实验四 线粒体的分离与观察
细胞生物学实验四 液泡系和线粒体的活体染色
细胞生物学实验四液泡系和线粒体的活体染色一、实验目的通过荧光活体染色观察液泡系和线粒体的形态结构及特点。
二、实验原理荧光活体染色法可以为我们提供高质量，高效率的细胞形态结构信息，其液泡系和线粒体都是细胞内非常重要的细胞器。
液泡系：是一种由膜包裹的小颗粒，由高度表达蛋白的外部囊泡和腺体细胞构成。
液泡系有多种类型，包括突触小泡、内分泌小体和溶酶体等，它们在细胞内部扮演着很重要的角色。
液泡系具有在荧光显微镜下能够显现的一些特定特征，如大小、形状、亮度和分布等。
活体染色可以提供很好的分辨率和细节，从而帮助我们更好地了解液泡系统的形态和功能。
线粒体：是一个直径约为1微米的双层膜结构，是细胞中的能量“发电厂”，在细胞内分解代谢物质，并生成ATP分子，以提供细胞各项生物学过程所需的能量。
可见线粒体可以帮助我们了解线粒体的数量、大小、形状和位置等特征，这有助于我们了解其功能和代谢状态。
三、实验材料激光共焦显微镜，激光荧光探针，放置在组织玻片上的细胞，PBS磷缓冲液，人工合成影响线粒体功能小分子等药物。
四、实验步骤1. 将细胞悬液滴在组织玻片上。
2. 添加荧光探针，荧光探针可以帮助我们区分液泡系和线粒体。
3. 给细胞注射小分子化合物，如人工合成影响线粒体功能小分子等，以研究药物对细胞器的影响。
4. 用激光共焦显微镜观察荧光探针和小分子化合物的荧光信号。
5. 分析显示出的细胞器信息，记录液泡和线粒体的数量、大小、形状和位置等特征。
五、实验注意事项1. 需要小心操作激光共焦显微镜，以避免损坏昂贵的设备或可能对人体存在危害的激光。
2. 荧光探针和小分子化合物需要在适当的浓度下添加，以避免对细胞的生长和存活产生不必要的影响。
3. 细胞的准确选择和应用荧光信号分析需要经验和技能支持，因此可能需要学习其他课程或培训活动，以便更好地完成任务。
六、实验结果正确的观察、检测和记录结果是实验的关键要求。
液泡系和线粒体的活体染色结果应包括液泡和线粒体的数量、亮度、位置和其它相关特征。
差速离心分离线粒体
差速离心法分离线粒体课程名称： 细胞生物学 指导老师： 成绩：__________________ 实验名称： 差速离心法分离线粒体 同组学生姓名： 喻儿一、实验目的和要求（必填） 二、实验内容和原理（必填）三、实验材料与试剂（必填） 四、实验器材与仪器（必填）五、操作方法和实验步骤（必填） 六、实验数据记录和处理七、实验结果与分析（必填） 八、讨论、心得一、实验目的1.学会差速离心方法及活体染色一般方法。
2.掌握鼠肝线粒体的分离与鉴定方法二、实验原理1.差速离心法:在一定的离心场中，大小不一的颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一个均匀悬浮介质中离心一定时间，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同而停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
2.悬浮介质的选择：通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2 的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
离心力 RCF=1.119 ⨯ 10-5 ⨯ r ⨯ n2 （单位：重力常数 g ； r 离心场半径；n 转速）3. 詹纳斯绿活染法鉴定线粒体： 线粒体内的细胞色素氧化酶能使詹纳斯绿染料始终保持在氧化状态而呈现蓝色；而在周围的细胞质内，这些染料被还原成为无色。
在进行线粒体的体外染色时，至少要使材料在詹纳斯绿染液中染色15min 以上，才能放上盖玻片，以便材料经过氧化（即与空气接触）后，线粒体被染色。
活性样品检测的关键环节：整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
三、实验材料与试剂材料：小白鼠肝脏器材：玻璃匀浆器，高速冷冻离心机，普通离心机，剪刀，镊子，小烧杯，离心管，载玻片，盖玻片，滴管，普通光学显微镜，试剂：匀浆介质；詹纳斯绿染色液四、实验步骤I 差速离心法分离线粒体1．小白鼠断颈致死，用75%乙醇消毒外部 皮肤后，剖腹取肝；2．用预冷至0℃的匀浆介质洗肝，干净滤纸 吸干水分后称重；3．往平皿中先加入适量匀浆介质，将肝剪 碎，按每克肝组织加8mL 匀浆介质，加至10mL 玻璃匀浆器中，在冰浴中匀浆；4．待肝组织基本碎裂后，将匀浆液移至10mL 离心管中，平衡后， 4℃下4800rpm 离心15min ，吸取上清液；（染色观察）；5.将1mL 上清液转移至Eppendorf (EP)管 中，4℃，11000rpm(10000g)离心 20min ；(位置)6．转移上清液至新EP 管中；7．沉淀以适量匀浆介质悬浮制成线粒体悬 浮液。
细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离
实验二细胞核,叶绿体,线粒体的分级分离与观察一、实验目的：1、了解细胞器分离的一般原理和方法；2、掌握分级分离的原理和注意事项;3、观察叶绿体的自发荧光和次生荧光.4、线粒体的分离方法以及詹纳斯绿B超活染色的方法.二、实验原理：将组织匀浆后悬浮在等渗介质中进行差速离心,是分离细胞器的常用方法.细胞组分的分离在等渗溶液〔0.35mol/L Nacl或0.4mol/L蔗糖溶液〕中进行.●将匀浆液在1000r/min的条件下离心2 min以全除组织残渣和未破碎的细胞.●在3000r/min的条件下离心5 min,即可获得沉淀的叶绿体〔混有部分细胞核〕.●上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.三、实验步骤：第一部分细胞核与叶绿体的分离与观察1、选取新鲜的菠菜叶,洗净搽干后去除叶梗和粗脉,称30g于150ml0.35mol/L Nacl溶液中,放入组织捣碎机<间歇>；低速匀浆1min；间歇匀浆.2、将匀浆用6层纱布过滤于烧杯中.3、每小组取滤液4 ml在1000r/min的条件下离心2 min；4、取上清液在3000r/min的条件下离心5 min；沉淀即为叶绿体〔混有部分细胞核〕；上清夜转入干净的离心管中用于线粒体分离.5、叶绿体观察：➢将沉淀用0.35mol/L Nacl悬浮.〔浓度不要太高,不利于观察〕➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,加盖玻片即可在普通光学显微镜和荧光显微镜下观察；➢取叶绿体悬液一滴于载玻片上,再滴加一滴0.01%吖啶橙染料,加盖玻片即可在荧光显微镜下观察.第二部分线粒体的分级分离以及超活染色观察6 第4步获得的上清液在高速冷冻条件下10000rpm/min分离10分钟,所得沉淀即为线粒体,可反复离心一次.收集沉淀涂片,用1%詹纳斯绿B染色5-10分钟,线粒体为蓝绿色圆形颗粒.实验过程最好在0-4o C的条件下进行；如果在室温下,要迅速分离和观察.〔教师演示示X〕第三部分人口腔黏膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察一、实验目的：观察活细胞内线粒体的形态、数量与分布.二、实验原理：线粒体是细胞进行呼吸作用的场所,其形态和数量随不同物种、不同组织器官和不同生理状态而发生改变.詹纳斯绿B是一种毒性较小的碱性染料,可专一性的对线粒体进行超活染色,这是由于线粒体内的细胞色素氧化酶系的作用,使染料始终保持氧化状态〔即有色状态〕,呈蓝绿色；而线粒体周围的细胞质中,这些染料被还原为无色的色基〔即无色状态〕.三、实验步骤：1、取清洁载玻片,滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液；2、用牙签宽头在口腔颊黏膜处稍用力刮取上皮细胞,将刮下的黏液状物放入载玻片的染液中,染色10-15 min；〔作用,染液不可干燥,必要时加滴染液〕；3、盖上盖玻片,置显微镜下观察.四、实验结果：在低倍镜下,选择平展的口腔上皮细胞,换高倍镜观察,可见扁平状上皮细胞内,核周围的胞质中,分布着一些被染成蓝绿色的颗粒状或短棒状的结构,即为线粒体.实验作业：3 绘口腔上皮细胞示线粒体形态与分布.。
观察线粒体实验报告
观察线粒体实验报告观察线粒体实验报告线粒体是细胞中的一个重要细胞器，它在细胞内扮演着能量生产的关键角色。
为了深入了解线粒体的结构和功能，我们进行了一系列的线粒体实验观察。
本报告将详细介绍我们的实验过程和观察结果。
实验一：线粒体的形态观察我们首先使用显微镜对线粒体进行了形态观察。
通过细胞染色和显微镜放大，我们清晰地观察到了细胞质中的线粒体。
线粒体呈椭圆形或长圆形，大小约为1-10微米。
我们还发现，线粒体表面覆盖着一层光滑的膜，使其在细胞内具有良好的运动能力。
实验二：线粒体的功能观察为了进一步了解线粒体的功能，我们进行了线粒体的呼吸作用实验。
通过添加适当的底物和试剂，我们观察到线粒体产生了大量的ATP分子，这是细胞内能量的主要来源。
这表明线粒体在细胞内起着重要的能量转换作用。
实验三：线粒体与细胞凋亡的关系线粒体在细胞凋亡过程中也发挥着重要作用。
我们进行了线粒体与细胞凋亡关系的实验观察。
通过添加特定的药物，我们诱导了细胞凋亡，并观察到线粒体内的某些蛋白质释放到细胞质中。
这些蛋白质的释放触发了一系列的细胞凋亡信号，导致细胞死亡。
这个实验结果进一步证明了线粒体在细胞凋亡中的重要性。
实验四：线粒体与遗传疾病的关系线粒体还与一些遗传疾病的发生有关。
我们进行了一项实验，观察了线粒体DNA的突变对细胞功能的影响。
通过引入突变的线粒体DNA到细胞中，我们观察到细胞的能量代谢受到了明显的影响，导致细胞功能异常。
这一实验结果揭示了线粒体突变与一些遗传疾病的关联。
实验五：线粒体与老化的关系线粒体在细胞老化过程中也扮演着重要角色。
我们进行了一项实验，观察了线粒体功能与细胞老化之间的关系。
通过测量线粒体的呼吸作用和ATP产量，我们发现随着细胞的老化，线粒体功能逐渐下降，导致细胞能量供应不足。
这一实验结果进一步证明了线粒体在细胞老化中的重要性。
总结：通过一系列的线粒体实验观察，我们深入了解了线粒体的结构和功能。
线粒体不仅在细胞能量代谢中起着重要作用，还与细胞凋亡、遗传疾病和细胞老化等过程密切相关。
实验四线粒体和液泡系的超活染色与观察
活体染色是指对生活有机体的细胞或组织能着色但又无 毒害的一种染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些 结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何理化变化以 致引起细胞死亡。
要想获得体外活体染色成功，我们应注意： （1）保证所取材料的活性。通过控制温度和加入缓冲
液实现。
（2）保证染色剂的状态。可以通过现用现配和棕色试 剂瓶保存来保证染色剂的化学性质不发生变化；用浓度 较低的染色剂来保证对细胞无毒或伤害较小。
⑵ 用双面刀片把小麦幼苗根尖（约1～2cm长）小心切一 纵切面，放入载玻片上的1/3000中性红染液滴中，染色 5～10min。
⑶ 吸去染液，滴一滴Ringer液，盖上盖玻片，并用镊子 轻轻地下压盖玻片，使根尖压扁，利于观察。
⑷ 在高倍镜下，先观察根尖部分的生长点的细胞，可见 细胞质中散在很多大小不等的染成玫瑰红色的圆形小泡 ，这是初生的幼小液泡。然后，由生长点向延长区观察 ，在一些已分化长大的细胞内，液泡的染色较浅，体积 增大，数目变少。在成熟区细胞中，一般只有一个淡红 色的巨大液泡，占据细胞的绝大部分空间，将细胞核挤 到细胞一侧贴近细胞壁处。
（三）材料
人口腔上皮细胞 小麦根尖细胞
四、实验步骤
（一）线粒体的超活染色与观察 1、线粒体是细胞进行呼吸作用的场所，其形态和
数量虽不同物种、不同组织器官和不同的生理 状态而发生变化。 1）人口腔粘膜上皮细胞线粒体的超活染色与观察 ⑴取清洁载玻片放在37℃恒温水浴锅的金属板 上，滴2滴1/5000詹纳斯绿B染液。
小麦根尖液泡系（1）
小麦根尖液泡系（2）
六．实验中的注意事项
1、詹姆斯绿B溶液现用现配，以保持它的充 分氧 化能力。
2、实验中速度要快，以免组织细胞死亡。
细胞器的观察
实验四细胞器的观察【目的要求】1、掌握光镜下线粒体、高尔基复合体和中心体等细胞器的形态和分布2、初步掌握某些细胞器的活体染色方法。
【实验原理】在真核细胞中存在着多种具有特殊形态结构和功能的细胞器,如线粒体、高尔基复合体、内质网、溶酶体、中心体、微管、微丝和核糖体等。
这些细胞器中有的经过特殊的染色后在光镜下就可被观察到，而有些细胞器由于体积非常微小只有在电镜下才可见到。
在光镜下可见线粒体常呈颗粒状、棒状或弯曲的线状，如图4-1。
线粒体的形态和数量随不同生物、不同组织及不同生理状态而发生变化，例如肝细胞、胰细胞的线粒体通常呈线状；成熟的卵细胞内线粒体呈颗粒状；肾细胞内的线粒体常呈棒状。
线粒体含有细胞色素氧化酶系统，当用Janus Green B（詹纳斯绿B）专一性地对线粒体进行活体染色时，其线粒体内膜和嵴膜的细胞色素氧化酶可使Janus Green B染料始终处于氧化状态而呈蓝色，而在线粒体周围的细胞质中的Janus Green B被还原呈无色。
用特殊的固定液染色处理动物的组织或细胞后，也可显示出线粒体的形态。
线粒体的组成成分主要是脂蛋白，脂类又以磷脂为主。
由于线粒体中蛋白质、磷脂含量很高，故有大量的羧基和磷酸基阴离子基因，使带阳离子的铁、苏木精很容易与其结合而着色，使线粒体显示出来。
高尔基复合体用硝酸钴固定后，再经硝酸银染粒浸染制成永久切片，由于组成高尔基复合体的物质具有还原银盐的能力，可使其呈现棕褐色沉淀，因而能显示出高尔基复合体的形态和位置。
【器材与试剂】器材：光学显微镜、载玻片、盖玻片、吸管、小镊子、吸水纸。
材料：人口腔上皮细胞、大鼠肝脏切片、兔脊神经节切片、马蛔虫子宫切片、小白鼠。
试剂：中性红；詹纳斯绿染液。
试剂的配制：⑴中性红-詹纳斯绿染液① 5.18%詹纳斯绿饱和溶液3滴100%詹纳斯绿饱和溶液5ml中性红(1:15000) 1ml② 5.65%中性红饱和水溶液20~30滴100%酒精5ml将①和②液混合在一起，即配成所需的中性红-詹纳斯绿染液。
细胞生物学试验指导
细胞生物学实验指导细胞生物学的发展总是依赖于技术和实验手段的进步，所以学习细胞生物学的技术和方法至关重要。
实验一普通显微镜及其使用（装片观察）一、目的要求：1、掌握显微镜的构造、油浸系的原理、使用方法、保护要点。
2、参观了解其他各类显微镜。
二、材料：普通光学显微镜及其他显微镜、细菌标本片、香柏油、二甲苯、擦镜纸。
三、方法和步骤：1、介绍普通光学显微镜的构造机械部分：镜座、镜臂、镜筒、转换器、载物台、调焦螺旋。
光学部分：接目镜、物镜、反光镜、聚光器。
2、油镜的原理及使用方法原理：油镜头的晶片细小，进入镜中的光线亦少，光线经聚光器，通过载玻片进油镜时，由于空气介质和玻璃介质的折射率不一样，光线因折射而损失，使视野更暗。
在载玻片和油镜之间加上和玻璃折光系数相同的香柏油，光线直接进入镜头，不发生折射，视野明亮，便于观察。
3、如何维护显微镜：机械部分的维护，光学部分的维护。
4、注意事项：（1）观察油镜载片时，先在载片上有菌影的地方滴1-2滴香柏油，然后放载物台中央，眼侧面看，慢慢降低油镜浸入香柏油中，镜头几乎接触标本。
再用左眼在接目镜观察，同时慢慢旋动粗螺旋提起镜筒至能模糊看到物象时，再转动微调螺旋，直至看清晰为止。
注意镜头离开油，就不能看清，重新按刚才的步骤进行。
（2）油镜使用过后，立即用擦镜纸擦拭镜头，如油渍己干，则可用香柏油粘二甲苯擦拭镜头，再用干净擦镜纸擦去二甲苯。
5、观察几种细菌标本片。
6、示教看相差显微镜和荧光显微镜。
四、作业及思考题：1、油镜的原理是什么？2、光线强弱如何调节？与哪些部件有关？实验二、细胞膜的渗透性实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。
实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。
实验用品一、器材50ml烧杯，试管(1〜10cm) ,10ml移液管,试管架。
线粒体的分离与观察一、实验目的1.初步掌握用差速离心
三、实验用品
1.材料：鸡肝脏 2.器材：高速离心机、解剖刀剪、烧杯、冰浴、漏斗、纱布、匀浆器、高压灭菌锅 3.试剂：0.9%灭菌的生理盐水、1%詹纳斯绿B 染液、 0.25mol/L 蔗糖十
盖玻片，镜检。 结果：线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
五、实验报告
1. 分别描述三张涂片的结果(如平均每个视野中所见完整的细胞核数量,完整的 细胞或带有残留细胞质的细胞核的约占多少等)
2. 描述两张线粒体装片的观察结果,根据你的实验结果,你认为所分离的线粒体 的纯度如何?
六、实验建议
1.注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长， 以保持组分生理活性。最好在在0～4℃或冰浴中进行。
2.将匀浆液置于蔗糖溶液上层时要沿管壁小心加入，同时及时离心，以防匀 浆液中的颗粒自然下沉过快，影响后面的离心分层效果。
3.姬姆萨染液应用液要在实验时临时配制，效果较好。过期的应用液不可使用。
差速离心提取鸡肝线粒体流程如下图：
分离细胞核
鸡肝2克匀浆
↓
匀浆过滤
↓
滤液
↓
将滤液2ml覆盖于相同容积的0.34mol/L蔗糖溶液上
↓
1200rபைடு நூலகம்min 离心10min
↓
↓ 沉淀（涂片①自然干燥）
↓ 上清液1
（细胞核及碎片）
↓
洗涤（加0.25mol/L预冷蔗糖溶液 2ml 混匀，2500r/min 离心15min）
上清液
3. 分离物鉴定
(1) 细胞核：取细胞核沉淀1 滴涂片，入甲醇-冰醋酸液固定15min，充分吹 干，滴1滴Gimesa染液染色10min。自来水冲洗，干燥后，镜检。
线粒体的分离及活性测定实验原理及步骤
实验十一线粒体的分离及活性测定线粒体是真核细胞的一个重要细胞器，好氧生物细胞需能的25%以上是靠有氧呼吸供给，而线粒体是细胞内唯一有氧呼吸的场所，因此，人们就一细胞“动力站”之称。
线粒体结构和功能上的研究至今一直是一个非常活跃的领域，本试验在于学会分离线粒体和测定线粒体活力，以高活力的线粒体制剂用于各种目的的研究。
一、仪器与设备：1.冰冻高速离心机，或万转/分离心机。
2.组织捣碎机或匀浆器。
3.冰浴，研钵、漏斗、纱布（尼龙布）、量筒、微量注射器、移液管、试管等。
4.瓦氏呼吸器（氧极普测试系统）。
5.显微镜、冰浴。
6.分光光度计。
二、材料与试剂：1.绝大多数的动植物材料通常都可以制备线粒体，但最好是生活力强，生长旺盛，幼嫩组织为好，如心肌、肝脏、骨骼肌、黄化幼苗、块根、块茎等。
2.TriS-HCl（0.05M，pH7.2）缓冲液。
3.磷酸缓冲液（0.2M，Ph7.2）。
4.提取洗涤液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin，BSA，1mg/ml），EDTA（0.001M），TriS-HCl（0.01M，pH7.2）缓冲液。
5.悬浮液（同试剂4，但不加BSA）。
6.反应液：在1000ml溶液中含有甘露醇（0.35M）、蔗糖（0.25M）、KCl（10ml，pH7.2）、EDTA（0.2mM）、MgCl2（5mM）、TriS-HCl（10mM，pH7.2）。
7.反应底物：α—酮戊二酸 0.4M，ADP 0.06M。
三、线粒体的分离：线粒体在离体条件先很容易受各种因素（物理和化学的）作用而失活，特别是膜的完整性极为重要，因为只有完整的线粒体才能进行有氧呼吸。
所以在分离操作中要掌握以下几个要点：[1].整个过程要保持在低温下（0-4 o C）进行。
[2].要注意分离介质的pH值，pH值应和被采用的材料一致。
[3].捣碎时间要控制得当，或匀浆适度，争取获得更多的完整线粒体。
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察课件
熟酸性强且液泡
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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•2、分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置2h后再染色，比 较
两者着色的差异。
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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线粒体不会亮得那么明显. 因为詹纳斯绿B染色,利用的是氧化线粒体,使得线粒体的能量表现出 来。使得化学能转化成光能,让你发现.放置一段时间后,由于线粒体 失去的活性,所以氧化效果不明显,因而不会亮得那么明显.
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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•3、分离叶绿体时应注意什么问题？
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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分离过程最好在0～4℃的条件下进行；如果 在室温下,要迅速分离和观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
液泡系、线粒体的超活染色与观察 叶绿体的分离与观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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一、实验目的
• 1、观察植物活细胞内液泡系的形态、数量、分布及演进过程 • 2、观察线粒体的形态 • 3、学习超活染色技术 • 4、掌握叶绿体的离心方法以及离心机的使用 • 5、观察叶绿体的形态
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
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• 二、线粒体的超活染色
• 取洋葱鳞茎内表皮细胞和人口腔黏膜上皮细胞，用1/5000的詹那 斯绿B染色15min(注意不可使染液干燥，必要时可再滴加几滴染 液），吸去染液，加一滴Ringer液，盖片观察。
液泡系线粒体的超活染色与观察及叶绿体的分离与观察
植物细胞线粒体实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习使用显微镜观察植物细胞线粒体的形态和分布。
2. 了解线粒体在植物细胞中的功能及其重要性。
3. 培养实验操作技能，提高观察和分析能力。
二、实验原理线粒体是植物细胞中的重要细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为细胞的“动力工厂”。
线粒体具有双层膜结构，外膜光滑，内膜向内折叠形成嵴，线粒体基质中含有与有氧呼吸相关的酶类。
本实验通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，了解其在植物细胞中的分布和形态。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：洋葱鳞片叶、生理盐水、碘液、盖玻片、载玻片、显微镜等。
2. 仪器：显微镜、解剖镜、酒精灯、镊子、剪刀、滴管、吸水纸等。
四、实验步骤1. 准备洋葱鳞片叶：取洋葱鳞片叶，用剪刀将其剪成薄片。
2. 制备临时装片：将洋葱鳞片叶薄片放置在载玻片上，滴加少量生理盐水，用镊子轻轻压扁，盖上盖玻片。
3. 染色：在盖玻片边缘滴加碘液，用吸水纸吸引碘液浸润整个装片。
4. 观察：将装片置于显微镜下，观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体。
5. 记录：记录线粒体的形态、分布和数量。
五、实验结果与分析1. 线粒体形态：观察到的线粒体呈圆形、椭圆形或短棒状，直径约为0.5-1.0微米。
2. 线粒体分布：线粒体主要分布在细胞质基质中，靠近细胞壁，细胞核周围较少。
3. 线粒体数量：每个细胞中观察到10-20个线粒体。
通过观察，我们发现洋葱鳞片叶细胞中的线粒体形态规则，分布均匀，说明线粒体在植物细胞中具有重要作用。
线粒体作为细胞的“动力工厂”，在细胞进行有氧呼吸过程中，将有机物氧化分解，产生能量，满足细胞生命活动的需要。
六、实验结论1. 植物细胞中的线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，为细胞提供能量。
2. 线粒体在植物细胞中的形态和分布具有规律性，对细胞生命活动具有重要意义。
3. 本实验通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，掌握了显微镜的使用方法，提高了观察和分析能力。
七、实验讨论1. 线粒体在不同植物细胞中的形态和分布是否存在差异？2. 线粒体在植物细胞中的功能有哪些？3. 如何提高观察植物细胞线粒体的效果？八、实验反思本次实验中，我们通过观察洋葱鳞片叶细胞中的线粒体，了解了线粒体在植物细胞中的功能及其重要性。
线粒体的提取与观察
线粒体的提取与观察线粒体是细胞中重要的细胞器，存在于绝大多数生活细胞中，它的主要功能是提供细胞内各种物质代谢所需要的能量。
正由于这样，对线粒体膜，呼吸链酶及线粒体DNA等成分的结构，功能以及物理化学性质的研究已经成为细胞生物学研究中的重要课题，所以提取线粒体的技术已经成为线粒体研究中必不可少的手段，线粒体大量存在于代谢旺盛的细胞中，如动物的心肌，肝，肾等器官和组织的细胞中，大量置备线粒体就是从这些器官组织中提取，当所用样品较少时（如电镜和光镜的观察）可采用从组织培养细胞中提取，本实验就是介绍两种材料制备用于光镜观察的线粒体。
一、目的与要求了解提取线粒体的基本原理及其过程，通过光学显微镜的观察了解体外分离的线粒体的一般形态二、基本原理线粒体具有完整的结构，一定的大小和质量，低温条件下在等渗液中破碎细胞，差速离心后，获得线粒体。
经活性染料Janus green B染色，线粒体呈浅蓝色。
三、实验内容1.线粒体的分离提取2. 鼠肝的匀浆制备3. 线粒体的活体染色四、实验步骤（一）动物组织线粒体的分离，提取与观察显微镜检查：将1％Janus green B溶液按1:1比例加入线粒体悬液中,在室温或水浴中染15~20分钟,用吸管吸取一滴线粒体悬液，滴于载玻片上，加盖玻片后，放显微镜下进行观察，线粒体为蓝绿色圆形颗粒。
2.组织培养细胞的线粒体的提取与观察（三）操作中应该注意的问题1.整个操作过程为保证线粒体的完整，应尽量使操作时的环境如温度（0—4℃），pH (7.0左右)保持恒定，同时尽可能短操作时间。
2.组培细胞消化时要特别小心，防止损失或反复。
（损失指细胞脱落到消化液中）。
3.匀浆时，所用的介质一定是等渗缓冲液，常用的有0.25 mol/L蔗糖溶液或生理盐水代替Hank’s液4.匀浆次数依照匀浆器的松紧而定，次数过少，细胞破损不完全，就会影响线粒体产量。
5.所以取2/3上清夜用来制备线粒体是为防止细胞碎片过多影响观察。
线粒体实训报告
一、实训目的本次实训旨在通过实验操作，使学生了解线粒体的形态、结构及其在细胞代谢中的重要作用，掌握观察线粒体的基本方法，并培养学生严谨的实验态度和科学的研究方法。
二、实训时间2023年X月X日至X月X日三、实训地点生物实验室四、实训内容1. 线粒体的制备与观察2. 线粒体形态结构的观察与分析3. 线粒体功能实验五、实训过程1. 线粒体的制备与观察（1）实验材料：新鲜组织样本、生理盐水、线粒体提取液、染色剂、显微镜等。
（2）实验步骤：a. 将新鲜组织样本切成薄片，用生理盐水清洗。
b. 将清洗后的组织片置于线粒体提取液中，进行匀浆处理。
c. 将匀浆液滴于载玻片上，用染色剂进行染色。
d. 将染色后的样品置于显微镜下观察。
（3）观察结果：在显微镜下观察到线粒体呈椭圆形或杆状，具有明显的双层膜结构，内部有基质和嵴。
2. 线粒体形态结构的观察与分析（1）实验材料：新鲜组织样本、生理盐水、线粒体提取液、染色剂、显微镜等。
（2）实验步骤：a. 将新鲜组织样本切成薄片，用生理盐水清洗。
b. 将清洗后的组织片置于线粒体提取液中，进行匀浆处理。
c. 将匀浆液滴于载玻片上，用特定染色剂进行染色。
d. 将染色后的样品置于显微镜下观察，记录线粒体的形态、大小、分布等特征。
（3）观察结果：观察到的线粒体形态多样，大小不一，分布不均，有的聚集在细胞核周围，有的散布在细胞质中。
3. 线粒体功能实验（1）实验材料：新鲜组织样本、生理盐水、线粒体提取液、ATP测定试剂盒、显微镜等。
（2）实验步骤：a. 将新鲜组织样本切成薄片，用生理盐水清洗。
b. 将清洗后的组织片置于线粒体提取液中，进行匀浆处理。
c. 将匀浆液与ATP测定试剂盒混合，进行ATP含量测定。
d. 将样品置于显微镜下观察，记录线粒体的活性。
（3）观察结果：ATP含量测定结果显示，线粒体活性较高，能够产生大量ATP。
六、实训总结通过本次实训，我对线粒体的形态、结构及其在细胞代谢中的重要作用有了更深入的了解。
细胞学实验——精选推荐
目 录1.1.细胞生物学实验细胞生物学实验2.2.实验一实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察3.3.实验二实验二实验二 植物细胞骨架的观察植物细胞骨架的观察4.4.实验三实验三实验三 线粒体的超活染色与观察线粒体的超活染色与观察5.5.实验四实验四实验四 叶绿体的分离与观察叶绿体的分离与观察6.6.实验五实验五实验五 线粒体的分离与观察线粒体的分离与观察7.7.实验六实验六实验六 酸性磷酸酶的显示方法酸性磷酸酶的显示方法细胞生物学实验细胞生物学是当前生命科学中核心学科之一，也是重要的专业基础课，其理论与实验技术已广泛地用于研究细胞的形态结构、基因表达与克隆、病毒、细菌、胚胎发育、远缘杂交、人类疾病的发病机制、药物机理等领域，随着分子生物学的研究渗入，分子细胞生物学也得到了突飞猛进的发展。
目前许多综合大学、农业、医学及药科大学把细胞生物学作为本科生和研究生的必修课或基础理论课，同时也开设了专门的细胞生物学实验课，学生们通过实验，进一步地加深了对理论课的理解，也为今后的专业实验课和毕业论文实验奠定了基础。
本讲义精心选择了细胞生物学中的常规实验，作为教材面向全院本科生进行讲授。
实验一实验一 细胞膜的通透性观察细胞膜的通透性观察一、实验目的1.1.了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
了解细胞膜对物质通透性的一般规律。
2.2.了解溶血现象及其发生机制。
了解溶血现象及其发生机制。
二、实验原理细胞膜是细胞与环境进行物质交换的选择通透性屏障。
它是一种半透膜，可选择性控制物质进出细胞。
各种物质出入细胞的方式是不同的，水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。
渗透作用是细胞膜的主要功能之一。
将红细胞放在低渗盐溶液中，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质中，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。
线粒体分离试方法
线粒体分离试方法线粒体的分离实验方法有多种，以下是其中两种常见的方法：方法一：1.取苗约5克，加三倍体积0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液，在预冷的研钵内快速研磨成匀浆。
2.8层纱布过滤，滤液经3000 g 4℃离心10 min，去除杂质。
3.上清液再用10000 g 4℃离心10 min，沉淀为线粒体。
4.沉淀用2ml 0.25 mol/L蔗糖-提取缓冲液重悬，同上离心一次，弃上清。
5.线粒体沉淀保存用0.3 M甘露醇重新悬浮。
6.吸滴线粒体重悬液于载波片上，再加滴詹纳斯绿染色液，室温下静置染色15 min，用显微镜观察，线粒体呈蓝绿色，小棒状或哑铃状。
方法二：1.将过夜酵母培养物无菌转移到两个15ml离心管中。
2.在4℃下以500g离心10分钟。
3.小心去除上清液，不要干扰沉淀。
4.使用微量移液器在1ml氯化钠（0.9%）中小心冲洗沉淀。
5.使用微量移液器丢弃离心管中的氯化钠。
6.将沉淀重悬于1ml冰冷的裂解缓冲液中，并使用微量移液器充分混合。
7.在4℃的摇床上孵育10分钟。
8.在4℃下以1000g离心10分钟，小心去除上清液。
9.将细胞沉淀重悬于1.5ml冰冷的破碎缓冲液中，并使用针头的钝端完成细胞破碎。
10.将裂解物在4℃下以1000g离心10分钟。
11.将上清液转移到新鲜的15mL管中，并混合从步骤7中获得的上清液。
12.在4℃下以6000g离心10分钟并弃去上清液。
13.用线粒体储存缓冲液清洗颗粒。
14.在4℃下以6000g离心20分钟。
这两种方法的主要步骤包括细胞或组织的匀浆、离心、去除杂质和线粒体的沉淀及重悬等。
在实际操作时，可以根据实验的具体需求和条件选择合适的方法，并严格按照步骤进行操作，以获得高质量的线粒体样本。
实验四 细菌的划线分离与培养
实验四细菌的划线分离与培养一、实验前要说明的几点问题点名,查看学生出勤情况。
总结上次作业，提出作业中出现的问题并讲解。
二、板书部分（一）目的要求1.掌握需氧菌分离培养的基本要领。
2.了解厌氧菌的分离培养原则及方法。
（二）实验内容1.用普通琼脂平板做一次划线分离培养。
2.用普通肉汤做一管大肠杆菌的移植培养。
3.用普通琼脂斜面做一管金黄葡萄球菌的移植培养。
4.用划线法进行真菌的分离培养（示教）（三）作业1.为什么要进行细菌的分离培养？2.进行分离培养应注意哪些事项？3.细菌分离培养的方法有哪些？（重点叙述平板划线法）4.叙述真菌的划线分离方法。
三、实验内容主要内容有分离培养及目的、注意事项、分离培养的方法、真菌的培养方法、患病动物病料中分离培养、钓菌、移植。
1.什么是分离培养及目的：分离培养是细菌学检验的基本技术之一。
分离培养之目的，在于从被检材料中由多种细菌里分离出一种细菌。
2.注意事项：1）分离培养前应考虑所分离的细菌的特性，选择适合其生长需要的培养基（需氧还是厌氧、营养的要求高还是不高、培养温度等）等。
例如：链球菌在普通琼脂不长，要加血清或血液。
大肠杆菌和葡萄球菌要求较低，普通的培养基即可生长。
2）防止污染。
分离培养的整个过程要严格无菌操作。
培养基和一切用具必须彻底灭菌；操作时必须靠近火焰；操作完毕后，禁止再让培养基接触外界空气。
3）防止接种器械过热，很容易杀死分离培养的细菌，如接种环在烧灼灭菌后，不能立即钓取细菌材料，应在酒精灯旁凉凉；另外还应注意防止已钓取菌料的接种环，不慎通过火焰而将细菌杀死。
4）初代分离时发现有多种细菌，观察找到目的菌落，再拿一肉汤培养基纯化培养。
然后在接种实验动物，作成凝集抗原，做血清学鉴定，。
还可以反过来做抹片染色观察。
3.分离培养的方法：主要分需氧菌的分离培养方法、厌氧菌的分离培养方法和需要CO菌的培养分离方法。
1）需氧菌的分离培养法（1）平板划线法：划线后有单个菌落，便于观察菌落的形态、溶血性等。
细胞生物学实验指导(植物版)
细胞生物学实验实验一不同显微镜的使用及细胞一般形态结构的观测[实验目的]通过本实验，使学生巩固普通光学显微镜的使用，学习相差显微镜、暗视野显微镜和荧光显微镜的使用方法，学习显微测量及显微摄影的操作方法，增强对细胞的形态和真实大小的感性认识。
通过本实验操作，要求学生掌握细胞形态结构的基本观测方法与技术，为进一步的细胞生物学研究打好基础。
[实验原理]应用显微镜的成像原理(详见翟中和等主编《细胞生物学》，第三章第一节)，同时借助显微镜的镜台测微尺和目镜测微尺，两尺配合使用，进行测量和运算，观察细胞形态，得出细胞的大小。
该实验完成需时6学时。
[实验材料、试剂和仪器]一、仪器普通光学显微镜、相差显微镜、暗视野显微镜、荧光显微镜、显微拍摄系统、37℃温箱、镜台测微尺、目镜测微尺等。
二、材料洋葱根尖切片标本，念珠藻永久装片，兔肝细胞标本，夹竹桃花丝毛细胞，人口腔上皮细胞等。
三、试剂生理盐水，10µg/mL罗丹明123染液（溶于甲醇，避光于4℃保存）[实验步骤]一、暗视野显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。
用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。
2、将上述装片置于显微镜载物台上，在10×物镜下找到夹竹桃花丝毛细胞清晰的图像。
3、换上暗视野聚光器，调节至最佳位置，通过聚光器上的调中螺旋调节聚光器的中心位置，得到最好的暗视野图像效果。
4、观察夹竹桃花丝毛细胞内部的显微结构和细胞质环流现象，并拍照。
5、换用高倍物镜观察时，要换用与高倍镜相匹配的暗视野聚光器，重复以上调节步骤。
二、相差显微镜观察夹竹桃花丝毛细胞1、取一张清洁的载玻片，滴上一滴生理盐水。
用镊子轻轻夹下一根夹竹桃花丝，置生理盐水中，盖上盖玻片，略微压片，用滤纸条吸去盖玻片四周多余的水分。
2、将装片置于载物台上，在明视野用聚焦螺旋聚焦样品，将观察到的夹竹桃花丝毛细胞移到视野中央。
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实验八线粒体的分离与观察
实验目的
用差速离心法分离动、植物细胞线粒体。
实验原理
线粒体(mitochondria)是真核细胞特有的，使能量转换的重要细胞器。
细胞中的能源物质——脂肪、糖、部分氨基酸在此进行最终的氧化，并通过耦联磷酸化生成ATP，供给细胞生理活动之需。
对线粒体结构与功能的研究通常是在离体的线粒体上进行的。
制备线粒体采用组织匀浆在悬浮介质中进行差速离心的方法。
在一给定的离心场中(对于所使用的离心机，就是选用一定的转速)，球形颗粒的沉降速度取决于它的密度、半径和悬浮介质的粘度。
在一均匀悬浮介质中离心一定时间内，组织匀浆中的各种细胞器及其它内含物由于沉降速度不同将停留在高低不同的位置。
依次增加离心力和离心时间，就能够使这些颗粒按其大小、轻重分批沉降在离心管底部，从而分批收集。
细胞器中最先沉淀的是细胞核，其次是线粒体，其它更轻的细胞器和大分子可依次再分离。
悬浮介质通常用缓冲的蔗糖溶液，它比较接近细胞质的分散相，在一定程度上能保持细胞器的结构和酶的活性，在pH7.2的条件下，亚细胞组分不容易重新聚集，有利于分离。
整个操作过程应注意使样品保持4℃，避免酶失活。
线粒体的鉴定用詹纳斯绿活染法。
詹纳斯绿B(Janus green B)是对线粒体专一的活细胞染料，毒性很小，属于碱性染料，解离后带正电，由电性吸引堆积在线粒体膜上。
线粒体的细胞色素氧化酶使该染料保持在氧化状态呈现蓝绿色从而使线粒体显色，而胞质中的染料被还原成无色。
I．鸡肝线粒体的分离
实验用品
一、材料
鸡肝脏
二、试剂
1. 生理盐水
2．1％詹纳斯绿B染液，用生理盐水配制。
3. 0. 25 mol／L蔗糖+0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph7.4）：
0.1 mol／L三羟甲基氨基甲烷(Tris) 10 ml
0.1 mol／L盐酸8.4 ml
加重蒸水到100 ml
加蔗糖到0.25 mol／L。
蔗糖为密度梯度离心用D(+)蔗糖
4. 0.34 mol／L蔗糖＋0.01mol／L Tris-盐酸缓冲液（ph 7.4）
5. 固定液：甲醇-冰醋酸(9：1)
6. 姬姆萨染液：Giemsai粉0.5g，甘油33 ml，纯甲醇33 ml。
先往Giemsa粉中加少量甘油在研钵内研磨至无颗粒，再将剩余甘油到入混匀，56℃左右保温2h令其充分溶解，最后加甲醇混匀，成为姬姆萨原液，保存于棕色瓶。
用时吸出少量用1/15 mol／L 磷酸盐缓冲液作10～20倍稀释。
1/15 mol／L 磷酸盐缓冲液作(pH6.8)．
1／15 mol／L KH2PO450 ml
1／15 mol／L Na2 HPO450 ml
三、器材
高速离心机、解剖刀剪、小烧杯、冰浴、漏斗、尼龙织物、玻璃匀浆器。
实验方法
1. 制备大属肝细胞匀浆。
实验前鸡空腹12h，击头处死，剖腹取肝，迅速用生理盐水洗净血
水，用滤纸吸干。
称取肝组织2g，剪碎，用预冷到0~4℃的0．25 mol／L缓冲蔗糖溶液洗涤数次。
然后在0～4℃条件下，按每克肝加9ml冷的0.25 mol／L缓冲蔗糖溶液将肝组织匀浆化，蔗糖溶液应分数次添加，匀浆用双层尼龙织物过滤备用。
注意尽可能先充分剪碎肝组织，缩短匀浆时间，整个分离过程不宜过长，以保持组分生理活性。
2. 差速离心。
先将9ml 0.34 mol／L缓冲蔗糖溶液放入离心管，然后沿管壁小心地加入9ml 肝匀浆使其覆盖于上层。
用冷冻控温高速离心机按图10-1顺序进行差速离心。
3. 分离物鉴定。
(1) 细胞核：取细胞核沉淀一滴涂片，入甲醇－冰醋酸液固定15min，充分吹干，滴姬姆
萨染液(原液10~20倍稀释)染色10min。
自来水冲洗，吹干，镜检。
结果：细胞核紫红色，上面附着的少量胞质为浅蓝色碎片。
(2) 线粒体：取线粒体沉淀涂片(注意勿太浓密)，不待干即滴加1％詹纳斯绿B染液染20min
覆上盖玻片，镜检。
线粒体蓝绿色，呈小棒状或哑铃状。
鸡肝匀浆700×g离心10min
沉淀上清液
洗涤
10 ml预冷的0.25mol／L 缓冲蔗糖溶液2次，
每次1000×g离心15 min 合并
沉淀上清液
（细胞核及质膜碎片）
10000 ×g 离心10 min
沉淀上清液
（线粒体）
洗涤
加10 ml预冷的0.25mol／L 蔗糖溶液2次，
每次1000×g离心15 min
沉淀上清液
（纯化的线粒体）
图10-1 差速离心顺序图
实验注意事项
如果使用不带冷冻控温的普通高速离心机操作，应尽量缩短操作时间、注意样品的冷冻，保持其生理活性。
作业
将线粒体沉淀作一涂片，用姬姆萨染色，检查是否混杂细胞核和胞质碎片，估计分离所得线粒体的纯度。
根据你的实际体会，写出操作注意事项及改进方法。
思考题
1. 分离介质0.25 mol／L及0.34 mol／L缓冲蔗糖溶液哪一种在下层?有什么作用?
2. 分离出的线粒体立即用詹纳斯绿B染色和放置室温2h后再染色，比较二者着色的差异。