叠中间体的形成直接影响 着球状蛋白质的折叠和寡聚体的组装，结构转换和 错误折叠往往导致蛋白质的聚合。 二级结构转换是指某些蛋白质中的α-螺旋向β折叠转变，它是改变蛋白质稳定性和聚合的原因。 寡聚体组装和蛋白质的聚合遵循不同的分子机理。 前者有一定的专一性，后者则是蛋白质分子的随机 集合。 研究寡聚体蛋白质折叠和装配，能够深入地揭 示蛋白质折叠和聚合问题。目前，虽然有关研究取 得了很大进展，但对折叠复性还有很多未解之迷。
变性与复性
Unfolding and Refolding
变性与复性
• 1931年吴宪教授提出蛋白质变性理论。 若溶液中存在变性剂（酸、碱、盐酸胍、尿素、 重金属、某些有机试剂等）能引起蛋白质变性。 蛋白质变性是因维系其空间结构的次级键被破坏， 原有的空间结构解体，蛋白质肽链构型调整以适应新 环境。 弱变性条件下，蛋白质部分变性，肽链保持一定 结型；强变性条件下，蛋白质完全变性肽链伸展成无 序随机状态。
稀释复性法
分段稀释复性时时间间隔对复性率的影响
稀释复性法
简单稀释和分段稀释复性比较
稀释复性法
稀释复性应用于大规模生产的问题： • 复性缓冲液量大，体积大，设备利用率低； • 蛋白质浓度低，产物回收困难； 稀释复性法是其他复性法的基础。对一个新 的包涵体蛋白质复性时，首选的方法是稀释复性 法。从中获得的条件和认知可供其它方法参考。
包涵体
目前用基因工程表达的蛋白质有4000多种， 用E.coli表达的占90%以上，在E.coli细胞质内高 水平表达的外源蛋白质，尤其是来自真核生物的 蛋白质，会形成不溶性聚合物---包涵体。
E.coli包涵体
包涵体
包涵体形成原因：
• 使用高计量基因和强启动子； • 大肠杆菌细胞质环境条件，如pH、离子强度、高还原 电位，不同于外源蛋白质正确折叠为最终构象的条件； • 缺少蛋白质正确折叠的辅助因子。如催化构象互变的 折叠酶，脯氨酰基顺/反异构酶，二硫键异构酶，及增 强折叠或阻止聚集的分子伴侣等。 • 超表达产生的高浓度新生蛋白质由于多肽链不完全折 叠，有利于分子疏水序列之间的相互作用，最终导致 这些蛋白质的聚集和错误折叠。
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分 子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。 按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作 用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但 不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类 似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不 改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此， 该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠 机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。