5第五讲分子克隆载体共69页文档
大肠杆菌分子克隆载体 PPT课件
大肠杆菌分子克隆载体
一、E.coli克隆载体的种类
1. 质粒载体—复制起点来自一些天然质粒。 2. 噬菌体载体—λ，P1和M13、fd载体，复制 起点来自噬菌体。 3. COS质粒载体—质粒载体中插入λcos片段， 以利于体外包装 4.噬粒载体（phagemid）—有质粒和M13、fd 的复制起点，以质粒或噬菌体方式复制。
6) λ载体的种类
i. 插入型—即将外源DNA直接插入已构建载体中，如 λgt11，可以插入长达7 Kb的DNA。这类载体被限制酶 切成左右臂。 ⅱ.取代型—即利用一段外源DNA去取代载体中的一段 DNA，而这段DNA常含有一定的标记基因。这类载体 常被限制酶切为三段：左臂、隔离段和右臂。 * 有的取代型λ载体亦可用作插入型载体,如Charon 4A
ⅲ. 多克隆位点集中排列，有利于克隆片段的物理图谱的
绘制。 除上述三个特点外，pUC系列载体还可用于表达外源 基因 （LacZα启动子）。
pBS载体的结构
pBS-SK(-)
T7
Plac
T3
pBS-KS(-)
Plac
LacZα ori
F1(-)
pBS
(3.0 kb) Ampr
ori
三. 噬菌体载体
二、质粒与质粒载体
1. E．coli的质粒种类
1) colE1因子（大肠杆菌素因子）—多数不能进行接 合转移DNA，属高拷贝松弛型。 2) R因子（抗药性因子） 可接合转移DNA，属低拷贝 严紧型， 质粒较大，操作不便 3) F因子（性因子）
2.质粒的特点
1) 质粒DNA复制与染色体复制无关 2) 质粒DNA以超螺旋形式存在 3) 质粒DNA可以接合转移 4) 质粒的不相容性和不相容群 5) 质粒DNA的消除—化学和物理法(吖啶染料， EtBr，高温等) 6) 质粒的整合—F因子又可整合到E.coli染色体中
分子克隆技术讲解课件
pUC19
pUC18 和 pUC19
小、高拷贝数, 长2686 bp 只有多克隆位点(MCS)排列 方向不同pUC18/19 含有: (1) pMB1 复制子rep (来自 pBR322)，因缺失了rop 基因和在pMB1的 rep 复制子
单个位点突变而导致了高拷贝数; (2)编码 beta-内 酰胺酶的bla基因，赋予对氨苄青霉素的 抗性 (来自 pBR322)，这个基因上有两个点突变， 因而不同于pBR322的 bla基因; (3) lac 操作元的区域
pUC19图
pBluescript II系列
均为2961 bp 长，用于DNA 克隆、双脱 氧 DNA 测序、体外诱变和在简单体系中 体外转录。 pBluescript II SK 和 KS 这两 个载体只有lacZ基因中的多克隆位点的方 向不同。
pBluescript II载体上的重要位点
Lambda噬菌体唯一切点
Lambda噬菌体载体
cos质粒
是lambda噬菌体和质粒的杂种，其优点 是可以用来插入较大的DNA片段，再转 入细菌。
cos质粒 载体
一个典型的质粒克隆技术涉及5步
1) 用限制性内切酶消化 DNA 样品 2)用限制性内切酶消化 质粒DNA 3) 连接样品DNA和质粒DNA的消化产物
pUC系列质粒
是2.7Kb的双链DNA质粒，有一个复制起点，一 个氨苄青霉素抗性基因和一个多克隆位点，多 克隆位点处于表达LacZ基因产物-β-半乳糖苷 酶的氨基端片段，用pUC质粒转化LacZ基因有 突变的大肠杆菌株（M15）时，因为由质粒表 达的α－肽补充了大肠杆菌却失的α－肽，所 以恢复了分解半乳糖的能力。在加入IPTG和Xgal的培养基上，长出蓝色克隆。如果在多克隆 位点内插入外源DNA，由于它破坏了α－肽的 表达，因而在加入IPTG和X－gal的培养基，不 能长出蓝色克隆，这就是所谓的蓝白筛选。
分子克隆技术实验讲义(最终版)
分子克隆技术实验讲义黑龙江大学生命科学学院2016年3月甜菜M14品系BvM14-glyI基因的克隆与鉴定一、实验目的1、熟悉和了解目的基因克隆与鉴定的过程和方法。
2、学习和掌握质粒、T载体的特点。
3、学习和掌握TA克隆的连接体系及操作要点。
4、学习和掌握XcmⅠ酶切制备T载体的过程及方法。
5、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原理和方法。
6、学习并掌握热激法转化技术的原理和操作步骤。
7、学习并掌握重组子鉴定和筛选的原理及蓝白筛选的原理和方法。
8、学习并掌握碱法小量制备质粒DNA的原理及操作步骤。
二、相关知识（一）T载体的制备pMD18-T Vector是一种高效克隆PCR产物（T-A Cloning）的商业化专用载体，由pΜC 18载体改建而成。
在pΜC 18多克隆位点处的XbaⅠ和SalⅠ识别位点之间插入了EcoRⅤ识别位点，用EcoRⅤ进行酶切反应后，再左两侧的3′端添加“T”而成，可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
相关知识点：（1）质粒的提取；（2）酶切；（3）PCR等。
（二）DNA的重组与连接（PCR产物的克隆）把DNA片段从某一类型的载体无性繁殖到另一类型载体中，例如从某种质粒克隆到另一种质粒，这个过程称为亚克隆。
所谓重组，就是把外源目的基因“装进”载体的过程，即DNA的重新组合。
为了将目的基因重组于载体分子中，需要将载体DNA和目的基因分别进行适当处理，一般采用内切酶法将载体DNA分子切割成可与外源基因连接的线性分子，使其与相同酶切过的载体分子相互连接，彼此成为配伍末端（compatible end），以产生末端连接。
现在一些生物公司也开发了针对不同插入DNA片段的专用载体，如专门用于克隆PCR产物的载体，大大方便了实验操作。
相关知识点：（1）克隆与亚克隆；（2）DNA重组；（3）内切酶；（4）粘性末端与平末端；（5）连接酶；（6）连接酶的分类及功能等。
（三）大肠杆菌感受态细胞的制备外源基因与载体在体外连接成重组体DNA分子后，需将其导入受体细胞进行扩增和筛选，得到大量、单一的重组体分子，这就是外源基因的无性繁殖，或称为克隆。
克隆载体-精品
转移特征： 分转移性和非转移性两个特征
命名规则： pUC19
“p”表示质粒（plasmid）
“UC”表示发现或构建该质粒的作者或实验室名称
“19”表示该质粒的实验编号
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质粒的生物学特性
1. 寄生性，质粒的宿主范围很广 2. 稳定性 3. 自主复制性，质粒的拷贝数多 4. 传递性 5. 表型效应 6. 可消除性 7. 重组性 8. 分子量较小 9. 不相容性，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同
5. Phagemid载体
一类由噬菌体功能片段和质粒构建的复合载体
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I
细菌质粒 载体
II
噬菌体 载体
III
柯斯质粒 载体
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I.细菌质粒载体
概念： 质粒是细菌细胞内独立于细菌染色体而自然存在的、 能自我复制、易分离和导入的环状双链DNA分子
质粒是基因工程中最常用的运载体 而最常用的质粒是大肠杆菌的质粒
质粒的复制能在宿主细胞外完成吗？ 质粒的存在对宿主细胞有无影响？
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分类：
F质粒（F因子或性质粒）
R质粒（抗药性因子）
Col质粒（大肠杆菌素因子）
复制类型： “严紧型”的低拷贝复制质粒（拷贝数少，为1-5个） 与“松弛型”高拷贝复制质粒的（拷贝数多，可达10-200个拷 贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。
一个寄主细胞系中稳定地共存的现象
质粒能够“友好”地“借居”在宿主细胞中。一般来说，质 粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性的作用。但是，质粒的 复制则只能在宿主细胞内完成
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质粒载体的修饰改造
分子克隆载体
分子克隆载体（vector）载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA 重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
重组DNA 技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
载体（vector）是指运载外源DNA有效进入受体细胞内的工具。
载体同外源DNA在体外重组成DNA重组分子，在进入受体后形成一个复制子，即形成在细胞内能独自进行自我复制的遗传因子。
因此，作为载体应该满足以下几方面的要求：①有某种限制酶的一个切点，最好是有许多种限制酶的切点，而且每种酶的切点只有一个；②外源DNA插入后不影响载体在受体细胞中进行自我复制，载体应对受体细胞无害，以及载体能接纳尽可能大的外源DNA片段；③有利于选择的标记基因，可以很方便地知道外源DNA已经插入，以及把接受了载体的受体细胞选出；④具有促进外源DNA表达的调控区。
重组DNA技术中最常用的载体有质粒、噬菌体λ，柯斯质粒（cosmid）和噬菌体M13。
它们的受体细胞都是大肠杆菌。
这四种载体的大小和结构尽管各不相同，但它们的共同特点是：①都能在大肠杆菌中自主复制，而且能连同所带的外源DNA一起复制；②都很容易同细菌DNA分开并加以纯化；③都有一段DNA对于它们自身在细菌中的增殖不是必需的。
因此，外源DNA可以插入这一段DNA中，或是置换这一段DNA而不影响载体的复制。
根据这一特点，载体又可分成插入型和置换型两大类。
质粒能通过细菌间的接合由一个细菌向另一个细菌转移，可以独立复制，也可整合到细菌染色体DNA中，随着染色体DNA的复制而复制。
载体可以分为：克隆载体、表达载体及穿梭载体。
1.克隆载体(cloning vector):通常采用从病毒、质粒或高等生物细胞中获取的DNA作为克隆载体，在载体上插入合适大小的外源DNA片段，并注意不能破坏载体的自我复制性质。
分子克隆载体
第三章 分子克隆载体第一节 分子克隆载体如果只有基因而没有负责运载它的载体，则基因就不可能发挥作用。
基因工程载体决定了外源基因的复制、扩增和表达。
载体的本质DNA。
载体（vector）就是指携带外源DNA片段进入宿主细胞进行扩增或表达的工具。
目前常用有载体有很多种，它们分别由从细菌质粒、噬菌体DNA、病毒DNA分离出的元件组装而成。
它们可分为克隆载体和表达载体，表达载体又分胞内表达和分泌表达载体。
从表达所用的受体细胞，又可分为原核细胞和真核细胞载体。
从功能上又可分为测序载体、克隆-转录载体和基因调控报告载体等多功能载体。
1.1 克隆载体1.1.1 克隆载体具备的条件①载体都能携带外源DNA片段(基因)进入受体细胞，或停留在细胞质中自我复制，或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制。
②载体都具有合适的筛选遗传标记。
③载体都具有供外源基因插入的限制性核酸内切酶位点，即多克隆位点。
④载体都必须是安全的，不应含有对受体细胞有害的基因，并且不会任意转入除受体细胞以外的其他生物细胞，尤其是人的细胞。
⑤载体本身的分子量都比较小，可容纳较大的外源基因片段。
⑥载体在细胞内的拷贝数要高，方便外源基因在细胞内大量扩增。
⑦载体在细胞内稳定性要高，保证重组体稳定传代而不易丢失。
⑧载体的特征都是充分掌握的，包括它的全部核苷酸序列。
克隆载体在基因工程中占有十分重要的地位，目的基因能否有效转入受体细胞，并在其中维持和高效表达，在很大程度上取决于克隆载体。
基因工程是随着克隆载体系统的建立才发展起来的。
原核生物基因工程之所以起步早，发展快，成果大，就是因为最早建立了适用于原核生物的克隆载体系统，并且至今已建立了种类繁多的用于原核生物的大量克隆载体。
近十年来，植物基因工程所发展，同样是因为成功地构建了适用于植物的一系列的克隆载体。
因此，国内外把构建新的克隆载体始终作为基因工程基础研究的优先项目，构建的克隆载体可以申请专利保护。
5 第五讲 分子克隆载体
作为克隆载体的DNA分子具备的条件： 1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞； 2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）； 4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因； 5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
构建质粒载体的基本原则
5 在能达到预期目的的情况下，构建过程要 力求简单。
构建质粒克隆载体的基本策略
1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受 体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克 隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝 数。 2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源 DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点 应尽可能多。
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。 含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。 将质粒pSF124中含ampr 基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr 基因的DNA片段同含ColE1复制起始点(来源于 pMB1 、 松 散 型 ) 的 DNA 片 段 重 组 ， 构 建 成 质 粒 克 隆 载 体 pBR322。
目的基因
载体
限制性内切酶
限制性内切酶
DNA ligase
重组体 载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。
基因工程原理基因克隆载体讲课文档
f：噬菌体DNA从寄主染色体 DNA上删除下来；
g：溶原性细胞按照正常速率分 裂。
第四十三页，共84页。
1. 与构建载体相关的λ噬菌体性质
基因按功能相近性聚集成簇： •左侧区：A-J，合成头尾蛋白的 全部基因 •中间区：J-N，非必要区，与重 组有关
•右侧区：N-R，DNA合成及 调控。
构建克隆载体的一般是非接合型质粒
第十六页，共84页。
6. 显性质粒和隐蔽质粒
显性质粒：能使宿主细胞表现出质粒所携带的性状。
如：
• 抗性质粒（R质粒），抗Amp（Ap)、抗Cmp（Cm)、 抗Kan（Km)、抗Tet（Tc)等
• 育性质粒（F质粒） • 降解质粒：降解农药
• Ti质粒：形成冠瘿瘤
隐蔽质粒：不会赋予宿主细胞新性状的质粒为隐性质粒。
4. TA载体
T T
A
A
第三十三页，共84页。
第三十四页，共84页。
5. 质粒表达载体
——表达载体是在克隆载体的基础上增加了表达元件构建而成的，在 受体细胞内能稳定维持并表达外源目的基因。
第三十五页，共84页。
lac启动子表达系统
第三十六页，共84页。
质粒表达载体
融合型表达载体 非融合型表达载体
（c）不能提供复制能力
（d）不能为外源基因提供表达能力
• 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的，真正的天然质粒载体很少，在下列载体 中只有（ a ）被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（a）pSCl01
（b）pBR322 （c）pUBll0
（d）pUCl8
第三十一页，共84页。
第七次课结束！
第三十二页，共84页。
——包括61个基因，其中1/2参与了噬菌体生命周期，是必要 基因，另1/2属于不必要基因，用于基因工程操作。
第五章 基因克隆的载体系统2014
（2）质粒的拷贝数
拷贝数:常指生长在标准培养基条件下,每个细菌细胞中所 含有的质粒DNA分子的数目. 根据质粒在寄主细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒 可分为 松弛型（relaxed control ） : 10~60copies,高拷贝 严紧型（strigent contorl） : 1~几个copies,低拷贝
2、质粒载体必须具备的基本条件
具有复制起点 具有抗菌素抗性标记 具有若干限制性单一酶切位点(多克隆位
点(mutiple cloning site简称MCS)。
具有较小的分子量和较高的拷贝数
3、质粒载体的选择标记 氨苄青霉素 ( Amp ) 氯霉素 ( Cml ) 卡那霉素 ( Kam ) 链霉素 ( Sm ) 四环素 ( Tet )
穿梭质粒载体 人工构建的具有两种不同复制起点和选 择标记,可以在两种不同的寄主细胞中存 活和复制的质粒载体 大肠杆菌-枯草杆菌穿梭载体 大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体 大肠杆菌-动物细胞穿梭载体
（五）质粒载体的稳定性问题
质粒稳定遗传必须的两个条件 （1）每个世代、每个质粒至少要复制一次 （2）在细胞分裂时，复制过的质粒必须分配到两个子细 胞中 1、结构不稳定性:寄主基因组的IS序列插入质粒、质粒间的同源重组 等都会使质粒发生插入或缺失。 2、分离的不稳定性:在寄主菌细胞分裂的过程中，有一个细胞没有 获得质粒拷贝，并最终繁殖成无质粒的优势群体。 （六）影响质粒载体稳定性的主要因素 新陈代谢负荷;质粒载体的拷贝数 ;寄主菌的重组体系
2 载体的特点
能在宿主细胞内独立复制； 有选择标记，易于识别和筛选； 可插入一段较大的外源DNA分子而不 影响自身复制； 有合适的限制性酶切位点
基因克隆载体
５、组装各种“元件”，如启动子、终止子等
第19页，幻灯片共108页
三、质粒克隆载体构建
• 过程：严密的实验设计→构建（切割、修饰和连接重
组）
• 构建原则 1、选用合适的出发质粒：含必备的元件，如ori
、选择标记、克隆位点、启动子和终止子
2、正确获得构建质粒克隆载体的元件 3、组装合适的选择标记基因 4、选用合适的启动子 5、构建过程力求简单
cop基因：指令宿主合成阻遏物，当质粒复制到一定 拷贝数时，阻遏物也合成积累，直到阻止质粒的继续 复制。
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Cop
Pcop
cop
Rep
P/Orep
rep
ori
第13页，幻灯片共108页
４、质粒的不亲和性 (阅读教程p88,新版p105:两种解释)
亲和性质粒：能在同一细胞中复制的几种质粒
拷贝数（宿主细胞内质粒与染色体数量之比值）
第10页，幻灯片共108页
（１）每种质粒在其宿主细胞内的拷贝数相对稳定
严紧控制型：1-数个拷贝；大质粒 松驰控制型：10个以上拷贝；小质粒。 经氯霉素处理，宿主中质粒大量扩增（如ColE1拷贝数达 3000个）。
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（２）质粒复制的控制因素
第3页，幻灯片共108页
2.必备条件 • 1、克隆位点(一个或多个) • 2、能携带外源DNA片段进入受体细胞: 能自
我复制，或整入染色体随受体细胞DNA复制 而复制。 • 3、有用于选择克隆子的标记基因 • 4、安全性(不含损害受体的基因,不任意转入 别的,尤其人的细胞)
意义：基因工程随载体系统的建立而兴起，构建 新载体一直是基础研究的优先领域。
（1）T-DNA区 Ti质粒进入植物细胞的只有约25kb部分，即T-DNA
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得含有某种元件的DNA片段。 为了获得含某种元件的DNA片段，选用的
切割位点既要保证元件完整无缺，又要使 DNA片段愈小愈好，尽可能不含或少含不必 要的序列，使构建的载体尽可能小。
构建质粒载体的基本原则
3 组装合适的选择标记基因
(3)四环素抗性基因 （tcr tetr）
(4)氯霉素抗性基因 (cmpr cmr)
(5)新霉素抗性基因（neor）
pBR322
pBR322的大小是4361bp的环状双链DNA，其碱基序列 已经全部清楚。是最早应用于基因工程的载体之一。
含有24种限制酶的单一识别位点，具有四环素抗性基 因(tetr)和氨苄青霉素抗性基因(ampr)。
4
5
构建供转化大肠杆菌用的质粒载体，
可组装蓝/白颜色进行选择的(B-半乳糖苷酶
基因)lacz’基因。
6
但构建供转化蓝藻用的质粒载体不能
用这个基因。因为蓝藻含有大量的藻蓝蛋白。
构建质粒载体的基本原则
4 选用合适的启动子
如果用真核生物基因的启动子作为原核 生物表达克隆载体的启动子，其功效下降；
原核生物和病毒基因的启动子用作真核 生物表达克隆载体的启动子，可保留其原来 的功效。
一般来说，希望构建的质粒克隆载体是 松散型的，所以在构建的克隆载体中应含 有松散型的复制起始位点和调控复制拷贝 数的基因。
2 质粒的不相容性(incompatibility): 两种质粒在同一宿主细胞中不能共存的现象。
亲缘关系密切的不同质粒一般属于不亲和性质粒。
野生型质粒与其衍生的重组质粒属于不亲和性质 粒。
如：pBR322：p表示一种质粒，而“BR”则是分 别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez，322为编号。
选择标记基因：(用于鉴别目的DNA的存在， 将成功转化了载体的宿主挑选出来）
(1)氨苄青霉素抗性基因 (ampr apr) (2)卡那霉素抗性基因 (kanr kmr)
作为克隆载体的DNA分子具备的条件：
1 具有对受体细胞的可转移性，能携带外源 基因进入宿主细胞；
2 能在宿主细胞中自主复制，并实现外源基 因的增殖；
3 具有由单一限制酶识别位点组成的多克隆 位点(MCS）；
4 克隆载体必须具有用于选择克隆子的标记 基因；
5 克隆载体必须是安全的，不应含有对受体 细胞有害的基因，并且不会任意转入除受 体细胞以外的其他生物的细胞，尤其是人 的细胞。
按照质粒控制拷贝数的程度，可以将质粒分 为: 1）严谨型质粒(stringent plasmid)
拷贝数少，为1～5个 2 ）松散型质粒(relaxed plasmid)
拷贝数多，可达10个拷贝以上
某种质粒属于严谨型或是松散型的，与 宿主有一定的关系。
例子：质粒ColE1-K30在大肠杆菌中属 于松散型的，在奇异变形杆菌中是严谨型 的。
将质粒pSF124中含ampr基因的DNA片段和质粒pSC101 中含tetr基因的DNA片段同含ColE1复制起始点 (来源于 pMB1、 松散型 )的DNA片段重 组，构建成质粒克隆载体 pBR322。
普通型载体pBR322的结构图
PstI
ScaI
AmprHΒιβλιοθήκη ndIII BamHISalI
pBR322
非接合型质粒(non-conjugative plasmid)： 顺式作用元件： bom位点 移动基因：mob基因 (分子质量小、拷贝数多、被动迁移)
构建质粒载体的基本原则
1 选择合适的出发质粒 必备元件： A 复制起始点 B 选择标记基因 C 克隆位点 D 启动子 E 终止子 等等………..
构建质粒载体的基本原则
构建质粒载体的基本原则
5 在能达到预期目的的情况下，构建过程要 力求简单。
构建质粒克隆载体的基本策略
1.构建的质粒克隆载体应该是能在转化的受 体细胞中进行有效的复制，并作为质粒克 隆载体，希望在受体细胞中有较多的拷贝 数。
2.构建的质粒克隆载体必须含有允许外源 DNA片段克隆的位点，并这样的克隆位点 应尽可能多。
多克隆位点
MCS
复制起始点 ori
遗传标记
Ampr
克隆载体
按功能分： 克隆载体 表达载体
质粒克隆载体 (plasmid cloning vector)
质粒(plasmid):是一种寓于宿主细胞中染色体外裸露 的dsDNA分子。
一个质粒就是一个DNA分子。
Plasmid
chromosome
存在于细菌、真菌、蓝藻和绿藻的细胞中，在细菌细胞中最多。
当质粒载体承载目的基因转化受体细胞时，考虑 受体细胞内原有的质粒与作为克隆载体的质粒是否属 于亲和性质粒。
作为受体细胞最好不含内源质粒。
3 质粒的转移性
接合型质粒 (conjugative plasmid)： 转移基因tra：指令宿主细胞产生菌毛、合
成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞的 结合，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。
质粒的存在形式：
一般以超螺旋共价闭环DNA分子(ccc-DNA) 的形式存在。
也可以开环DNA分子(oc-DNA)和线性DNA分 子(L-DNA)的形式存在。
质粒DNA的大小
质粒
宿主
pPbs
蓝藻
CoLE1
大肠杆菌
PV21
三叶草根瘤菌
多数在10kb左右
大小（kb） 1.5 6.4 700
质粒的基本性质： 1 复制
3.构建的质粒克隆载体必须含有供选择克隆 子的标记基因。
4.构建的质粒克隆载体DNA分子应尽可能小。
5.根据特殊需要，使构建的质粒克隆载体中 组装各种元件，构建成不同用途的质粒克 隆载体。
质粒的命名
用小写字母p代表质粒（plasmid），在p字 母后用两个或三个大写字母代表发现这一质粒 的作者或实验室名称，再加上质粒编号。
目的基因
限制性内切酶
载体
限制性内切酶
重组体
DNA ligase
载体自连
目的基因 自连
基因操作的基本步骤
载体
单独一个包括启动子、编码区和终止子的 基因，或者组成基因的某个元件，一般是不 易进入受体细胞的，即使采用理化方法进入 细胞后，也不容易在受体细胞内维持。
载体(vector): 能携带外源基因（或 DNA片段）进入细胞复制、整合或表达 的工具。