细胞核与线粒体的分离
细胞核和线粒体的分离和观察课件
目录
CONTENTS
• 细胞核和线粒体的基础知识 • 细胞核和线粒体的分离技术 • 细胞核和线粒体的观察方法 • 实验操作注意事项 • 实验结果分析
01
CHAPTER
细胞核和线粒体的基础知重要的亚 细胞结构，由核膜、核仁和染色 质等组成。
细胞核和线粒体的分离效果
通过染色和显微镜观察，可以清晰地看到细胞核和线粒体被成功 分离，没有明显的杂质。
细胞核和线粒体形态特征
分离后的细胞核呈现圆形或椭圆形，表面光滑，结构致密；线粒体 呈现长条形或杆状，表面有细微的皱褶。
荧光染色效果
通过荧光染色技术，可以观察到细胞核和线粒体分别发出蓝色和绿 色荧光，荧光信号强且均匀。
数据分析
对观察结果进行统计分析 ，得出结论。
实验后的处理
清洗和整理实验器材
实验结果总结
实验结束后，及时清洗和整理实验器 材，确保其完好无损。
对实验结果进行总结，撰写实验报告 ，并进行分析和讨论。
废弃物处理
按照规定处理实验废弃物，避免对环 境和人体造成危害。
05
CHAPTER
实验结果分析
实验结果展示
差速离心法是一种简单、快速和经济 的方法，适用于分离大量细胞。
密度梯度离心法
01
密度梯度离心法是一种 利用连续的密度梯度介 质对细胞进行分离的方 法。
02
在密度梯度离心法中， 细胞悬浮在密度梯度介 质中，然后在离心机中 旋转。
03
由于不同细胞组分的密 度不同，它们在介质中 沉降的速度也不同，从 而实现分离。
电子显微镜观察
总结词
电子显微镜提供了高分辨率的图像，能够更精确地观察细胞核和线粒体的超微结 构。
1-细胞生物学实验
如镜台测微尺1mm处(全长)与目镜测微尺75 刻度(150小格)重合，则:
目镜测微尺每小格的实际长度=
1 150
mm
=0.0067mm=6.7μm
④同样的方法标定高倍镜下目镜测微尺 每小格的实际长度
计算公式如下:
目镜测微尺每小格的实际长度
镜台测微尺长度 ＝
目镜测微尺格数
＝ 30×10μm 200
(4)测量细胞并计算核质比
五、实验操作
1. 取猪肝1g，放入小烧杯中，加4ml 0.25M蔗糖缓冲液， 将组织剪成约1mm立方的小块。
2. 将剪碎的组织移入匀浆器的外管中，再将内管（带柄 的活塞）插入外管中，缓慢而均匀地施力，上下旋转拉 动，匀浆7-10分钟，然后用六层纱布过滤回洗净的原烧 杯中。（这两步操作略）
3. 每组取1个5ml离心管，加入匀浆液2ml，2000rpm离 心10分钟。（每组1管）
许多酸性染料不易穿过活细胞的质 膜进入细胞内，却能渗入死亡的细胞 内，使其着色，以此来鉴别死活细胞。
2.方法 取酵母悬液一滴于洁净玻片上，滴一滴0.2％亚甲基
蓝染液，加盖片，2分钟后于显微镜下观察细胞。
3.结果 死细胞被染成蓝色，活细胞不着色。
实验作业
画图记录细胞吞噬实验所见结果
实验三
细胞核与线粒体的 分级分离
实验内容
实验一、细胞的形态结构与显微测量 实验二、细胞生理活动的实验观察 实验三、细胞核与线粒体的分级分离 实验四、细胞分裂的形态观察 实验五、细胞原代培养 实验六、细胞计数及死活细胞的鉴定 实验七、综合设计性实验
实验一
细胞的形态结构与显微测量
实验目的
(一) 观察并了解细胞的基本形态。 (二)掌握临时制片和显微绘图的方法。 (三)了解显微测微尺的原理及使用方法
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核，叶绿体，线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光。
4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法。
二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心，是分离细胞器的常用方法。
细胞组分的分离在等渗溶液（0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行。
●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞。
●在3000r/min的条件下离心5 min，即可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。
●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶，洗净搽干后去除叶梗和粗脉，称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中，放入组织捣碎机(间歇)；低速匀浆1min；间歇匀浆。
2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中。
3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离。
5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮。
（浓度不要太高，不利于观察）➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙染料，加盖玻片即可在荧光显微镜下观察。
第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟，所得沉淀即为线粒体，可反复离心一次。
收集沉淀涂片，用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下，要迅速分离和观察。
细胞器线粒体的分离与观察
细胞器线粒体的分离与观察高熹1120152430（李安一）（北京理工大学生命学院16121501班）摘要：差速离心法是交替使用低速和高速离心，用不同强度的离心力使具有不同质量的物质分级分离的方法。
此法适用于混合样品中各沉降系数差别较大组分的分离。
离心分离出细胞核与线粒体，进行染色，对细胞核和线粒体的形态进行观察并记录。
关键词：差速离心法；细胞核；线粒体；实验。
1 引言差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
起始的离心速度较低，让较大的颗粒沉降到管底，小的颗粒仍然悬浮在上清液中。
收集沉淀，改用较高的离心速度离心悬浮液，将较小的颗粒沉降，以此类推，达到分离不同大小颗粒的目的。
线粒体是真核细胞特有的，司能量转换的重要细胞器。
细胞种的能源物质——糖、脂肪、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸华生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体的结构和功能的研究通常是在离体线粒体上进行的。
制备线粒体用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中（对于所使用的离心机，就是选用一定的转速），球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心某一时间内，组织匀降中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉降的是细胞核，其次是线粒体，其他更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意样品保持4，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引而堆积在线粒体膜上。
5.细胞核和线粒体的分级分离
实验五细胞核与线粒体的分级分离一、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／l 蔗糖一0.003mol／l氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沉淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
二、实验用品（一）材料和标本：小白鼠、冰块。
（二）器材和仪器：玻璃匀浆器、普通离心机、台式高速离心机、普通天平、光学显微镜、载玻片、盖玻片、刻度离心管、高速离心管、滴管、10ml量筒、25ml烧杯、玻璃漏斗、解剖剪、镊子、吸水纸、纱布、螬盘、平皿、牙签。
（三）试剂：0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液、1％甲苯胺兰染液、0.02％詹纳斯绿B染液、0.9％NaCl溶液。
三、实验步骤（一）细胞核的分离提取1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／l蔗糖一0.003mol ／l氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
实验一、线粒体的分离与观察
• 线 粒 体 的 鉴 定 用 詹 纳 斯 绿 活 染 法 。 詹 纳 斯 绿 B （ Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属 于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜 上。线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈 现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无 色。
三、实验用品
1、材料
大鼠肝脏
2、试剂
①生理盐水。
②1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
③0.25 mol／L蔗糖十0.01 mol／L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）：
④0.34 mol／L蔗糖十0.01 mol/L Tris一盐酸缓冲液 （pH7.4）
⑤固定液：甲醇一冰醋酸（9：1） ⑥姬姆萨染液
ห้องสมุดไป่ตู้
Differential centrifugation
High speed
Low speed
• 悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分 散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在 pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分 离。整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活
2．差速离心
先将 9ml 0.34 mol／L缓冲蔗糖溶液放人离心
管．然后沿管壁小心地加入9ml肝匀浆使其覆盖于上层。 用冷冻控温高速离心机按图10－l顺序进行差速离心。
3．分离物鉴定。 (1) 细胞核：
取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇—冰醋酸 液固定15min，充分吹干，滴姬姆萨染液（原液10～20 倍稀释）染色10min。自来水冲洗，吹干，镜检。结果： 细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
二 实验原理
• 采用组织匀浆在悬浮介质中进行分离细胞器； • 在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的
细胞核与线粒体的分离
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
细胞器鉴定
细胞破碎的注意事项：
1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液 （0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有 足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。 3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/21000rpm （五楼实验室）
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
分离线粒体
从细胞、组织中分离线粒体——差速离心法所需缓冲液：RSB（使细胞膨胀的低渗缓冲液）10mM NaCl（Mr=58.44）2.5mM MgCl2（Mr=203.3）10mM Tris-Cl（PH8.0）调PH值至7.4配法：0.5844g NaCl，0.5083g MgCl2·6H2O，10ml 1M Tris-Cl（PH8.0），调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
2.5×MS缓冲液（MS缓冲液是用来保持细胞器张力的等渗缓冲液）525mM甘露醇（Mr=182.17）175mM 蔗糖（Mr=342.3）12.5mM Tris-Cl（PH8.0）2.5mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：19.13g甘露醇，11.98g蔗糖，加150ml水溶解，加2.5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），1ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至200ml。
1×MS缓冲液210mM甘露醇70mM 蔗糖5mM Tris-Cl（PH8.0）1mM EDTA（PH8.0）调PH值至7.4配法：38.26g甘露醇，23.96g蔗糖，加800ml水溶解，加5ml 1M Tris-Cl（PH8.0），2ml 0.5M EDTA（PH8.0），用1M HCl调PH值至7.4，加水定容至1000ml。
注意事项：溶液、离心管应在冰上预冷，所有离心步骤都要在40C进行。
从细胞中分离线粒体：1．消化贴壁细胞，加5ml培液，转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清；悬浮细胞直接转入10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，加5ml PBS，1000rpm离心5min，弃上清。
2．用3ml冰上预冷的RSB重悬细胞，让细胞膨胀10min，加3×61uL PMSF贮液，在冰上匀浆，转速不宜过快。
细胞分裂的遗传物质分离机制
细胞分裂的遗传物质分离机制细胞分裂是生物体生长和繁殖的基本过程之一。
在细胞分裂过程中，细胞核内的遗传物质需要准确分离，以保证新生细胞的遗传信息的准确传递。
细胞核内的遗传物质主要包括染色体和细胞质内的遗传物质，它们通过不同的机制进行分离。
1. 染色体的分离机制在细胞分裂的过程中，染色体的准确分离是非常重要的。
染色体的分离是通过两个重要的过程来实现的：核分裂和细胞质分裂。
核分裂是指染色体在细胞核内的准确分离过程。
在有丝分裂中，染色体首先复制，形成姐妹染色单体，然后通过纺锤体的作用将姐妹染色单体分离到细胞核的两个极端。
在无丝分裂中，染色体则通过核膜和核仁的分解与重组，然后直接分离。
细胞质分裂是指在细胞核分裂完成后，细胞质进行分离的过程。
细胞质分裂通常发生在核分裂之后，通过细胞骨架和细胞膜的重组来实现细胞质的分离。
在细胞质分裂过程中，细胞骨架和细胞膜的收缩带起到重要的作用，将细胞分为两个新的细胞。
2. 细胞质内遗传物质的分离机制除了染色体的分离外，细胞质内的遗传物质也需要准确分离。
细胞质内遗传物质的主要组成部分包括线粒体和叶绿体。
线粒体是细胞质内的细胞器，负责细胞的能量代谢。
在线粒体分裂时，其内部的DNA也需要分离。
线粒体分裂是一种独特的遗传物质分离方式，它通过线粒体自身的分裂过程来实现DNA的准确分离。
叶绿体是植物细胞和一些原生生物中的细胞器，是光合作用的场所。
在叶绿体分裂的过程中，其内部的DNA也需要分离。
叶绿体的分裂机制与线粒体类似，通过叶绿体自身的分裂过程来实现DNA的准确分离。
3. 遗传物质分离的重要性细胞分裂是生物体生长和繁殖的基本过程，遗传物质分离的准确性对于新生细胞的遗传信息的准确传递非常重要。
如果遗传物质分离出现错误，可能导致染色体不平衡和基因突变等问题，进而影响生物体的正常发育和功能。
细胞分裂的遗传物质分离机制不仅在自然界中起到重要的作用，也在科学研究和医学领域中具有重要价值。
对细胞分裂过程及其遗传物质分离机制的深入研究，可以帮助人们更好地理解生命的奥秘，并有助于探索和治疗与遗传有关的疾病。
细胞核与线粒体的分离
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束 不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心
常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。
• 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀；
③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/2100水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5 6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。
细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究
细胞核和线粒体的融合和分裂的分子机制研究一、引言在细胞内，细胞核和线粒体是两个重要的细胞器。
细胞核是细胞中的控制中心，包含着细胞的遗传信息，可以指导细胞的生长、分裂、分化等重要生命活动。
线粒体则是能量产生的地方，参与了细胞内ATP的合成过程，是细胞内的“动力站”。
两者的正常功能和相互协调，对于维持正常细胞代谢和生命活动至关重要。
本文将介绍细胞核和线粒体在细胞内融合和分裂的分子机制研究。
二、细胞核的融合和分裂1. 细胞核的融合细胞核融合是细胞内一种常见的现象，发生在不同细胞类型之间，也可以发生在同一细胞内。
细胞核融合的主要过程是两个细胞核的膜和核孔融合，形成一个新的细胞核。
细胞核融合在细胞分裂、配子的合并以及体细胞复制等过程中发挥着重要的作用。
在真菌细胞的生殖过程中，细胞核融合是必须的。
在两个不同的菌株交配时，两个不同的细胞核先互相识别，然后相互融合。
细菌的细胞核融合是直接发生的，而真核生物的细胞核融合则需要依赖线粒体的参与。
2. 细胞核的分裂细胞核的分裂是指一个已经融合的细胞核经过有序的分裂过程分成两个细胞核，从而实现细胞的分裂。
细胞核分裂是生物体中一个基本的生物学过程，也是细胞分裂分化和生殖的基础。
细胞核的分裂可分为有丝分裂和无丝分裂两种。
有丝分裂的发生需要依赖于微管的形成和变化，在一系列有序的过程中完成细胞核的分裂。
相比之下，无丝分裂过程则较为简单，亦适用于一些不具有微管的原核生物。
三、线粒体的融合和分裂1. 线粒体的融合由于线粒体在基因组、膜蛋白结构等方面的特殊性质，线粒体细胞质的融合通常只发生在特定的条件下。
线粒体融合经常发生在精子的入侵和受精卵的形成过程中。
在精子进入受精卵之后，会释放出线粒体DNA，该DNA被研究人员用来推断线粒体融合的过程，进一步证实了线粒体融合的存在。
2. 线粒体的分裂线粒体分裂是通过不同的机制进行的，分别是原代线粒体的分裂和线粒体DNA的复制和分配。
酵母中线粒体的分裂过程需要多种催化反应，包括酵母基因群中的一组B电子转移酶蛋白和PARP-1和脑钠素的介导反应等。
细胞核及线粒体的分级分离实验报告
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【精品】细胞生物学实验指导讲义
实验一细胞的基本形态结构的观察实验原理与目的（1）通过观察动、植物细胞，了解细胞形态的多样性并掌握光镜下细胞的基本形态结构。
（2）初步掌握临时制片技术和显微绘图的方法。
实验原理细胞是生命活动的基本结构单位和功能单位。
构成人体或其他高等动物或植物的细胞种类繁多，形态各异。
细胞的形态都与它们的功能相适应。
如具有运输O2和CO2功能的红细胞为双凹盘状；具有感受刺激与传导功能的神经细胞呈星芒形，附有长短不等的树枝状突起；上皮细胞是柱形或扁平形；巨噬细胞则呈不规则形状，并能伸出伪足，以利于为执行吞噬和消灭外源的病原微生物的功能。
虽然细胞在形态上多种多样、大小不同，但却具有共同的基本结构特点，即都是由细胞膜（cellmembrane）、细胞质(cytoplasm)和细胞核(nucleus)组成。
实验用品1．器具：显微镜、载玻片、盖玻片、推片、吸管、镊子、牙签、擦镜纸、吸水纸、小剪刀。
2．材料：洋葱、人口腔上皮细胞、鸡血液、人血细胞涂片、蟾蜍血细胞涂片。
3．试剂：2%碘液、Giemsa染液。
试剂配制1．2%碘液：称取碘片2g，碘化钾5g，蒸馏水100ml混匀溶解即可。
2．吉姆萨(Giemsa)染液：吉姆萨粉(Giemsastain)l.0g甘油(AR)66ml甲醇(AR)66ml将Giemsa粉放入研钵中，先加入少量甘油，研磨至无颗粒为止，然后再将全部甘油倒入，放56℃温箱中2h后，加入甲醇，将配制好的染液密封保存棕色瓶内(最好于0~4℃保存)。
内容与方法一、洋葱鳞茎表皮细胞制片与观察：1.临时制片：取一擦净的载玻片，在玻片中央滴一滴2%的碘液，将洋葱茎用小刀分为几块，取一块肉质鳞叶，用镊子在其表面轻轻撕下一小块膜质表皮，再用剪刀剪成3～4mm2的小块，置于载玻片的染液中铺平，染色2～3分钟，盖上盖玻片，用吸水纸吸去盖玻片周围多余的染液。
2.观察：将标本置于低倍镜下观察，可见许多长柱状排列整齐、彼此相连的细胞，选择其中较典型的细胞移至视野中央，然后换成高倍镜观察以下结构：1）细胞壁：在每两个细胞相连处，可看到二层壁状结构，是相邻细胞各自的细胞壁，有纤维素构成。
实验二 细胞核与线粒体的分离与观察
实验二细胞核与线粒体的分离与观察一、实验目的1．了解差速离心法分离细胞核与线粒体的原理。
2．掌握差速离心法分离动物与植物细胞的细胞核与线粒体的方法。
二、实验原理细胞核（nucleus）是细胞中重要的细胞器，细胞的控制中心，在细胞的代谢、生长、分化中起着重要作用，是遗传物质的主要存在部位。
线粒体（mitochondria）是真核细胞特有的能量转换的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所。
细胞中的能源物质—脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过偶联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动需要。
对细胞核和线粒体结构与功能的研究通常是在离体进行的，因而分离细胞核和线粒体是必须的。
差速离心主要是采取逐渐提高离心速度的方法分离不同大小的细胞器。
采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心分离细胞核和线粒体。
在确定的离心场中，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的黏度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
缓冲的蔗糖溶液是常用的悬浮介质，它属于等渗溶液，比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿B（Janus green B）活染法，对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中染料被还原成无色。
从植物细胞分离线粒体除了作线粒体功能测定外，在植物细胞遗传工程中，常用于分离核外基因——线粒体DNA等目的。
分离线粒体的方法仍采用均匀介质中的差速离心。
细胞实验教案1.
细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。
二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。
分离细胞器最常用的方法是将组织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用差速离心法进行分离，其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法已成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。
匀浆(Homogenization)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。
分级分离(Fractionation)由低速到高速离心逐渐沉降。
先用低速使较大的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下来，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。
由于样品中各种大小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管中，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。
分析分级分离得到的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。
三、细胞核的分离提取(一)操作步骤1．用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9％NaCl的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。
2．将湿重约1g的肝组织放在小平皿中，用量筒量取8ml预冷的0.25mol／L蔗糖一0.003mol／L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平皿中，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。
3．剪碎的肝组织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛有冰块的器皿中，左手持之，右手将匀浆捣杆垂直插入管中，上下转动研磨3～5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备一张涂片①，做好标记，自然干燥。
细胞器的分级分离
(2)线粒体的鉴定
于洁净载玻片上滴1滴0.02％～1％的詹纳Байду номын сангаас绿B染 液，用牙签挑取线粒体沉淀均匀涂于染液中，染色5～ 10 min，盖上盖玻片，镜检。
[结果与分析]
光学显微镜下观察，细胞核经甲基绿-派洛宁 染色，DNA呈蓝绿色，核仁和胞质RNA呈红色。观 察分析完整细胞核的数量及其比例。线粒体经詹 纳斯绿B染色呈亮绿色。溶酶体可用酸性磷酸酶显 示法鉴定。光镜下看不到溶酶体的形态特征，但 可看到代表溶酶体的棕黑色颗粒或团块。如果分 离到的细胞组分符合其形态学及酶学特征，而且 没有其他组分的污染，则证明分离操作成功，反 之则为失败。
(3)细胞核鉴定：
。
涂片：在离心后的沉淀中加入几滴PBS，混 匀后涂片，空气干燥 固定：浸入95％的乙醇溶液5min，晾干 染色：滴加甲基绿-派洛宁染液染色15min 分色:快速放入丙酮中，蒸馏水漂洗，擦干水分
显微镜下观察结果
(4)线粒体的分离
将分离细胞核时收集的上清以10000 g 离心10 min，将上清移入1.5 ml Ep管内并置冰上或4℃冰箱 待用。沉淀用0.25 mol/L的蔗糖溶液重悬后， 10000 g离心10 min，重复1次，取沉淀。
2.细胞器的分级分离
(1)细胞核的分离： 第一次:1000rpm,8min。
上清保留于试管1.0处
加0.25M蔗糖至4ml，混匀
重复1次
第二次:1300rpm,8min。弃上清
(2)细胞核的纯化 在沉淀中加入0.34mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2 至2ml，混悬。用长针头注射器在混悬液下轻轻加入2ml 的0.88mo1/L蔗糖-0.5mmol/L Mg(Ac)2溶液。尽量使两 种溶液明显分层。 2000rpm离心8min。
细胞组分分级分离实验报告
细胞组分分级分离实验目的分级分离细胞核和线粒体实验原理1.相关概念细胞组分分级分离：依据细胞内各种结构的比重和大小不同，在同一离心场内的沉降速度也不同的原理，采用差速离心法或密度梯度离心法，将细胞各种组分分离出来。
常用分离方法：差速离⼼法——不同转速；密度梯度离⼼法——不同浓度的介质2.分离方法（1）差速离⼼法特点：介质密度均⼀；离⼼⼒由低向⾼；逐级离⼼（差速）。
⽤途：初步分离；分离⼤⼩相差悬殊的细胞组分。
细胞器沉降顺序：细胞核→线粒体→溶酶体、过氧化物酶体→内质网、⾼尔基体→核糖体（2）密度梯度离⼼法特点：介质密度不均⼀；呈现密度梯度；离心力相同（等速，超速）⽤途：纯化分离细胞器等颗粒组分待分离颗粒沉降顺序：各待分离颗粒的沉降与其密度相等或相近的梯度柱范围常⽤介质及要求：蔗糖、⽢油、氯化銫；能产⽣密度梯度，且密度⾼时，粘度不⾼；PH中性或易调为中性；浓度⼤时渗透压不⼤；对细胞⽆毒3.染色方法甲基绿-哌罗宁染色：核酸呈酸性，与碱性染料甲基绿-哌罗宁染液具有亲和力，这两种碱性染料有选择的特异性染色，甲基绿把DNA染成绿色，哌罗宁把RNA染成红色。
詹纳斯绿B染色：詹纳斯绿B可专一性地对线粒体进行超活染（体外活染），这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用，使詹纳斯绿B染料始终保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中詹纳斯绿B则被还原成无色的化合物。
实验设计思路实验结果分散相的线粒体被染成浅蓝色，呈圆形或椭圆形颗粒。
如果线粒体聚集成堆则被染成深蓝色，难以辨认。
注意事项1.过滤前要先将纱布湿润2.匀浆缓冲液预冷(0℃—4℃)3.冰浴上研磨，匀浆搗杆垂直插入匀浆管中，上下转动研磨3-5次，尽可能充分破碎细胞(适度研磨)，缩短匀浆时间。
4.离心机温度应设为4℃5.整个分离过程不宜过长,要尽快。
6.得到的沉淀物须加预冷蔗糖缓冲液将其悬浮后再涂片，制线粒体滴片时，悬浮液只需一小滴，量太多线粒体易聚集成堆，不便观察。
实验六细胞器的分离与观察
0.34mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
0.88mol/L蔗糖溶液-0.5mmol/Mg（Ac)2溶液、
95%乙醇溶液、丙酮、PBS液、
甲基绿
Байду номын сангаас
-派洛宁染液、中性红-詹纳斯绿染液。
四、实验方法与步骤
1.细胞核的分离
（1）组织匀浆:将饥饿24h的大白鼠处死,立即剪开腹 部,迅速取出肝组织浸入预冷的生理盐水,洗去血污,用滤 纸吸干。称取0.5g肝组织,在小烧杯中剪碎,用预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液洗涤数次。将烧杯中的悬浮肝组 织倒入匀浆管中进行匀浆,匀浆过程要在冰浴中进行。 匀浆完毕,移入1.5ml离心管中。
细胞器分离过程中的悬浮介质常使用水溶性的 蔗糖溶液，因为它比较接近细胞质的分散相， 在一定程度上，能保持细胞器的结构和功能， 保持酶的活性，避免细胞器的聚集。
沉淀
转速x时间
A 150g x 20min
B 1000g x 20min
C 3000g x 6min
D 10000g x20min
E 105000g x120min
（2）离心：低温离心机中进行。 每次离心前 一定要在天平（托盘天平）上将两离心管配平。 第一次以600g离心10min。将其上清夜移入 Eppendorf管中，盖好盖子置于冰浴中，留待 后面使用(分离线粒体)。沉淀使用1ml预冷的 0.25mol/L蔗糖溶液离心洗涤2次，每次 1000g离心10min。
r为离心机中轴到离心管远端
的距离
n为离心机每分钟的转速
（r/min）
1000g=9.8牛（N）
离心技术类型
离心技术可用于细胞器的分离。
离心技术一般包括：差速离心和密度梯度离 心
线粒体的分离
实验三线粒体的分离、超活染色与观察一、实验目的1、学习差速离心法分离动、植物线粒体技术。
2、观察动、植物活细胞内线粒体的形态、数量与分布。
3、学习细胞器的超活染色技术。
二、实验原理利用沉降系数不同的颗粒，在一定介质中沉降速度的差异，采取分级差速离心的方法，将线粒体从细胞悬液中逐级分离出来。
离心用的悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无毒害的一种染色方法。
它的目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡，可用来研究生活状态下的细胞形态、结构和生理、病理状态。
体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以活体染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。
詹纳斯绿B（Janus green B）和中性红（neutral red）两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体的染色各有专一性。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B（Janus green B）是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
三、实验材料与方法1、材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏、玉米黄化幼苗（水稻、高粱等幼苗均可）、洋葱鳞茎内表皮细胞。
2、主要试剂和仪器：Ringer 溶液，10%、1/3000中性红溶液，1%、1/5000詹纳斯绿B 溶液；分离介质：0.25mol/L蔗糖、50mmol/L的Tris-盐酸缓冲液（pH7.4），3mmol/L EDTA，0.75mg/ml牛血清白蛋白（BSA），50mmol/L的Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，0.3mol/L 甘露醇（pH7.4）、20%次氯酸钠（NaClO）溶液、1%詹纳斯绿B染液，生理盐水，0.25mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，0.34mol/L蔗糖＋0.01mol/L Tris-盐酸缓冲液(pH7.4)，固定液，姬姆萨染液，1/15mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.8）。
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常用介质(高溶解性的惰性物质): 氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖
密度梯度离心 （Density-gradient centrifugation）
• 当颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下， 颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形 成区带的方法。 • 两种浓度的蔗糖溶液制成的梯度，离心时，线粒体和 比它沉降系数小的细胞组分聚集到梯度交界处，而沉 降系数较大的细胞组分沉到离心管底部。
Supernatant
(上清液)
Pellet
(颗粒团)
沉降顺序：细胞核—线粒体,溶酶体与过氧化物酶体—内质网与高尔基体—核糖体。
差速离心法 (Differential centrifugation)
优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清液与沉淀 分开，并可使用容量较大的角式转子。
缺点：①分离效果差，不能一次得到纯颗粒；须经反复 悬浮和离心加以纯化； ②壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离 心管一侧会出现沉淀； ③颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变 形、聚集而失活。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 2nd Step: Density-gradient centrifugation
三、实验材料及用品：
器具：高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、组织捣碎机，培养 皿，离心管
2700/12800rpm
1500/21000rpm （五楼实验室）
试剂：生理盐水、 1. 0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液、 2. 0.34mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 3. 0.25mol/L蔗糖+0.01mol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)、 4.1.0 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4) +1mmol/L EDTA，pH 7.5. 5.1.5 mol/L 蔗糖+10 mmol/L Tris-HCl ( pH 7.4)
2.高速组织捣碎机法
3.超声波处理法 4.化学裂解法 5.反复冻融法
细胞破碎的注意事项： 1、匀浆介质：常用介质是缓冲的蔗糖水溶液
（0.25mol/L ）。它比较接近细胞质的分散相，具有
足够渗透压，防止颗粒膨胀破裂，对酶活性干扰小， 在pH7.2-7.4的条件下细胞器不易发生聚集。
2、尽可能在低温条件下进行，避免酶失活。
(4)将肝组织捣碎液分装在50ml离心管中， 1500rpm 4 °下
（位于五楼的实验室）离心 2min (去除大组织块）
注意事项：
尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，
整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 细胞核与线粒体的分离（两人一组）：
⑴ 先将0.5mL 0.34mol/L蔗糖缓冲液放入1.5ml离心管，然后沿 管壁小心地加入0.5mL肝组织匀浆使其覆盖于上层。 2700rpm 4 °下离心10min，沉淀为粗提的细胞核。
⑵ 将上清缓缓取出转入另一个离心管中，沉淀用1mL预冷的 0.25mol/L蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，离心管中 的沉淀为细胞核与部分细胞碎片。
差速离心分离线粒体（一位同学完成）
⑶ 将上一步得到的上清液12800rpm离心10min，沉淀即为粗提 的线粒体。（如果沉淀足够多，也可以用1mL预冷的0.25mol/L 蔗糖缓冲溶液洗1次 (2700rpm离心10min)，获得线粒体） 密度梯度离心分离线粒体（一位同学完成） (4) 去一支1.5ml离心管，先加入0.4ml 1.5 mol/L 的蔗糖溶液， 然后小心地在 1.5 mol/L 的蔗糖溶液上加0.4ml 1.0 mol/L 的蔗 糖溶液，随后将(2)中获得的上清液0.5ml轻轻地加在蔗糖溶液 上，60000 g（21000 r/min左右，五楼实验室）离心 20 分钟。 线粒体会在 1 mol/L 和 1.5 mol/L 蔗糖界面处形成一薄层。
+1mmol/L EDTA，pH 7.5
6. 固定液【甲醇-冰乙酸(9:1)】、姬姆萨染液(Giemsa) 7. 1%詹纳斯绿B染液(Janus Green染液)。 材料：动物肝脏(蛙肝)。
四、实验方法与步骤： 1. 动物肝细胞匀浆制备： ⑴ 取出肝脏（2g左右），先用清水冲洗干净后，放在置于 冰块上的培养皿中用剪刀剪成小块，去除结缔组织，用生理盐 水反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表面的液体。 ⑵ 加入10mL预冷的0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液 ⑶将悬浮的肝组织液倒入组织捣碎机中进行捣碎，直至没有 可见的组织块为止。
差速离心法 (Differential centrifugation)
根据颗粒大小和密度的不同存在的沉降速度差别， 分级增加离心力，从试样中依次分离出不同组分的方 法。从低速到高速逐级沉淀分离，一般用于分离沉降 系数相差较大（10倍及以上）的颗粒。
9.4 Isolation and Characterization of Cell Organelles (细胞器) Centrifugation can separate many types of oganelles from cell homogenate, 1st Step: Differential centrifugation
实验十二、细胞核与线粒体的分级分离
(差速离心法与密度梯度离心)
一、实验目的： 1. 初步了解细胞内各种成分的分离方法； 2、掌握差速离心方法细胞核和线粒体的分离方法； 3、对分离得到的细胞核及线粒体进行活性鉴定。
二、实验原理
细胞器分离基本步骤 细胞破碎 分离、纯化 细胞器鉴定
Hale Waihona Puke （一）细胞破碎的方法 1.杆状玻璃匀浆器法
3、若是采用低渗方式破碎细胞，匀浆物在低渗溶液中
的时间要越短越好，通常从开始收获细胞到匀浆结束
不要超过5分钟。否则匀浆物在低渗溶液中时间太长， 导致细胞器破裂，溶酶体酶泄漏，各种物质降解。
二、实验原理
（二）分离纯化的方法 根据细胞器的大小、形状、密度等物理特性差异，离心 成为亚细胞组分分离过程中最广泛应用的技术。 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮 力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 主要包括差速离心、密度梯度离心等方法。