基因分型技术

? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P1 TTGTGGTAGTTGGAGCTG A
? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P2 TTGTGGTAGTTGGAGCT CA
? 12ASP 突变型（ ARMS ）引物 P3 TTGTGGTAGTTGGAGC AGA
图1 3条ARMS引物的扩增曲线 （模板为 3*108 copies/ul 野生型质粒）
个体化分子诊断的检测技术
提纲
? 个体化诊断的内容 ? 个体化诊断的技术简介 ? 技术原理
什么是个体化分子诊断
身高/体重
基因
性别
年龄 老年人 儿童 新生儿
环境因素 饮食 / 吸烟/ 合并用药
药物反应个体差异
病程
并发症
脏器功能 肝, 肾, 心
个体化基因检测方向
? 突变 （mutation ） ? 表达水平（level of expression) ? 甲基化修饰（methylation)
焦磷酸测序的优点
? 准确度高 ? 灵敏度高 ? 相对定量判读
检测下限影响临床判断
可检测 3%的突变
检测方法敏感度影响临床判断
100
90
例 80
比 占
70
所 60
因
基 50
40
30
20
10
野生型 突变型
灵灵敏敏度度：：33%0%
基因突变检测流程 Pyrosequencing
收取样本：血样或组织
? 检测mRNA 的水平；
基因表达水平的检测技术
? mRNA 的降解； 20℃时，Y=0.62-0.004X（R=-0.981，P<0.001）； 15℃时，Y =0.965-0.001X（R=-0.709，P<0.001）； Y：18sRNA含量 X：离体时间
? 对标本位置的要求；
mRNA 表达水平是相对定量
mRNA差异表达的相对定量分析
两种相对定量的分析方法：双标准曲线法和Delta-delta Ct法。
基因修饰的检测
DNA甲基化修饰：
基因甲基化的检测意义
基因甲基化检测的意义
目前肿瘤甲基化的研究主要集中在抑癌基因。这是 因为人们发现肿瘤的发生与抑癌基因启动子区的 CpG岛甲基化造成抑癌基因关闭非常可能有关。 ? 甲基化的诊断可以用于肿瘤发生的早期预测
基因突变检测技术
? 测序；
? 探针；
? 质谱；
基因突变检测技术
测序
探针
质谱
原始信号 一级信息 二级信息
…… 最终信息
光
光
光
探针结合
分子量
序列是否改变
推论
分子大小是否改 变
推论
碱基序列是否改变
Pyrosequencing - Chemistry
light time
Signal
PPi ATP
Light
? 肿瘤的分级
? 甚至可以作为患病风险预测、临床病程监控和疗 效评估的指标。
焦磷酸检测基因甲基化
甲基化程度的量化
无法定量的甲基化检测
? 识别人类基因组的所有大约 3万个DNA ? 测定组成人类基因组 DNA的约30亿对核苷酸的序列
测序应用的新高度
? 对定性检测（Qualitative test ）进行定量分析（ Quantitative Test ）；
突变定量检测的必要性
? 突变负荷（mutational load ）； ? 疾病不同阶段（stage of disease ）； ? 对应的策略不同；
? 金标准（Golden standard ）在检测中的作用：
? 现有技术所能达到的最先进水平，最接近客观事实，或者 反映的就是客观事实本身；
? 如同病理诊断；
为什么测序是金标准？
? 人类基因组计划（human genome project, HGP ）； ? 1990年正式启动人类基因组测序计划, 2003年完成。
～2h
～2h
～15min
～10-100min
DNA提取 DNA purification
PCR扩增 PCR amplification
测序样本准备
Pyro测序
Sample preparation Pyrosequencing
结果分析 Genotyping and identification
基因表达水平的检测
图2 3条ARMS引物的扩增曲线 （模板为 3*108 copies/ul 突变型质粒）
基因突变检测技术对比
性能 检测通量
测序技 术
荧光 PCR
探针
基因芯 片
悬液芯片
ARMS
DHPLC
高
低
高
高
低
高
灵敏、准确度 高
高
一般
高
一般
高
重复性
好
好
一般
好
好
好
可否定量
是
否
是
是
否
否
技术可靠性 金标准
/
/
/
/
/
基因突变检测技术对比
5
10
15
20
25
探针技术的常见应用
ARMs
液相芯片 基因芯片 荧光PCR
引物数量 探针
信号捕捉 判读
2
2
2
SybGreen 引物
CCD
固定于磁珠 的探针
CCD
固定于玻片 探针
扫描仪或肉 眼
光信号的有无
2 荧光探针
Cຫໍສະໝຸດ BaiduD
探针技术——Taqman
探针法的案例——ARMS
? 野生型的序列为
TTGTGGTAGTTGGAGCTGG
AGGATCT ????????? CT
T C C T AGA
Sequence to analyze: YGYGGTGYGTATYGTTTGYGAT
45%
48%
47%
45%
45%
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Dispensation Order:
E S G T C T G T C GT A G TC GC T GA T C GT A G T CGA
Q24 Instrument Design
X-Y drive positioning Reagent cartridge (Ink jet delivery)
24 well plate mix & thermostat
Lens array
CCD camera detection
焦磷酸测序的原理
准确度决定临床判断的价值