分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
分子生物学实验技术全攻略
分子生物学实验技术目录实验一细菌的培养 2实验二质粒DNA的提取 3实验三紫外吸收法测定核酸浓度与纯度 4实验四水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA 5实验五质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 7实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 8实验七聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA 9实验八 RNA提取与纯化 11实验九 RT-PCR扩增目的基因cDNA 13实验十质粒载体和外源DNA的连接反应 15实验十一感受态细胞的制备及转化 16实验十二克隆的筛选和快速鉴定 18实验十三 DNA分析——Southern杂交 19一基本操作实验一、细菌培养实验二、质粒DNA提取实验三、紫外吸收法测定核酸浓度与纯度实验四、水平式琼脂糖凝胶电泳法检测DNA实验五、质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定实验六、植物基因组DNA提取、定量、酶切及电泳分析实验八、植物RNA提取及纯化二、目的基因获取实验七、聚合酶链式反应（PCR）技术体外扩增DNA实验九、RT-PCR扩增目的基因cDNA三、目的基因的克隆和表达实验十、质粒载体和外源DNA的连接反应实验十一、感受态细胞的制备及转化实验十二、克隆的筛选和快速鉴定实验十三、DNA分析——Southern杂交实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
分子生物学实验方法与步骤【可编辑全文】
可编辑修改精选全文完整版分子生物学实验方法与步骤表达蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析一、原理细菌体中含有大量蛋白质，具有不同的电荷和分子量。
强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，通过加热使蛋白质解离，大量的SDS 结合蛋白质，使其带相同密度的负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上，不同蛋白质的迁移率仅取决于分子量。
采用考马斯亮兰快速染色，可及时观察电泳分离效果。
因而根据预计表达蛋白的分子量，可筛选阳性表达的重组体。
二、试剂准备1、30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37O C溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
2、1.5M Tris-HCl(pH 8.0：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
3、1M Tris-HCl(pH 6.8：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
4、10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
5、10电泳缓冲液(pH 8.3：Tris 3.02 g，甘氨酸18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至100ml。
6、10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
7、2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.82.5ml，-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油2.0ml，0.1%溴酚兰1.0ml，ddH2O 3.5ml。
8、考马斯亮兰染色液：考马斯亮兰0.25 g，甲醇225ml，冰醋酸 46ml，ddH2O 225ml。
9、脱色液:甲醇、冰醋酸、ddH2O以3∶1∶6配制而成。
二、操作步骤采用垂直式电泳槽装置（一）聚丙烯酰胺凝胶的配制1、分离胶(10%的配制:ddH2O 4.0ml30%储备胶 3.3ml1.5M Tris-HCl2.5ml10% SDS 0.1ml10% AP 0.1ml取1ml上述混合液,加TEMED(N,N,N’,N’-四甲基乙二胺10μl 封底,余加TEMED4μl ,混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是微生物学中的重要研究内容之一，它主要是通过对菌株的形态、生理生化特性以及分子生物学特征进行综合分析，来确定菌株属于哪一类别。
菌种鉴定的准确性对于微生物学研究和应用都具有重要意义。
下面将介绍菌种鉴定的一般方法及步骤。
一、形态学鉴定1.菌落形态观察：将菌株接种在合适的培养基上，培养一定时间后，观察菌落的形态特征，包括菌落的形状、颜色、质地等。
2.细胞形态观察：将菌株制备成适当的涂片，使用显微镜观察菌体的形态特征，包括细胞的形状、大小、排列方式等。
二、生理生化特性鉴定1.生长条件观察：菌株在不同培养条件下的生长情况对其鉴定有重要意义。
可通过调节培养基的pH值、温度、营养成分等条件，观察菌株在不同环境下的生长情况。
2.代谢产物检测：菌株的代谢产物可以通过化学方法检测，如氧化酶、酸碱指示剂等。
三、分子生物学特征鉴定1.16S rRNA序列分析：16S rRNA是细菌特有的序列，通过测序并与数据库中已知的16S rRNA序列比对，可以确定菌株的亲缘关系。
2.DNA指纹图谱分析：通过PCR扩增菌株的DNA片段，然后使用凝胶电泳或者高通量测序技术进行分析，可以得到菌株的DNA指纹图谱，从而进行鉴定。
菌种鉴定的方法及步骤主要包括形态学鉴定、生理生化特性鉴定和分子生物学特征鉴定。
其中，形态学鉴定主要通过观察菌落和菌体的形态特征来确定菌株的分类；生理生化特性鉴定则是通过观察菌株在不同环境条件下的生长情况和代谢产物来进行鉴定；分子生物学特征鉴定则是通过分析菌株的DNA序列以及DNA指纹图谱来确定其亲缘关系。
这些鉴定方法可以相互补充，提高鉴定的准确性。
在实际应用中，可以根据不同需求选择合适的方法进行菌种鉴定，以确保准确性和可靠性。
菌种鉴定方法及步骤
菌种鉴定方法及步骤菌种鉴定是指通过对菌株样本进行系统学、形态学、生理学和生化学等各方面的观察与检测，以确定其属、种分类地位的过程。
菌种鉴定方法及步骤如下：2.制备纯培养物：分离并得到纯培养菌株，避免混杂的现象。
3.形态学观察：观察菌株的形态特征，包括菌落形态、菌落颜色、菌丝生长特征等。
4.微观形态学观察：观察菌株的细胞形态、孢子形态、菌丝形态等。
5.分类地位确定：通过对菌株的形态特征进行比对和研究，确定其属、种分类的地位。
1.生长条件观察：观察菌株在不同的生理因素（如温度、pH值、氧气含量等）下的生长情况。
2.营养需求观察：观察菌株在不同营养物质（如碳源、氮源等）的利用情况，以及对不同抗生素和化学物质的敏感性。
3.生化特征检测：进行生化试验，如氧化酶试验、氧化发酵试验、内酯酶试验等，以检测菌株的生化特征。
4.产物检测：检测菌株的代谢产物，如抗生素、酶等，以判断其代谢途径和功能。
1.提取菌株基因组DNA：通过细菌培养物提取菌株的基因组DNA。
2.PCR扩增：使用特异性引物进行PCR扩增，选择适当的靶基因进行扩增。
3.DNA测序及分析：对扩增的DNA产物进行测序，利用生物信息学方法对测序结果进行分析和比对。
4.基因序列比对：将测序结果与数据库中已知菌种的基因序列进行比对，以确定菌株的分类地位。
四、传统鉴定方法的优缺点1.优点：传统鉴定方法操作简单，成本低廉；不需要复杂设备，适用于一般实验室进行菌株鉴定。
2.缺点：传统鉴定方法对菌株鉴定仅限于形态学、生理学和生化学等方面的观察，鉴定结果存在一定的主观性和局限性；需要较长的时间才能得到鉴定结果。
五、分子生物学鉴定方法的优势1.高精确性：分子生物学鉴定方法通过对菌株的基因序列进行比对，可得到较高的精确性，减少了主观性和局限性。
2.快速性：分子生物学鉴定方法在提取DNA和PCR扩增等步骤后，可以迅速得到鉴定结果，节省了时间。
3.可靠性：分子生物学鉴定方法的结果具有较高的可靠性，有助于解决传统鉴定方法在分类地位判断方面的困难。
细菌分子生物学鉴定
是的，要做PCR。
首先你要提出细菌的DNA。
方法如下：1、液体培养及保种：从斜面上挑取菌苔于液体培养基中放摇床上震荡（转速160r/min）培养16小时。
吸取菌液于1.5ml的经过灭菌的EP 管中，再加甘油（30-40%）进行保种。
（-80摄氏度保藏2年）2、提取DNA（CTAB法）：（1）取1.5ml菌液于1. 5ml离心管中，12000r/min离心2min，弃上清。
（2）向沉淀物中加入350ul双蒸水，重新悬浮沉淀。
（3）加入20ul10%SDS和3ul的蛋白酶K（20mg/ml），溶菌酶3ul，混匀，于50℃温育1h。
（4）加入50ul 5mol/L NaCl溶液，充分混匀，再加入50ul CTAB/NaCl 溶液，混合后再65℃温育30min。
（6）冷却后加入等体积的酚(沉淀蛋白质)：氯仿：异戊醇（增强酚的作用）（25:24:1），小心上下颠倒混匀，12000r/min离心5min，将上清液转移到新的EP管，重复此步骤2-3次，直至分层界面无白色沉淀。
（7）加入等体积的氯仿：异戊醇（24:1），小心颠倒混匀，12000r/min 离心5min将上清液转移到新的EP管。
（纯化作用）（8）加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，12000r/min离心15min弃上清。
（9）向离心管中加入75%乙醇，12000r/min离心5min洗涤DNA沉淀，小心弃上清，重复洗涤1次，弃上清将离心管倒置于吸水纸上，晾干。
（10）加入50ul（双蒸水）/ TE Buffer溶解DNA于4℃保存。
（11）电泳检测6、PCR扩增：（细菌的通用引物为27F和1492R）将提取得到的DNA 进行PCR扩增，电泳检测扩增得到的16S rDNA（如果菌类分明，条带清晰，PCR原液可直接送去测序，双向测通，得到测序序列后到NCBI的BLAST页面比对，得出鉴定结果）7、酶切带型分型确定操作单元：将扩增产物用HhaI和HaeIII两种限制性内切酶进行酶切，电泳检测酶切产物，酶切带型相同的分为一个操作单元。
菌种鉴定标准操作规程
菌种鉴定标准操作规程目的：建立菌种鉴定标准操作规程范围：适用于******鉴定标准操作职责：内容：1整体操作步骤1.1纯化、分离待鉴定菌用接种环挑取待鉴定菌落或少许含菌溶液到相应的培养基上（如TSA），划线分离，以出现微生物单菌落为止。
1.2挑取纯化后的单菌落，进行革兰染色、镜检，以确定待鉴定菌的革兰属性。
1.3如镜检结果为革兰阴性杆菌，则先进行发酵实验。
如发酵实验结果为阴性，则选用API20NE试剂条进行鉴定；如发酵实验结果为阳性，则在经过细胞色素氧化酶实验后选用API20E试剂条进行鉴定。
1.4如镜检结果为革兰阳性球菌，则先进行过氧化氢酶实验。
如实验结果为阴性则选用API Strep试剂条进行鉴定，如实验结果为阳性则选用API Staph试剂条进行鉴定。
1.5假如镜检结果为革兰阳性杆菌并且有内生芽胞，则选用API 50CHB试剂条进行鉴定；否则，根据运动性实验和过氧化氢酶实验结果选用API Coryne或其他试剂条进行鉴定。
1.6选定正确的试剂条以后，根据不同的API试剂条的标准操作规程准备接种物，进行接种、培养等操作并将结果形成数码，用API鉴定软件鉴定或查询待检菌的名称均可。
鉴定结果应记录，必要时，给出相应解释。
2革兰氏染色2.1染色剂的配制2.1.1结晶紫染色液：甲液：结晶紫 1.0g95%的酒精20ml乙液：草酸铵0.8g水80ml将甲液和乙液混合均匀，静置48h使用，置密闭棕色瓶中储存。
2.1.2碘液：碘 1.0g碘化钾 2.0g水300ml配制时先用3～5ml水将碘化钾溶解，再加入碘，用力摇匀，使之全部溶解后，再加水稀释至300ml，摇匀，分装在棕色瓶中储存。
2.1.3稀石碳酸红溶液:碱性品红 1.0g石碳酸 5.0ml95%乙醇10.0ml配制时用乙醇溶解碱性品红，然后加入石碳酸溶液，使用时加水稀释至100ml，摇匀。
2.2操作:2.2.1涂片：用接种环挑取液体培养物中菌体在载玻片上涂成薄层，固体培养物则先在载玻片上滴一滴蒸馏水或生理盐水，用接种环挑取少量菌体在载玻片上涂成薄层。
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程
细菌鉴定流程一般分为以下几个步骤：
1. 样品收集：根据需要鉴定的细菌类型和来源，选择适当的样品收集方式。
样品可以是细菌培养物、体液、食物等。
2. 培养：将样品接种到适当的培养基上进行培养。
根据细菌的生长条件需求，选择适当的培养基，如富含寡营养物的普通培养基、特殊选择性培养基等。
3. 盱衡生长：根据细菌类型和特性，观察细菌的生长状况，如菌落形状、颜色、大小等。
4. 形态学鉴定：使用显微镜观察细菌的形态学特征，包括细菌的形状（球形、杆状、螺旋形等）、大小、菌落或细胞的结构、芽生等。
5. 生化鉴定：进行一系列生化试验以确定细菌的生化特性，如氧需求、发酵产物、酶反应、代谢产物等。
6. 免疫学鉴定：通过免疫学方法，如血清学试验、酶联免疫吸附试验等，检测细菌对特定抗体的反应性，以确定细菌的免疫学特性。
7. 分子生物学鉴定：应用分子生物学技术，如PCR（聚合酶链反应）、序列分析
等，检测细菌的DNA或RNA序列，以确定细菌的基因特征和亲缘关系。
8. 数据分析和鉴定：根据样品收集、培养、观察、试验等结果，综合分析得到的数据，确定细菌的鉴定结果。
可以参考细菌鉴定手册或数据库，进行对照确认。
这些步骤都需要进行严格的实验操作和分析，以确保细菌鉴定的准确性和可靠性。
不同类型的细菌鉴定流程可能会有所不同，具体流程可以根据实际需要进行调整和优化。
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定是通过一系列方法和步骤来确定细菌菌种的过程。
以下是常用的细菌鉴定方法和步骤：
1. 收集样品：从目标环境或感染部位收集细菌样品，如血液、尿液、唾液、食物等，以便后续实验。
2. 培养：将细菌样品接种到适当的培养基上，提供足够的营养物质和环境来促进细菌的生长。
3. 纯化：将单个细菌菌落分离出来，并通过连续的传代培养使其得到纯化，以避免不同细菌种类的混杂。
4. 形态观察：观察细菌在固体培养基上的形态特征，如菌落的形状、颜色、大小等，以及在显微镜下的细胞形态，如形状、大小、结构等。
5. 染色：将细菌样品进行染色，如革兰氏染色、抗酸染色等，以便观察不同细菌的染色特征。
6. 生理生化试验：进行一系列生理生化试验，如代谢产物的产生、酶活性、氧需求等，以确定细菌的代谢特征。
7. 耐受性检测：测试细菌对温度、pH值、氧气和抗生素等环境因素的耐受性，以进一步确认鉴定结果。
8. 分子生物学分析：利用分子生物学技术，如PCR、序列分析等，通过对细菌的基因组或特定基因进行分析，来确定细菌的物种。
9. 鉴定结果：根据以上步骤的结果和参考文献，将细菌归类到已知的菌属或菌种中，最终得出细菌的鉴定结果。
需要注意的是，细菌鉴定是一个复杂的过程，通常需要准备鉴别试剂和设备，以及具备相关实验操作的技术和经验。
细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展
细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展一、本文概述随着分子生物学技术的快速发展，其在细菌分类鉴定领域的应用已经取得了显著的进展。
本文旨在对细菌分类鉴定的分子生物学方法研究进展进行系统的梳理和总结，以期为相关领域的学者和从业人员提供全面的科研进展参考。
本文将重点介绍分子生物学技术在细菌分类鉴定中的应用，包括基因测序技术、PCR技术、基因芯片技术、宏基因组学方法等，并探讨这些技术在细菌分类鉴定中的优势、挑战以及未来发展趋势。
同时，本文还将对近年来细菌分类鉴定领域的重要研究成果进行综述，以期为细菌分类鉴定领域的研究提供有益的参考和启示。
二、细菌分类鉴定的传统方法及其局限性传统的细菌分类鉴定方法主要依赖于细菌的表型特征，包括菌落形态、细胞形态、生理生化特性、血清学反应以及生态习性等。
这些方法在过去的一个多世纪里为细菌学的发展做出了重要贡献，随着科学技术的进步和细菌学研究的深入，传统方法的局限性逐渐显现。
传统方法的鉴定过程往往繁琐耗时，需要经过多步实验操作，包括细菌培养、形态观察、生理生化试验等，这不仅增加了实验成本，也限制了鉴定效率。
传统方法对于某些表型特征相似的细菌种类往往难以准确区分，容易出现误判或漏判的情况。
传统方法对于新出现的、未知的或者难以培养的细菌种类往往束手无策，无法进行有效的鉴定。
随着分子生物学技术的发展和应用，人们开始尝试将分子生物学方法引入细菌分类鉴定领域，以期能够更快速、更准确地进行细菌鉴定。
分子生物学方法以其高灵敏度、高分辨率和高通量的特点，为细菌分类鉴定提供了新的可能性和解决方案。
三、分子生物学方法在细菌分类鉴定中的发展与应用近年来，分子生物学技术的飞速发展极大地推动了细菌分类鉴定领域的研究进展。
这些技术以其高度的特异性和灵敏度，为细菌分类鉴定提供了全新的视角和强大的工具。
在细菌分类鉴定中，16S rRNA基因序列分析已成为最常用的方法之一。
16S rRNA基因在细菌中高度保守，同时又在不同种属间存在足够的变异，使得其成为细菌分类鉴定的理想靶标。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
分子生物学方法鉴定微生物
分子生物学方法鉴定微生物分子生物学是分子水平上研究生物学的一门学科，可以应用于微生物的鉴定和研究。
在分子生物学中，通过分析微生物的DNA、RNA和蛋白质，可以确定微生物的物种、进化关系和功能特性。
以下将介绍一些常用的分子生物学方法来鉴定微生物。
首先，核酸提取是分子生物学研究的基础步骤。
通过核酸提取可以获得微生物样本中的DNA或RNA。
一般常用的提取方法包括酚-氯仿法、离心法、磁珠法等。
提取得到的核酸可以用于后续的PCR扩增、测序、芯片分析等。
其次，PCR扩增技术是分子生物学中最常用的方法之一、通过PCR扩增可以在微生物样本中放大特定的基因片段，并进行进一步的分析。
PCR扩增主要包括两个步骤：变性和退火，其中变性是将DNA双链解开，退火是将引物与靶序列互补结合。
通过PCR扩增可以获得大量的特定基因片段，用于进一步的测序和鉴定。
PCR扩增得到的目标基因片段可以进行多种分析方法。
其中，序列测定是一种常用的方法。
通过测定PCR扩增得到的基因片段的序列，可以确定该基因片段在数据库中的匹配度，并据此确定微生物的物种。
此外，序列测定还可以通过比对进化树的构建，研究微生物的进化关系。
此外，还可以利用PCR扩增得到的基因片段进行限制性酶切分析。
限制性酶切分析可以将PCR扩增得到的基因片段在特定的酶切位点上切割成片段，并通过凝胶电泳进行分离和检测。
通过比较不同微生物基因片段的切割模式，可以确定微生物的物种和进化关系。
除了PCR技术外，还可以利用酶切多态性（RFLP）分析来鉴定微生物。
RFLP是一种对PCR扩增得到的基因片段进行限制酶切，并通过凝胶电泳对切割产物进行分离检测的方法。
不同微生物在特定限制酶切位点的序列差异可以通过RFLP分析来鉴定。
最后，还可以使用引物扩增反应-随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术来鉴定微生物。
RAPD技术是一种利用随机引物扩增基因组DNA的特定区域，通过凝胶电泳分析扩增产物，根据扩增产物的差异进行微生物的鉴定。
分子生物学鉴定细菌的方法具体操作步骤与注意事项
16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
分子生物学方法鉴定微生物
③ 核酸探针
广泛用于微生物鉴定、传染病诊断、流行病调查、食品卫生微生 物检测以及分子生物学许多领域。 所谓核酸探针(probe)是指能识别特异核苷酸序列的、带标记的 一段单链DNA或RNA分子。因此，一种核苷酸片断能否作为探 针用于微生物鉴定，最根本的条件是它的特异性，即它能与所检 测的微生物的核酸杂交而不能与其他微生物的核酸杂交。 根据特异性的不同，在微生物鉴定与检测中的作用也不同，有的 探针只用于某一菌型的检测，有的可能用于某一种、属、科甚至 更大类群范围的微生物的检测或鉴定。 例如，从一株淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)隐蔽性质 粒制备的DNA探针，它具有种的特异性，可用来检测和鉴定这 种引起人类性行为传播疾病的细菌。
16S rDNA微生物鉴定流程
培养微生物 提取基因组DNA rDNA序列测定
PCR扩增16S rDNA片段
分析比较
微生物之间的系统发育关系
从样品中分离提取总微生物DNA
从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR 扩增16S rRNA的前提。 一种方法是直接提取总DNA，对易于培养的微生物可通过培 养富集后再进行提取，另一种选择是提取微生物细胞中的 rRNA。RNA的提取技术相对于 DNA的提取较为复杂，一般 多采用提取细胞总 DNA，但也可根据情况选择提取 rRNA。
微生物分子生物学鉴定
微生物分类学定义： 按微生物的亲缘关系和进化规律 把它们安排成条理清楚的各种分类单元 或分类群的科学。
微生物的鉴定
主要步骤：纯化、测定一系列必要的指标、查找 权威性鉴定手册 鉴定方法分四个水平：
1. 细胞的形态和习性水平：形态特征、运动、酶反应、营 养要求及生长条件等 2. 细胞组分水平：细胞壁成分、氨基酸库、脂类、醌类、 光合色素等的分析 3. 蛋白质水平：氨基酸序列分析、凝胶电泳和血清学反应 等 4. 基因或DNA水平：核酸分子杂交、（G+C）mol%、转 化和转导、16SrRNA寡核苷酸族分分析、DNA或RNA 核苷酸序列分析等
细菌鉴定的方法和步骤
细菌鉴定的方法和步骤细菌鉴定是确定或确认细菌属种的过程，它是微生物学中非常重要的一部分，有助于了解细菌的特征、生态习性和其对人类的影响。
下面，我将介绍细菌鉴定的一般方法和步骤。
一、准备实验室条件和材料在进行细菌鉴定之前，需要准备好实验室条件和所需的材料。
实验室应具备洁净、无菌环境，预防细菌污染。
所需的材料包括培养基、培养皿、平板、显微镜、油浸物镜、背景颜色固定剂、染色试剂、耗材等。
同时，实验人员需要佩戴实验手套和口罩，保证操作的无菌性。
二、选择适当的培养基不同的细菌在不同的培养基上生长出不同的菌落，因此选择适当的培养基是细菌鉴定的关键。
常用的培养基有营养琼脂培养基、血琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂培养基等。
根据需要鉴定的菌株特性和需求，选择适当的培养基。
三、样品采集和拮抗在开始鉴定之前，需要采集样品并进行扩培。
样品来源可以是病人的体液、环境中的土壤、水源、食品等。
样品采集最好是在无菌环境中进行，避免外来的细菌干扰结果。
四、制备纯培养物为了获得纯种细菌，需要将样品进行拮抗并分离。
拮抗是指将细菌分离成单独的菌落，并在新的培养基上获得单个菌种的纯培养物。
常用的方法有稀释再悬浮平板法、分离斑点法、筛选法等。
通过将菌落接种到培养基上，经过单菌的选择和培养，最终得到纯种菌株。
五、观察菌落特征观察菌落形态是进行细菌鉴定的重要步骤之一。
菌落特征包括菌落大小、形状、质地、边缘、颜色等。
通常使用肉眼或显微镜对菌落进行观察，并记录下菌落的特征。
六、进行染色处理染色是细菌鉴定中常用的方法之一。
根据细菌细胞壁的性质，通常使用革兰氏染色、苏木精-伊红染色等常规方法进行染色处理。
通过染色，可以初步了解细菌的形态、结构和染色特性。
七、观察细胞的形态和结构将已染色的细菌样本放置在显微镜下，使用油浸物镜进行镜片调焦。
观察细菌细胞的形态特征，如形状（球形、棒状、螺旋形等）、大小、连杆性等。
此外，还可以观察细菌细胞的结构、附属结构（如鞭毛、菌毛等）以及内部结构（如胞浆、核质等）。
菌种鉴定的分子生物学方法
菌种鉴定的分子生物学方法——16S rDNA 测序鉴定菌种一． 原理细菌中包括有三种核糖体RNA ，分别为5S rRNA 、16S rRNA 、23S rRNA 。
5S rRNA 虽易分析，但核苷酸太少，没有足够的遗传信息用于分类研究；23S rRNA 含有的核苷酸数几乎是16S rRNA 的两倍，分析较困难。
而16S rRNA 相对分子量适中，又具有保守性和存在的普遍性等特点，序列变化与进化距离相适应，序列分析的重现性极高，因此，现在一般普遍采用16S rRNA 作为序列分析对象对微生物进行测序分析。
16S rRNA 对应于基因组DNA 上的一段基因序列称为16S rDNA ，rRNA 基因由保守区和可变区组成。
在细菌的16SrDNA 中有多个区段保守性，根据这些保守区可以设计出细菌通用物，可以扩增出所有细菌的16SrDNA 片段，并且这些引物仅对细菌是特异性的，也就是说这些引物不会与非细菌的DNA 互补，而细菌的16S rDNA 可变区的差异可以用来区分不同的菌。
因此，16SrDNA 可以作为细菌群落结构分析最常用的系统进化标记分子。
随着核酸测序技术的发展，越来越多的微生物的16S rDNA 序列被测定并收入国际基因数据库中，只要将基因序列放入基因数据库进行对比，便可快速的鉴定所测定的细菌种属，这样用16Sr DNA 作目的序列进行微生物群落结构分析更为快捷方便。
二． 技术路线该方法包括细菌基因组DNA 提取、16S rDNA 特异引物PCR 扩增、扩增产物纯化、DNA 测序、序列比对等步骤。
具体技术路线如下：三． 方法步骤（一）细菌基因组DNA 提取（酶解法）1. 挑取单菌落接种到10 mL LB 培养基中37℃振荡过夜培养。
细菌培养液基因组DNADNA 提取PCR 扩增16S rDNA 片段片段回收连接克隆载体阳性克隆鉴定 测序2. 取2 mL培养液到2 mLEP管中，8000 rpm离心2分钟后倒掉上清液。
常见细菌系统鉴定手册(完整版)
常见细菌系统鉴定手册（完整版）引言细菌是一类微生物，其广泛存在于自然界中的各种环境中，包括土壤、水体、空气和生物体内等。
它们的存在对于生态系统的平衡和人类的健康具有重要影响。
准确鉴定细菌的种类和特性对于科学研究、临床诊断和环境保护具有重要意义。
本文档为常见细菌系统鉴定手册，旨在帮助用户了解并进行常见细菌的鉴定工作。
目录1.细菌的形态特征2.细菌的生理特性3.细菌的遗传特性4.常见细菌的鉴定方法–接种和培养方法–生物化学试验–分子生物学方法–其他鉴定方法5.常见细菌的鉴定实例6.细菌鉴定的注意事项7.总结细菌的形态特征在鉴定细菌时，首先需要观察和描述细菌的形态特征。
细菌的形态特征包括形状、大小、颜色、表面特征等。
常见的细菌形状有球菌、杆菌、弧菌、螺旋菌等。
细菌的大小通常以直径或长度来描述，颜色可以是透明、白色、黄色、红色等。
表面特征是指细菌菌落的形状、质地和触感等。
细菌的生理特性细菌的生理特性是指其在生长和代谢方面的特点。
需要关注的生理特性有气体需求、温度和pH值的适宜范围、营养要求等。
例如，一些细菌需要氧气进行呼吸，被称为好氧菌；一些细菌则无需氧气，甚至不能在氧气存在下生长，被称为厌氧菌。
细菌的遗传特性细菌的遗传特性对鉴定和分类细菌起着重要作用。
细菌的遗传物质主要是DNA，其通过突变和基因重组等方式进行遗传。
常见的细菌分类方法包括16S rRNA基因序列比对、DNA 指纹图谱分析等。
常见细菌的鉴定方法接种和培养方法接种和培养是最常用的细菌鉴定方法之一。
主要步骤包括样品的采集、接种培养基、温度和时间的控制等。
常用的培养基有肉汤、琼脂和MacConkey琼脂等。
接种后，细菌会在培养基上生长形成菌落，通过观察菌落形态和特性可以初步判断细菌的类型。
生物化学试验生物化学试验是通过检测细菌在特定条件下的代谢产物来鉴定细菌。
常见的生物化学试验包括氧化-发酵试验、酸碱反应试验和酶活性检测等。
通过观察试验结果，可以确定细菌的代谢方式和特性。
用于细菌鉴定和分类的分子生物学方法
16s rRNA 的同源性分析最适用于属及属以上的远缘关系。目前, 已对 2000 种( 约相当于50%) 以上的真细菌的16s rRNA 进行了测序, 不同菌属 的16s rRNA 序列同源性为70% ～ 95% , 16s rRNA 序列和DNA-DNA 同源性相关关系的研究表明: 序列的相性不 在99. 8%以上就不能达到70%以上DNA-DNA 的同源性。16s rRNA 总共约有 1500bp, 0. 2%的不同相当于3 个碱基。由于数据库中的数据不一定完全而且 个人读取数据也可能出现错读, 因此由16s rRNA 序列鉴定种是很难的。 第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对 于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。 第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个 环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。
用于细菌鉴定和分类的分子生 物学方法
报 告 人：王浩丞 2012年4月26日
主要内容
• DNA-DNA杂交 • 16SrDNA在细菌分类鉴定的应用 • 几种“看家基因”（Housekeeping genes）在细菌分类鉴定的应用
DNA-DNA杂交
现代细菌分类学中，DNA-DNA分子杂交一直认为是作为细菌分类和 鉴定的“黄金法则”。 基本原理：使用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源 的DNA在体外变性（高温或pH)，并在合适的条件下(盐类浓度和温度）， 使互补的碱基重新配对，测量杂交百分数(常以同源%表示；也有称碱基相 似性%）百分数越高，杂交的两种DNA之间碱基线性序列的相似性就越高， 说明它们之间的亲缘关系也就越近。
16SrRNA基因结构图ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
其序列包含10 个可变区（variable region）和11 个恒定区（constant region），其中V1、V2、V3和V4共4个高变区，尤其是V2这一高变区， 由于其进化速度相对较快，其中所包含的信息，足够用于物种属及属以 上分类单位的比较分析。因此，Johes S W和Neller H F等报道测定16 S rDNA基因的部分序列即可达到鉴定的目的
微生物细菌鉴定流程
微生物细菌鉴定流程近年来，微生物细菌在医学、环境科学、食品安全等领域中的重要性日益凸显。
而准确、快速地鉴定微生物细菌的种类，对于疾病的防治、环境污染的监测以及食品质量的保障都具有重要意义。
下面将以人类的视角，为你详细介绍微生物细菌鉴定的流程。
第一步：样本采集鉴定微生物细菌的第一步是采集样本。
样本的选择和采集方法直接关系到鉴定的准确性和可行性。
常见的样本包括血液、尿液、粪便、食品、土壤等。
采集样本时要注意避免污染，使用无菌工具进行采集，并妥善保存以保持样本的完整性。
第二步：样本处理在样本采集后，需要进行处理以提取微生物细菌。
处理方法根据不同的样本类型而有所不同。
例如，对于食品样本，可以进行均质化和稀释，以增加微生物的浓度。
对于血液样本，可以进行离心和沉淀，以获得血浆或血清。
第三步：培养和分离经过样本处理后，接下来需要将微生物细菌培养和分离。
培养是指将样本中的微生物细菌在适宜的培养基上进行生长。
培养基的选择要根据不同的细菌种类和特性来确定。
分离是指将不同的细菌分开，以便后续的鉴定。
分离可以通过涂布法、滴定法、稀释法等多种方法进行。
第四步：形态学观察在分离细菌后，需要进行形态学观察。
形态学观察包括观察细菌的形状、大小、颜色等特征。
这些特征能够提供一些线索，帮助鉴定细菌的种类。
第五步：生理生化测试除了形态学观察外，生理生化测试也是鉴定微生物细菌的重要手段。
生理生化测试通过对细菌的代谢、酶活性、生长特性等进行检测，来推测细菌的种类。
常见的生理生化测试包括氧需求性测试、碳源利用测试、酶活性测试等。
第六步：分子生物学鉴定在形态学观察和生理生化测试的基础上，可以进行分子生物学鉴定。
分子生物学鉴定通过分析微生物细菌的DNA或RNA序列，来确定其种类。
常见的分子生物学鉴定方法包括PCR、测序等。
第七步：鉴定结果分析最后一步是对鉴定结果进行分析。
根据形态学观察、生理生化测试和分子生物学鉴定的结果，确定微生物细菌的种类。
鉴定细菌的方法
鉴定细菌的方法一、形态学鉴定法形态学鉴定法是通过观察细菌在显微镜下的形态特征来进行鉴定。
细菌的形态特征包括细菌的形状、大小、胞壁结构、胞内结构等。
通过染色技术，如革兰氏染色、抗酸染色等，可以更清晰地观察到细菌的形态特征。
形态学鉴定法简单易行，但对操作者的经验要求较高。
二、生理生化特性鉴定法生理生化特性鉴定法是通过研究细菌在特定条件下的代谢特点来进行鉴定。
包括对细菌的营养需求、氧气需求、产酶能力、代谢产物等进行检测。
常用的生理生化鉴定方法有氧耗量法、氧化酶试验、碳水化合物利用试验等。
通过与已知细菌的生理生化特性进行比对，可以确定未知细菌的种类和特性。
三、分子生物学鉴定法分子生物学鉴定法是通过分析细菌的基因组DNA序列或特定基因的序列来进行鉴定。
常用的分子生物学鉴定方法包括PCR技术、脱氧核糖核酸(DNA)序列比对等。
通过比对未知细菌的基因序列与数据库中已知细菌的基因序列，可以准确确定细菌的种属和亲缘关系。
四、免疫学鉴定法免疫学鉴定法是通过检测细菌与特定抗体的反应来进行鉴定。
常用的免疫学鉴定方法有免疫沉淀试验、酶联免疫吸附试验等。
通过与已知抗体的反应性比对，可以确定细菌的种类和抗原特性。
五、质谱鉴定法质谱鉴定法是通过分析细菌样品中的代谢产物或特定蛋白质的质谱图谱来进行鉴定。
质谱鉴定法具有高分辨率和高灵敏度的优点，可以对细菌的代谢产物进行全面分析，提供更准确的鉴定结果。
六、综合鉴定法综合鉴定法是将多种鉴定方法相结合，通过综合分析不同方面的鉴定结果来进行细菌的鉴定。
这样可以提高鉴定的准确性和可靠性。
例如，先利用形态学鉴定法对细菌进行初步鉴定，然后再通过生理生化特性鉴定法、分子生物学鉴定法等进行进一步确认。
细菌的鉴定方法多种多样，每一种方法都有其优点和局限性。
在实际应用中，常常需要综合运用多种鉴定方法来进行细菌的鉴定，以提高准确性和可靠性。
同时，随着科学技术的不断发展，新的鉴定方法也在不断涌现，为细菌的鉴定和研究提供了更多的选择和可能性。
伯杰细菌鉴定手册
伯杰细菌鉴定手册1. 引言细菌鉴定是微生物学中至关重要的一环。
伯杰细菌鉴定手册是一本专门用于帮助科研人员、医生和实验室技术人员鉴定细菌的参考手册。
它提供了一系列流程和方法，使用户能够准确鉴定各类细菌，并获得关键信息，以便进一步进行分析和研究。
本手册采用Markdown文本格式，旨在提供一个方便易用的电子版本供使用者参考。
2. 鉴定方法2.1 核心鉴定步骤伯杰细菌鉴定手册涵盖了以下核心鉴定步骤：2.1.1 样品处理样品处理是细菌鉴定过程中的关键步骤。
在这一步骤中，我们需要对采集到的样品进行适当处理，以获得高质量的菌落。
本手册详细介绍了不同样品的处理方法，并提供了操作提示和注意事项。
2.1.2 培养与菌液制备培养是细菌鉴定中必不可少的一步。
本手册提供了不同培养基的制备方法，以及菌液的制备步骤。
用户可以根据实验室设备和实际需求选择适当的培养基和方法。
2.1.3 形态学观察形态学观察是细菌鉴定的重要依据之一。
本手册描述了常见细菌的形态学特征，包括菌落形状、颜色、大小等信息。
同时，还提供了显微镜观察时的注意事项和技巧。
2.1.4 生理生化试验生理生化试验是鉴定细菌的重要手段之一。
本手册列出了常用生理生化试验方法，并提供了详细的实验步骤和结果解读。
用户可以根据实验室条件选择适合的方法进行测试。
2.1.5 分子生物学鉴定分子生物学鉴定是近年来发展起来的一种细菌鉴定方法。
本手册介绍了不同分子生物学技术的原理和步骤，包括PCR、序列分析等。
用户可以利用这些技术快速、准确地鉴定未知细菌。
2.2 鉴定表格伯杰细菌鉴定手册提供了一系列鉴定表格，用于记录和整理鉴定结果。
通过填写鉴定表格，用户可以方便地对细菌进行分类和比较。
3. 应用案例本手册还包括一些典型的细菌鉴定案例，供读者参考。
这些案例涵盖了不同类型的细菌，并提供了详细的鉴定步骤和结果解读，帮助读者更好地理解和运用所学知识。
4. 总结伯杰细菌鉴定手册是一本非常实用的参考手册，它提供了全面的细菌鉴定流程和方法。
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16S rDNA鉴定细菌的方法细菌16S rDNA鉴定主要分为7个部分：1.提取细菌基因组DNA,2.设计/选择引物进行PCR扩增，电泳检测纯度与大小。
3.琼脂糖凝胶电泳分离4.胶回收目的片段5.目的片段测序。
6.BLAST比对获取相似片段。
7.构建系统进化树试剂：1、培养基：通常选择组分简单且细菌生长良好的培养基（培养基组分过于复杂会影响DNA 的提取效果，也可以在裂解细菌前用TE缓冲液对菌体进行洗涤。
）。
2、1M Tris-HCl (pH7.4, 7.6, 8.0)（1L）：121.1g Tris，加浓盐酸约（70ml, 60ml, 42ml），高温高盐灭菌后，室温保存。
冷却到室温后调pH，每升高1℃，pH大约下降0.03个单位。
3、0.5M EDTA（pH8.0）（1L）：186.1g Na2EDTA•2H2O，用NaOH调pH至8.0（约20g）,高温高压灭菌，室温保存。
4、10×TE Buffer(pH7.4，7.6，8.0)（1L）：组分：100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA。
1M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）取100ml，0.5M EDTA（pH8.0）取20ml。
高温高压灭菌，室温保存。
1×TE Buffer用10×TE Buffer稀释10倍即可。
5、10%SDS（W/V）：称10g，68℃加热溶解，用浓盐酸调pH至7.2。
室温保存。
用之前在65℃溶解。
配置时要戴口罩。
6、5M NaCl：称292.2gNaCl，高温高压灭菌，4℃保存。
7、CTAB/NaCl（10%CTAB，0.7M NaCl）：溶解4.1g NaCl，加10g CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），加热搅拌。
用之前在65℃溶解。
8、氯仿/异戊醇：按氯仿：异戊醇=24：1（V/V）的比例加入异戊醇。
9、酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）：按苯酚与氯仿/异戊醇=1：1的比例混合Tris-HCl平衡苯酚与氯仿/异戊醇。
10、TAE缓冲液：使用液1×：0.04 mol/L Tris-乙酸，0.001 mol/L EDTA。
浓储存液50×：242g Tris，57.1 ml 冰醋酸，100 ml 0.5 mol/L EDTA (pH8.0)。
11、6×上样缓冲液（100 ml）：0.25%溴酚蓝（BPB），40%蔗糖，10 mmol/L EDTA (pH8.0)（0.2 ml），4℃保存。
12、0.6%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖用TAE溶液配置50 ml。
13、EB：10 mg/ml。
称取1g溴化乙锭定容至100ml。
棕色瓶室温避光保存。
EB的工作浓度为0.5ug/ml。
当配置50ml 琼脂糖凝胶时加入EB为2.5ul。
（因EB是剧毒物质，目前很多实验室用生物荧光染料替代，常用的有Gelred等）14、蛋白酶K：20 mg/ml 溶于水，-20℃保存，反应浓度50 ug/ml，反应缓冲液：0.01 mol/L Tris (pH 7.8), 0.005 mol/L EDTA, 5% SDS，反应温度37-56℃。
无需预处理。
15、RNase A：10 mg/ml。
25 mg RNase A 加1M Tris（pH 7.5）25ul，2.5M NaCl 15ul，无菌水2460 ul，于100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。
（为避免RNA的干扰，使用RNA酶降解基因组中的RNA。
）1.1细菌基因组DNA提取基本步骤：材料准备破碎细胞或胞膜—内容物释放核算分离、纯化沉淀或吸附核酸，并去除杂质核酸溶解在适量缓冲液或水中基因组DNA提取所需仪器：高速冷冻离心机、恒温冰箱、移液器、水平电泳槽、紫外/荧光观测仪细菌基因组DNA提取方法综述细菌基因组DNA的提取方法主要有5种。
不同的方法所选择的试剂会有所不同。
1 快速微量提取法取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。
加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37o C水浴1hr。
然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。
取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。
加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE溶液中，置4℃保存备用。
2 蛋白酶/SDS法制备✧用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.✧4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE（50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTApH8.0）洗菌体2次。
✧将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h-5h。
✧用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次。
✧乙醇沉淀DNA。
✧用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。
3．◆细菌培养：细菌接种于5ml液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。
◆细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O也行)。
◆菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。
再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。
（此时菌液应为透明粘稠液体）。
◆抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。
12000rpm离心10min。
抽提两次。
（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）。
◆沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。
1 2000rpm离心10。
◆洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。
◆抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。
作PCR模板用。
4. DNA EXTRACTION PROCEDURE - GENERAL✧Grow cells overnight in 500 ml broth medium.✧Pellet cells by centrifugation, and resuspend in 5 ml 50 mM Tris (pH 8.0), 50mM EDTA.✧Freeze cell suspension at -20C✧Add 0.5 ml 250 mM Tris (pH 8.0), 10 mg/ml lysozyme to frozen suspension, andlet thaw at room temperature. When thawed, place on ice for 45 min.✧Add 1 ml 0.5% SDS, 50 mM Tris (pH 7.5), 0.4 M EDTA, 1 mg/ml proteinase K. Placein 50C water bath for 60 min.✧Extract with 6 ml Tris-equilibrated phenol and centrifuge at 10,000X g for 15min. Transfer top layer to new tube (avoid interface). Re-do this step if necessary.✧Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix byinverting).Spool out DNA and transfer to 5 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA, 200 g/ml RNase.Dissolve overnight by rocking at 4C.✧Extract with equal volume chloroform (mix by inverting) and centrifuge at10,000X g for 5 min. Transfer top layer to a new tube.✧Add 0.1 vol 3M Na acetate (mix gently), then add 2 vol 95% ethanol (mix byinverting).✧Spool out DNA and dissolve in 2 ml 50 mM Tris (pH 7.5), 1 mM EDTA✧Check purity of DNA by electrophoresis and spectrophotometric analysis.5．CTAB/NaCl裂解法⏹接两环菌（0.75ml甘油管菌液）于25ml LB培养基中，37℃、200r/min培养24h。
⏹取1.5ml菌液于1.5ml Eppendorf 离心管中，8000r/min离心5分钟,弃去上清。
⏹加入1.5ml TE离心洗涤后,用567 ul TE溶解菌体,混匀。
⏹加入30μl 10%SDS和3 ul 20 mg/ml的蛋白酶K（100 ug/ml），混匀，于37℃温育1h。
⏹加入100μl 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80μl CTAB/NaCl,混匀,65℃温育10分钟。
⏹加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1)（0.8ml）,混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)(0.8ml),混匀,12000r/min离心5分钟,保留上清。
⏹加入0.6倍的异丙醇（0.48ml）,轻轻混合直到DNA沉淀下来（0.5h）,12000r/min离心15分钟,收集DNA沉淀,用75%乙醇(1ml)12000r/min离心5分钟洗涤DNA沉淀，真空干燥0.5h。
⏹用50 ul双蒸水溶解DNA, 加入终浓度为20μg/mlRNaseA，4℃保存。
⏹用0.6%琼脂糖凝胶电泳鉴定提取的DNA , 每孔点样6μl (4μl样品+ 2μl loadingbuffer) , 80 V , 电泳1.5小时。