酶组织化学总论---
组织化学技术酶组化
五 、DAB法 显示过氧化物酶
〔原理〕 过氧化物酶分解H2O2的过程中，
下面反应不直接发生：AH2（供氢体） +H2O2→A（供氢体的氧化物）+2H2O2实验 可知，有称为复合物 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、的酶— —底物（受氢体）复合体生成，在复合体 最后分解为酶和水时，游离的原子氧使供 氢体氧化而显色。酶组织化学中所使用的 供氢体应是含有色原性基团的发色物质， 如奈酚和联苯胺。
2019/3/3
2．后偶联法Post-coupling（ACP） 3．合成法 4．底物膜法 设计半透膜 切片/ 孵育法 ★★★ 影响酶组化实验的关键因素 ① 酶活性的保存 a）固定：酶组化的固定剂有教严格的限制，不 同的酶适用不同的固定剂 △ 抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金 属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂。 △慎用醛
a．预孵液：室温下10～30分钟 b．后孵液： Fahimi孵育液，室温5～60分钟 Gropam--Karnovsky液，室温，3~10分钟 ② 洗涤：蒸馏水漂洗 ③ 染核：亚甲蓝染核 ④ 封固：甘油明胶封固
▲ 髓性过氧化物酶显示法。
① 固定与切片：用冷的2.5％戊二醛固定30～ 60分钟，然后用Cryostat制成20微米切片。
⑨ 对照：必须设立对照，以防非特异反应。 这对结果的解释非常重要。 ★★★ 对结果的分析，应考虑如下几个问题： ① 经过冻结或固定后组织细胞破坏，酶究竟 能保留多少？ ② 酶是否在原位？ ③ 反应中多少酶起了作用？ ④ 酶的活性是否代表细胞生活时的活性？ ⑤ 沉淀的产物是否代表酶蛋白分子，时间延 长，会不会改变？ 5 ⑥ 是否有扩散移位
［对照］用抑制剂NaF浓度为10mmol/L
Ca2+ 浓度为10mmol/L
［注意事项］
生物化学之酶ppt课件
与酶活性中心以外的部位结合，改变酶的空间构象，使酶活性降低或 丧失，如磺胺类药物对二氢叶酸合成酶的抑制。
酶抑制剂的应用
医学领域
用于治疗疾病，如酶抑制剂作为抗病毒药 物、抗肿瘤药物和抗菌药物等。
生物工程领域
用于改造和优化生物催化剂的性能，提高 生物催化过程的效率和选择性。
农业领域
用于研发新型农药和除草剂，提高农作物 产量和品质。
来调节细胞内酶的含量。
酶抑制剂的分类与作用
不可逆抑制剂
与酶共价结合，使酶永久失活，如有机磷农药对乙酰胆碱酯酶的抑制 。
可逆抑制剂
与酶非共价结合，可通过物理或化学方法去除抑制剂而恢复酶活性， 包括竞争性抑制剂、非竞争性抑制剂和反竞争性抑制剂。
竞争性抑制剂
与底物竞争酶的活性中心，降低酶对底物的亲和力，如丙二酸对琥珀 酸脱氢酶的抑制。
环境领域
用于治理环境污染，如利用酶抑制剂降解 有毒有害物质。
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酶在生物体内的代谢
酶与生物氧化
酶催化生物氧化反应
生物氧化是在生物体内进行的氧化反 应，酶作为生物催化剂能够加速这些 反应的进行。
酶与抗氧化系统
生物体内存在抗氧化系统以抵抗氧化 应激，酶如超氧化物歧化酶（SOD） 等在此系统中发挥重要作用。
酶的结构与功能
结构
酶分子通常具有复杂的四级结构，包括一级结构（氨基酸序列）、二级结构（ α-螺旋、β-折叠等）、三级结构（整体折叠形态）和四级结构（亚基组成）。
功能
酶通过降低化学反应的活化能来加速反应速率，具有高效性、专一性和可调节 性等特点。此外，酶还能参与信号传导、物质运输和能量转换等生物过程。
酶抑制剂筛选方法
基于活性的筛选
酶免疫组织化学染色技术 -回复
酶免疫组织化学染色技术-回复酶免疫组织化学染色技术（Enzyme ImmunoHistoChemistry, E-IHC）是一种常用于组织学研究和病理诊断的方法。
该技术基于免疫学原理，采用酶标标记抗体和细胞色素底物，通过酶的催化作用来检测组织中特定抗原的分布和表达水平。
本文将一步一步回答与酶免疫组织化学染色技术相关的问题。
第一步：样本处理样本处理是酶免疫组织化学染色技术的重要步骤，它的目的是保持组织结构和细胞膜完整性，同时保留目标抗原的免疫原性。
1. 固定化：将组织样本进行固定化处理有助于保持细胞和组织的形态学结构。
最常用的固定剂包括甲醛和乙醇。
甲醛能够形成甲醛-蛋白质交联，从而固定并保持组织中的抗原。
乙醇可以用于去除水分和酮糖，提高抗体的渗透性。
2. 残胶和抗原修复：许多抗原在标本固定过程中会损失其免疫原性，需要进行抗原修复。
常用的修复方法包括热处理、酶消化和酸碱处理等。
热处理通常使用高温蒸煮或压力加热，可使蛋白质水平解离，恢复抗原性。
酸碱处理则通过改变组织的PH值，使抗原解离。
第二步：抗体选择抗体是酶免疫组织化学染色技术的核心。
选择合适的抗体对于获得可靠的结果至关重要。
1. 一抗和二抗：酶免疫组织化学染色一般采用间接法。
首先，使用一抗与目标抗原特异性结合。
随后，使用标记有酶的二抗来识别和结合一抗，从而可视化目标抗原。
常用的二抗有辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AP）。
2. 选择合适的抗体：选择抗体需要考虑目标抗原的特异性和抗体的亲和性。
在选择抗体时，可以参考文献报道、试剂公司提供的抗体说明书和其他研究人员的建议。
第三步：酶标标记酶标标记是酶免疫组织化学染色技术的另一个关键步骤。
酶标标记抗体在靶抗原区域内催化底物，从而产生特定的染色反应。
1. 酶标物质的选择：常用的酶标物质有HRP和AP。
HRPHRP常用于DAB法（diaminobenzidine）和AEC法（aminoethyl carbazole）等反应体系中，可产生棕色至棕黑色反应。
酶组织化学刘学光PPT课件
（3）底物自身显示法 可溶有色底物 → 不溶有色底物 底物分子重组
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(1) 金属离子沉积法 — 酸性磷酸酶 Gomori反应（1941年）
5. 酶显示方法 （1）同步显示法 （2）二步显示法（孵育后偶联法） （3）底物自身显示法
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6. 酶特异性对照实验
• 用酶活性抑制剂 • 激活剂 • 采用无底物的孵育液 • 过固定或加热 • 改变孵育液 • 选择PH值 • 细胞内的定位差异
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对结果分析要考虑的问题
染色前的预固定 — 保持组织良好形态 丙酮:氯仿=1 : 1 4oC，5~10 分钟 多聚甲醛，甲醛，戊二醛
Note: 含有抑制酶活性/细胞化学成分活性的重金属盐Hg/Cr/Pb等 不用做固定剂
固定方法：浸泡固定 灌流固定 细胞涂片、培养细胞: 干燥、密封、低温
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2.切片制作: 一般8－12μm 3.缓冲液：
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（二）酶的定位
在细胞内或超微结构中存在于特定部位 浆膜 — 5’-核苷酸酶 细胞膜— ATPase 线粒体 ……
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酶组织化学的基本原理
1. 酶促反应 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产 物，即：初反应物(primary reaction product, PRP)。
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主要步骤
1.组织处理：不固定（冷冻切片，新鲜） 固 定（特殊固定剂，低温包埋）
2.孵育 3.显色 4.显微镜下观察
各步骤需要注意的问题：
酶组织化学概论
2、方法：三种 、方法：
和高松（ （1）第一种方法：Gomori和高松（1939） ）第一种方法： 和高松 ）
Fe 置换
E
M
Байду номын сангаас
+
沉着在作 用局部 显色
S
+
酶反应
P1 P2
证明酶反应
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如：证明碱性磷酸酶方法
金属置换 R-PO4Na2+H2O
ALP
Ca2+
R-OH+CaHPO4 沉着
Co2+
CoHPO4
三、光镜酶组织化学证明法 （三）色素形成法（pigment formation method) 这是一组显示酶定位的证明法，它与偶氮色素 这是一组显示酶定位的证明法， 显示酶定位的证明法 法不同，在酶的作用下， 法不同，在酶的作用下，使无色的化学物质在局部 形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法 色素形成法。 形成色素而沉着。这种方法统称色素形成法。 方法 所显示的酶 1、四唑盐法 脱氢酶 2、靛酚蓝法 氧化酶 3、靛兰形成法（靛蓝法） 磷酸酶、酯酶 靛兰形成法（靛蓝法） 磷酸酶、 4、联苯胺色素法 5、黑色素形成法 6、白色色素法 过氧化物酶 DOPA-氧化酶、酪氨酸酶 氧化酶、 氧化酶 22 过氧化氢酶
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3、金属 金属盐法的优缺点 、金属-金属盐法的优缺点
（1）优点： ）优点： ①底物、捕捉剂价格便宜。 底物、捕捉剂价格便宜。 金属离子容易反应， ②金属离子容易反应， 沉着颗粒微细， 沉着颗粒微细，反应色调 鲜明，反差比较明显。 鲜明，反差比较明显。 缺点： （2）缺点： ①易退色。 易退色。 组织细胞中有些成分可吸附金属离子， ②组织细胞中有些成分可吸附金属离子，产生 假阳性反应。 假阳性反应。
酶组织化学技术
第二章酶组织化学技术酶（enzyme）是生物体内具有催化作用的特殊蛋白质，在细胞的各个部位都有酶的存在。
人和动物体内的各种化学反应（包括新陈代谢反应）都必须由酶来催化，没有酶的存在，体内生物化学反应就无法进行。
组织及细胞中含有多种酶类，主要包括碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、ATP酶、非特异性酯酶、胆碱酯酶、琥珀酸脱氢酶、γ-谷氨酰转肽酶等。
组织细胞内的各种酶均不具有使其本身直接可见性的特性，常需用某些方法在一定条件下将组织细胞中的酶作用于特定的底物，以底物分解产物作为反应物质，在原作用部位进行捕捉反应，从而使其具有可见性。
这种通过酶的作用形成反应产物，经捕捉反应来显示细胞和组织结构中的各种酶，并对其进行定性、定位、定量的方法称为酶组织化学反应。
酶组织化学技术在人类认识疾病的科学实践中曾非常活跃，50~60年代在病理学上的应用达到高峰。
它所涉及的内容相当广泛，如利用酶组织化学方法研究生物体内细胞形态与其代谢、功能的关系；在病理学领域中，研究疾病发生、发展的代谢基础；肿瘤的诊断及鉴别诊断；肿瘤的代谢功能及形态与酶组织化学的变化规律；以多种酶组织化学指标显示细胞损害程度，从而检测新药物及其临床毒性等。
但由于酶组织化学技术操作较复杂，需用新鲜组材料，且多数反应特异性不高，故其应用受到限制。
同时因酶为蛋白质，它在福尔马林固定及石蜡包埋的组织中虽然失去了酶活性，但仍具有免疫原性，这使得应用较为特异的免疫组织化学方法显示酶成为可能，因而不少酶组织化学染色现已被免疫组织化学技术所代替。
但应指出的是，有一些酶组织化学方法仍以其良好的特异性在病理诊断及研究领域被广泛应用。
目前最常应用于诊断的酶组织化学方法有骨骼肌相关酶（用于诊断肌病）、乙酰胆碱酯酶（用于诊断先天性巨结肠）、氯乙酸酯酶（用于辨认骨髓髓细胞系统的细胞和肥大细胞）以及酸性磷酸酶等染色方法。
第一节酶组织化学反应的方法和基本原理一、酶组织化学反应的主要方法和基本原理1．金属沉淀反应法酶的分解产物可与大多数金属结合，金、银、铜、铁、铅、钴及其化合物均具有颜色，因此，在酶反应时使其与金属结合，利用其呈色反应，显示出酶反应的部位，间接地证明某种酶的存在。
酶组织化学
PRP + 捕捉剂
终反应产物（FRP）
PRP弥散： 1. 底物在酶催化下水解的速度 2. PRP在缓冲液中的弥散系数 3. PRP与辅助物反应的速度
➢ 应选择合适的底物和辅助物, 减少弥散 ➢ 捕捉剂的浓度（<1mg/ml）
2. 一般原则 1. 对组织处理,制片过程不能影响酶的活性及分布 2. 所选底物和辅助物必须迅速,同步穿透入组织和细
1. 钙钴法
β-甘油磷酸钠 AKP 磷酸酯 + Ca++ 磷酸钙
Co++
磷酸钴 硫化胺 硫化钴（黑色沉淀）
硝酸钴
酶
酶底物
PRP（磷酸） +某金属
金属置换 显色
与底物混合液 某金属离子结合
2. Gomori 硝酸铅法
β-甘油磷酸钠 ACP 磷酸酯 + 铅
硫化胺
硫化铝（黑色沉淀）
磷酸铅
酶底物 酶
PRP（磷酸） 直接沉着
常用固定剂
1、甲醛： HCHO 40%甲醛溶液的商品名称为福尔 马林，10%福尔马林 多聚甲醛:（HCHO)n，n=8〜100 4%多聚甲醛溶液
2、戊二醛：C3H10(CHO)2 2 〜4%戊二醛溶液
3、乙醇：CH3CH2OH 80%乙醇溶液
方法： 推注，滴注
滴注步骤： 1、开胸 2、暴露心脏 3、自心尖剪开左心室 4、插入灌流针至主动脉弓 5、固定灌流针 6、快速注入冲洗液 7、先快后慢注入固定液 8、慢注毕，取材
（六）各步骤注意问题
3. 切片制作: 切片厚度<40um 4. 缓冲液选择
缓冲液用于 A. 配置固定液 B. 漂洗液 C. 配置酶反应孵育液
选择缓冲液应注意 A.不能减弱目标酶的活性 B.不能含有与捕捉机制相同的物质 C. 注意漂洗用缓冲液的渗透压 D. 漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释
酶组织化学染色诊断-概述说明以及解释1.引言1.1 概述概述：酶组织化学染色是一种用来检测组织中特定酶活性的技术手段。
通过这种方法，可以直观地观察组织中的酶分布和活性水平，从而为疾病的诊断和治疗提供重要的依据。
酶组织化学染色技术已经在医学领域得到广泛应用，例如肿瘤诊断、炎症检测等。
本文将介绍酶组织化学染色的原理、应用和优势，旨在帮助读者更好地了解和运用这一重要的诊断工具。
1.2 文章结构文章结构部分主要是指出本文的组织结构和内容安排。
首先，我们将介绍酶组织化学染色的基本原理，包括染色的方法和操作步骤。
然后，我们将探讨酶组织化学染色在医学诊断中的应用，包括疾病诊断和治疗效果监测等方面。
接着，我们将分析酶组织化学染色相比传统染色方法的优势和不足之处。
最后，我们将总结本文的主要内容，展望酶组织化学染色在未来的发展方向，并提出一些思考和建议。
通过这样的结构，读者可以清晰地了解本文的主要内容和观点，有助于更好地理解和评价酶组织化学染色在临床诊断中的应用。
1.3 目的酶组织化学染色作为一种重要的病理分析技术，在临床诊断、研究和治疗中起着至关重要的作用。
本文旨在深入探讨酶组织化学染色的原理、应用和优势，以帮助读者更好地了解这一技术的价值和意义。
通过系统性的介绍和分析，希望能够为医学和科研工作者提供更丰富的知识和实践经验，从而推动该领域的进一步发展和应用，为疾病的早期诊断和精准治疗提供更有效的支持和指导。
同时，也希望通过本文的阐述，引起更多学者和医生对酶组织化学染色技术的关注和重视，为医学科研领域的进步和人类健康事业的发展作出贡献。
2.正文2.1 酶组织化学染色的原理:酶组织化学染色是一种通过酶的催化作用来检测组织中特定分子的方法。
在这种方法中，首先需要选择适当的酶作为标记物，常用的酶包括过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等。
然后将标记的抗体与待检测的抗原特异结合，形成抗原-抗体复合物。
接着，加入对应的底物，酶会催化底物的化学反应，产生可见的染色产物。
酶的组织化学
靛蓝
（蓝色沉淀）
酶组化的应用
• 了解组织、细胞的代谢活动，并显示病变 所在部位以帮助诊断 • 帮助确定细胞类型 • 细胞定位和作为某些细胞分化标志 • 用于肿瘤的研究及帮助诊断 • 用于免疫组化和原位杂交的显示手段
酶
α- 萘酚磷酸钠+水 ――→磷酸氢二钠+ α萘酚
α-萘酚+坚牢蓝――→偶氮染料沉淀
联苯胺色素法
酶 无色联苯胺 脱 氢 有色联苯胺 联苯胺褐
• 用于检测过氧化物酶 eg：DAB法
四唑盐法
• 底物被氧化酶或脱氢酶作用，使底物氧化并释放 出氢，产生的氢离子被传递给受氢体（无色的四 唑盐），受氢体被还原为有色不溶性沉淀物（双 甲 formazane ） • 用于单胺氧化酶和脱氢酶 • 常用的四唑盐
• 第一反应（酶促反应）
– 细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产 物，即初级反应产物(Primary reaction product, PRP)
• 第二反应（捕捉反应）
– 初级反应产物与辅助物（捕捉剂）经一步或二 步反应，生成有色不溶性的终反应产物(Final reaction product, FRP)
• 作用特点
– 高度催化效率 – 高度专一性（底物特异性）
酶的定位
• • • • 细胞核内：DNA核苷酸转移酶 细胞质内：乳酸脱氢酶 细胞膜内：碱性磷酸酶 细胞器内
– 线粒体：琥珀酸脱氢酶 – 内质网：葡萄糖-6-磷酸酶 – 溶酶体：酸性磷酸酶
酶组织化学基本原理
酶 底物 PRP(无色） 捕捉剂 FRP（有色）
转移酶 Transferases
酶的分类
水解酶 Hydrolases 裂合酶 Lyases
异构酶 Isomerases 合成酶 Ligases
酶组织化学和组织化学染色
第14章酶组织化学和组织化学染色酶酶是由细胞合成的生物催化剂，它们增加整个过程的反应速率，而自身的数量和特性不会改变。
组织化学组织化学被Pearse定义为“用化学或物理的测试方法对细胞和组织中的特定物质、反应基团和酶催化物质进行鉴定、定位和定量的方法”。
因此，采用化学方法技术将组织细胞中的物质进行定位，以用于显微观察的过程就是组织化学技术。
酶组织化学技术酶组织化学技术是将免疫学和分子生物学相结合的一种组织学技术。
组织中酶的表现与其他无活性组织成分完全不同，酶必须是具有活性的。
而且，细胞内酶的表达主要取决于酶在活性位点的特定底物和形成不溶物质，这种不溶物质随后变成有色体或不透明体。
组织必须尽可能新鲜才适合酶的表达，尸检组织/尸体解剖通常不适合用于研究。
经处理不能被用于酶表达的组织要保存在冰箱中。
对于大多数酶来说，它们的表达需要新鲜组织（如细胞培养物）或冷冻/晶体组织和冷冻干燥的组织切片，但是，一些酶如碱性磷酸酶或酸性磷酸酶对底物具有抵抗性，因此它们无法表达。
定影液冰箱冷却丙酮，并用甲醛盐水或95％乙醇作为缓冲剂，在大多数情况下，冷丙酮用于酶的表达。
酶组织化学原理组织化学方法是基于生化反应，含有酶的组织或细胞当置于溶液中时，它们与溶液发生化学反应，产生着色的不溶性产物，然后可以在细胞或组织中评估最终产品的位置和数量。
经典组织化学反应通常遵循以下四个原则之一：*简单离子相互作用。
*醛与希夫试剂或银化合物的反应。
*芳香族重氮盐与芳香族残基的偶联。
*底物和酶的转化形成着色沉淀。
酶的分类*氧化还原酶：它是一个大组，由以下亚组组成：-氧化酶：在氧气存在下催化底物的氧化。
-脱氢酶：通过除去氢原子来催化底物的氧化。
-过氧化物酶：通过除去与过氧化氢结合的氢原子来催化底物氧化。
-Diaphoresis酶：通过除去氢原子来催化NADH和NADPH的氧化。
*水解酶：催化引入水中元素成为特定的底物键。
*转移酶：催化两种化合物基团的转移，但不利用也不损失水分。