高效液相色谱法测定贯叶金丝桃中金丝桃素和伪金丝桃素的含量_毛红胜
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国内生产贯叶金丝桃提取物的厂家普遍采用紫 外分光光度(UV)法测定总 金丝桃素(金丝桃 素和 伪金丝桃素之和), 其缺点是不能分别测定两个活性 成分 , 且由于市场上的标准贯叶金丝桃提取物的总 金丝桃素的质量百分含量仅要求大于等于 0 .3 %, 使用该方法相对干扰太大 , 本文通过摸索最佳色谱 条件 , 建立了简便 、快速 、准确且不受其他成分干扰 的 H PLC 法 , 适用于 生产厂家原料 质量控制 、生产 中间体质量控制和产品出口质量控制 。 1 仪器及试剂
2 .7 精密度实验 精确制备 0 .012 、0 .018 、0 .024 g/ L 的金丝桃素 、伪金丝桃素对照品溶液 , 按实验方 法日内测定 5 次 , 求得金丝桃素 、伪金丝桃素的日内 RSD 分别为 0 .95 %和 0 .68 %。 同法 , 日间(5 d)测 定 5 次 , 求得金丝桃素 、伪金丝桃素的日间 RSD 分 别为 2 .55 %和 1 .68 %。
· 3 14 · 山西医科大学学报 (J Shanxi M ed Univ)2001 年 8 月 , 32 (4)
坐标数据进行线形回归 , 结果表明 , 在0 .06 ～ 0.3 μg 进样范围内金丝桃素和伪金丝桃素线形关系良好 , 见表 1 。
表 1 线形关系测定 结果
Determination of hypericin and pseudohypericin in Hypericum perf oratum by HPLC M AO Hong-sheng , JIANG Yong-hong (Dept of Shanx i Medical University , Taiy uan 030001 , China) Abstract : Objective To establish a practical method fo r determining the hy pericin and pseudohypericin in hy pericum per foratum . Method By RP -HP LC ,[ column, Hy persil C18(150 mm ×4 .6 mm , 5 μm);mobile phase , phosphate buffer solution-methanol (35∶ 65 , pH 6.0);flow rate , 0.8 ml/ min ;waveleng th, 590 nm] , quantity was calculated based on the external standards of hy pericin and pseudo hypericin.Results T he linear relationship of calibration curves w as good in the rang e of 0.06 ～ 0.3 μg fo r both hypericin and pseudo hypericin, (r >0.999).T he recoveries of hypericin and pseudohypericin were 98.6%(RSD =0 .81%, n =5)and 97.9%(RSD =1.02%, n =5)respectively .Conclusion T he method is simple, rapid, accurate and can be applied to quality control for the to tal producing process of S T .John' s Wo rt ex tract . Key words: chromatog raphy , hig h pressure liquid ; plants , medicinal ; Hy pericum perforatum ; hypericin ; pseudohypericin
实验室)
摘要 : 目的 建立贯叶金丝桃提取物及其原料中金丝 桃素和伪金丝桃素的含 量测定方法 。 方法 高效 液相色谱 法 , 其色 谱 条件是 :Hypersil C18 柱(150 mm ×4 .6 mm , 5 μm);流动相为磷酸盐缓冲溶液 -甲醇(35∶65, pH 6.0);流速为 0.8 ml/ min ;检 测 波长为 590 nm , 用外标法计算 。 结果 在 0 .06～ 0 .3 μg 范围内金丝 桃素和 伪金丝 桃素都呈 线形关 系(r >0.999), 金丝桃 素 和伪金丝桃素的回收率分别是 98 .6 %(RSD =0 .81 %, n =5)和 97 .9 %(RSD =1.02 %, n =5)。 结论 建立的含 量测定方法可 用于贯叶金丝桃提取物整个生产过程中的质量控制 。 关键词 : 色谱法 , 高压液相 ; 植物 , 药用 ; 贯叶金丝桃 ; 金丝桃素 ; 伪金丝桃素 中图分类号 : Q 657.7+2 文献标识码 : A
标准品溶液 进行程 序扫描 , 发现 金丝桃 素在 230 、 284 、388 、590 nm 处都有最大吸收 。 取一贯叶金丝 桃提取物样品溶液分别在各最大吸收波长处进样检
测 , 发现在小于 400 nm 的条件下谱图色谱 峰多达 20 来种 , 并且金丝桃素和伪金丝桃素的峰面积响应 值相对于杂质的峰面积 响应值太小 , 所以干扰大 。
99.0 97.6
3 讨论
本文采用可见光区的 590 nm 作为 HP LC 检测 波长是避免过多干扰杂峰的关键 , 而使用磷酸盐缓 冲液避免了峰拖尾 , 大大改善了峰形 。 读者还可通 过使用二相淋洗(A 相 :本文流动相 , B 相 :甲醇)来 缩短金丝桃素和伪金丝桃素的保留时间差 。
组分
回归方程
rn
金丝桃素 伪金丝桃素
Y =2 .090 ×106 X +8 .095 ×103 0 .999 6 5 Y =2 .250 ×106 X +1 .324 ×104 0 .999 4 5
准确吸取 0 .002 g/ L 的金线桃素和伪金丝桃素 标准溶液 , 进样 10 μl , 可得到相应的标准品峰面积 响应值以及噪声的峰面积响应值 。根据 S =2N 计 算得出最小检出限分别为 2 .4 ng百度文库和 2 .8 ng 。 2 .4 检测波长的确定 用 SPD -10 A 对金丝桃素
表 2 贯叶金丝 桃提 取物中 总金 丝桃素 质量 百分 含量 的
检测结果 (%)
样品 来源
n 伪金 丝桃素
金 丝桃素
总金丝桃 素
RSD
样品 1(DEYE 公司)
5
0 .1 97
0 .131
0 .328
1 .2 2
样品 1(GMA 公司)
5
0 .2 40
0 .103
0 .343
1 .0 8
990106(利富康公 司)
贯叶 金丝桃(Hypericum perf orat um )俗名 为 S T .John' s Wort , 简 称 SJW , 主 要 用 于治 疗 抑 郁 症[ 1 , 2] , 其活性成分金丝桃素和伪金丝桃素 具有抗 逆转录病毒的作用 , 对 H IV 具抑制活性的报道 , 近 年来国外已完成抗艾滋病的 Ⅱ期临床 , 恶性神经胶 质瘤的临床研究也正在进行中 。贯叶金丝桃具有的 多种药理作用 , 使其成为当前国际研究开发热点课 题之一 , 贯叶金丝桃是美国草药药典(AHP)中已收 入的有限几种草药之一 , 作为食品添加剂 , 贯叶金丝 桃提取物在美国市场份额的排名由 1996 年的 20 位 之外到 1997 年的第 5 、1998 年的第 2 。
5
0 .2 04
0 .148
0 .352
1 .1 8
2 .8 加样回收率的测定 精确称量贯叶金丝桃提 取物 40 m g , 置于 25 m l 量瓶中 , 精确吸取金丝桃素 、
伪金丝桃素对照品溶液(均为 0 .03 g/ L)各 1 .0 ml , 按样品预处理方法和测定方法进行检测 , 重复 5 次 , 结果见表 3 。
表 3 回收率测定表(P 伪金丝桃素 , H 金丝桃素)
组分
本底值(μg) 添加量(μg) 测定 值(μg) 回 收率(%) 平均 回收率(%) RSD(%)
H
52 .4
31 .4 83 .4 98.7
41 .2
31 .4 71 .9 96.8
52 .2
31 .4 82 .8 97.5
97 .9
山西医科大学 学报 (J Shanxi M ed U niv)2001 年 8 月 , 32 (4) · 3 1 3 ·
文章编号 : 1007 -6611(2001)04 -0313-02
高效液相色谱法测定贯叶金丝桃中金丝桃素和伪金丝桃素的含量
毛红胜1 , 蒋永红2 (1 山西医科大学基础医学院化学教研室 , 太原 030001 ; 2 中国日用化学工业研究 所表面活性 剂
图 1 金丝桃素和伪金丝桃素的化学结构图
从化学结构分析 , 金丝桃素和伪金丝桃素有较 多的羟基 , 呈弱酸性 , 样品应在中性或弱酸性条件下 检测 。 分别把流动相配成 HAC/H2O/ MeOH(1∶35∶ 65)、磷酸盐缓冲溶液 —甲醇(35∶65 , pH 6.0)、H2O/ M eOH(35∶65)。 结果只有磷酸盐缓 冲溶液 —甲醇 流动相的峰形良好 , 其他两者都有不同程度的拖尾 。 2 .6 几种样品的检测结果 准确吸取贯叶金丝桃 提取物样品溶液 10 μl , 进样 , 根据金丝桃素和伪金 丝桃素的峰面积用外标法计算质量百分含量 , 结果 见表 2 。
1 .02
40 .9
31 .4 71 .4 97.2
52 .2
31 .4 83 .3 99.1
P
78 .8
32 .0 110 .5 99.1
96 .8
32 .0 128 .1 97.8
98 .6
0 .81
82 .3
32 .0 113 .6 97.9
94 .5 83 .7
32 .0 32 .0
126 .2 114 .9
SHIMADZULC -10A 高效液相色谱仪(日本岛
津), 十万分之一电子天平 , 超声波清洗器 , 0 .45 μm 微孔过滤器 。
金丝桃素和伪金 丝桃素标准品(Sigma 公司), 无水甲醇(色谱纯), 水为重蒸水 , 其他试剂均为分析 纯 。贯叶金丝桃提取物样品分别来自日本荻野 (DEYE)公司上海贸易公司 , Global M arket ing Associates , INC(美国)和徐州利富康生物制品公司 。 2 方法与结果 2 .1 色谱条件 色谱柱 Hypersil C18柱(150 m m ×4 .6 mm , 5 μm);流动相 :磷酸盐缓冲溶液 -甲醇 (35∶65 , pH 6.0);流速 :0.8 ml/ min ;检测波长 :590 nm 。 2 .2 样品预处理 取各种贯叶金丝桃提取物样品 75 .0 m g , 用流动相溶解 , 在超声波清洗器中震动 5 min , 然后转移至 25 ml 容量瓶并定容 , 滤纸过滤 , 吸 取 1 ml 滤液用甲醇定容成 25 ml , 准备进样 。 2 .3 线性关系及最小检测限的测定 准确称量金 丝桃素和伪金丝桃素标准品各 3 .0 mg , 用甲醇定容 成 10 ml , 分别吸取上述溶液 0 .5 、1 .0 、1 .5 、2 .0 、2 .5 ml 定容成 25 ml , 系列标准品溶液的质量浓度分别 为 0 .006 、0 .012 、0 .018 、0 .024 和 0 .030 g/ L 。分别 进样 10 μl , 所得的峰面积 Y 对样品质量浓度 X 的
而在 590 nm 下 , 基线平稳 , 杂质峰很少 , 金 丝桃素
和伪金丝桃素的峰 面积响应值相 对大 。 所以 确定
590 nm 为检测波长 。 2 .5 流动相 pH 值的确定 金丝桃素和伪金丝桃 素的化学结构如下 :
金丝 桃素 hypericin R =H;伪金 丝桃 素 pseudohy pericin R = O H;M e =CH3
2 .7 精密度实验 精确制备 0 .012 、0 .018 、0 .024 g/ L 的金丝桃素 、伪金丝桃素对照品溶液 , 按实验方 法日内测定 5 次 , 求得金丝桃素 、伪金丝桃素的日内 RSD 分别为 0 .95 %和 0 .68 %。 同法 , 日间(5 d)测 定 5 次 , 求得金丝桃素 、伪金丝桃素的日间 RSD 分 别为 2 .55 %和 1 .68 %。
· 3 14 · 山西医科大学学报 (J Shanxi M ed Univ)2001 年 8 月 , 32 (4)
坐标数据进行线形回归 , 结果表明 , 在0 .06 ～ 0.3 μg 进样范围内金丝桃素和伪金丝桃素线形关系良好 , 见表 1 。
表 1 线形关系测定 结果
Determination of hypericin and pseudohypericin in Hypericum perf oratum by HPLC M AO Hong-sheng , JIANG Yong-hong (Dept of Shanx i Medical University , Taiy uan 030001 , China) Abstract : Objective To establish a practical method fo r determining the hy pericin and pseudohypericin in hy pericum per foratum . Method By RP -HP LC ,[ column, Hy persil C18(150 mm ×4 .6 mm , 5 μm);mobile phase , phosphate buffer solution-methanol (35∶ 65 , pH 6.0);flow rate , 0.8 ml/ min ;waveleng th, 590 nm] , quantity was calculated based on the external standards of hy pericin and pseudo hypericin.Results T he linear relationship of calibration curves w as good in the rang e of 0.06 ～ 0.3 μg fo r both hypericin and pseudo hypericin, (r >0.999).T he recoveries of hypericin and pseudohypericin were 98.6%(RSD =0 .81%, n =5)and 97.9%(RSD =1.02%, n =5)respectively .Conclusion T he method is simple, rapid, accurate and can be applied to quality control for the to tal producing process of S T .John' s Wo rt ex tract . Key words: chromatog raphy , hig h pressure liquid ; plants , medicinal ; Hy pericum perforatum ; hypericin ; pseudohypericin
实验室)
摘要 : 目的 建立贯叶金丝桃提取物及其原料中金丝 桃素和伪金丝桃素的含 量测定方法 。 方法 高效 液相色谱 法 , 其色 谱 条件是 :Hypersil C18 柱(150 mm ×4 .6 mm , 5 μm);流动相为磷酸盐缓冲溶液 -甲醇(35∶65, pH 6.0);流速为 0.8 ml/ min ;检 测 波长为 590 nm , 用外标法计算 。 结果 在 0 .06～ 0 .3 μg 范围内金丝 桃素和 伪金丝 桃素都呈 线形关 系(r >0.999), 金丝桃 素 和伪金丝桃素的回收率分别是 98 .6 %(RSD =0 .81 %, n =5)和 97 .9 %(RSD =1.02 %, n =5)。 结论 建立的含 量测定方法可 用于贯叶金丝桃提取物整个生产过程中的质量控制 。 关键词 : 色谱法 , 高压液相 ; 植物 , 药用 ; 贯叶金丝桃 ; 金丝桃素 ; 伪金丝桃素 中图分类号 : Q 657.7+2 文献标识码 : A
标准品溶液 进行程 序扫描 , 发现 金丝桃 素在 230 、 284 、388 、590 nm 处都有最大吸收 。 取一贯叶金丝 桃提取物样品溶液分别在各最大吸收波长处进样检
测 , 发现在小于 400 nm 的条件下谱图色谱 峰多达 20 来种 , 并且金丝桃素和伪金丝桃素的峰面积响应 值相对于杂质的峰面积 响应值太小 , 所以干扰大 。
99.0 97.6
3 讨论
本文采用可见光区的 590 nm 作为 HP LC 检测 波长是避免过多干扰杂峰的关键 , 而使用磷酸盐缓 冲液避免了峰拖尾 , 大大改善了峰形 。 读者还可通 过使用二相淋洗(A 相 :本文流动相 , B 相 :甲醇)来 缩短金丝桃素和伪金丝桃素的保留时间差 。
组分
回归方程
rn
金丝桃素 伪金丝桃素
Y =2 .090 ×106 X +8 .095 ×103 0 .999 6 5 Y =2 .250 ×106 X +1 .324 ×104 0 .999 4 5
准确吸取 0 .002 g/ L 的金线桃素和伪金丝桃素 标准溶液 , 进样 10 μl , 可得到相应的标准品峰面积 响应值以及噪声的峰面积响应值 。根据 S =2N 计 算得出最小检出限分别为 2 .4 ng百度文库和 2 .8 ng 。 2 .4 检测波长的确定 用 SPD -10 A 对金丝桃素
表 2 贯叶金丝 桃提 取物中 总金 丝桃素 质量 百分 含量 的
检测结果 (%)
样品 来源
n 伪金 丝桃素
金 丝桃素
总金丝桃 素
RSD
样品 1(DEYE 公司)
5
0 .1 97
0 .131
0 .328
1 .2 2
样品 1(GMA 公司)
5
0 .2 40
0 .103
0 .343
1 .0 8
990106(利富康公 司)
贯叶 金丝桃(Hypericum perf orat um )俗名 为 S T .John' s Wort , 简 称 SJW , 主 要 用 于治 疗 抑 郁 症[ 1 , 2] , 其活性成分金丝桃素和伪金丝桃素 具有抗 逆转录病毒的作用 , 对 H IV 具抑制活性的报道 , 近 年来国外已完成抗艾滋病的 Ⅱ期临床 , 恶性神经胶 质瘤的临床研究也正在进行中 。贯叶金丝桃具有的 多种药理作用 , 使其成为当前国际研究开发热点课 题之一 , 贯叶金丝桃是美国草药药典(AHP)中已收 入的有限几种草药之一 , 作为食品添加剂 , 贯叶金丝 桃提取物在美国市场份额的排名由 1996 年的 20 位 之外到 1997 年的第 5 、1998 年的第 2 。
5
0 .2 04
0 .148
0 .352
1 .1 8
2 .8 加样回收率的测定 精确称量贯叶金丝桃提 取物 40 m g , 置于 25 m l 量瓶中 , 精确吸取金丝桃素 、
伪金丝桃素对照品溶液(均为 0 .03 g/ L)各 1 .0 ml , 按样品预处理方法和测定方法进行检测 , 重复 5 次 , 结果见表 3 。
表 3 回收率测定表(P 伪金丝桃素 , H 金丝桃素)
组分
本底值(μg) 添加量(μg) 测定 值(μg) 回 收率(%) 平均 回收率(%) RSD(%)
H
52 .4
31 .4 83 .4 98.7
41 .2
31 .4 71 .9 96.8
52 .2
31 .4 82 .8 97.5
97 .9
山西医科大学 学报 (J Shanxi M ed U niv)2001 年 8 月 , 32 (4) · 3 1 3 ·
文章编号 : 1007 -6611(2001)04 -0313-02
高效液相色谱法测定贯叶金丝桃中金丝桃素和伪金丝桃素的含量
毛红胜1 , 蒋永红2 (1 山西医科大学基础医学院化学教研室 , 太原 030001 ; 2 中国日用化学工业研究 所表面活性 剂
图 1 金丝桃素和伪金丝桃素的化学结构图
从化学结构分析 , 金丝桃素和伪金丝桃素有较 多的羟基 , 呈弱酸性 , 样品应在中性或弱酸性条件下 检测 。 分别把流动相配成 HAC/H2O/ MeOH(1∶35∶ 65)、磷酸盐缓冲溶液 —甲醇(35∶65 , pH 6.0)、H2O/ M eOH(35∶65)。 结果只有磷酸盐缓 冲溶液 —甲醇 流动相的峰形良好 , 其他两者都有不同程度的拖尾 。 2 .6 几种样品的检测结果 准确吸取贯叶金丝桃 提取物样品溶液 10 μl , 进样 , 根据金丝桃素和伪金 丝桃素的峰面积用外标法计算质量百分含量 , 结果 见表 2 。
1 .02
40 .9
31 .4 71 .4 97.2
52 .2
31 .4 83 .3 99.1
P
78 .8
32 .0 110 .5 99.1
96 .8
32 .0 128 .1 97.8
98 .6
0 .81
82 .3
32 .0 113 .6 97.9
94 .5 83 .7
32 .0 32 .0
126 .2 114 .9
SHIMADZULC -10A 高效液相色谱仪(日本岛
津), 十万分之一电子天平 , 超声波清洗器 , 0 .45 μm 微孔过滤器 。
金丝桃素和伪金 丝桃素标准品(Sigma 公司), 无水甲醇(色谱纯), 水为重蒸水 , 其他试剂均为分析 纯 。贯叶金丝桃提取物样品分别来自日本荻野 (DEYE)公司上海贸易公司 , Global M arket ing Associates , INC(美国)和徐州利富康生物制品公司 。 2 方法与结果 2 .1 色谱条件 色谱柱 Hypersil C18柱(150 m m ×4 .6 mm , 5 μm);流动相 :磷酸盐缓冲溶液 -甲醇 (35∶65 , pH 6.0);流速 :0.8 ml/ min ;检测波长 :590 nm 。 2 .2 样品预处理 取各种贯叶金丝桃提取物样品 75 .0 m g , 用流动相溶解 , 在超声波清洗器中震动 5 min , 然后转移至 25 ml 容量瓶并定容 , 滤纸过滤 , 吸 取 1 ml 滤液用甲醇定容成 25 ml , 准备进样 。 2 .3 线性关系及最小检测限的测定 准确称量金 丝桃素和伪金丝桃素标准品各 3 .0 mg , 用甲醇定容 成 10 ml , 分别吸取上述溶液 0 .5 、1 .0 、1 .5 、2 .0 、2 .5 ml 定容成 25 ml , 系列标准品溶液的质量浓度分别 为 0 .006 、0 .012 、0 .018 、0 .024 和 0 .030 g/ L 。分别 进样 10 μl , 所得的峰面积 Y 对样品质量浓度 X 的
而在 590 nm 下 , 基线平稳 , 杂质峰很少 , 金 丝桃素
和伪金丝桃素的峰 面积响应值相 对大 。 所以 确定
590 nm 为检测波长 。 2 .5 流动相 pH 值的确定 金丝桃素和伪金丝桃 素的化学结构如下 :
金丝 桃素 hypericin R =H;伪金 丝桃 素 pseudohy pericin R = O H;M e =CH3