AGE,SDSPAGE电泳分离
sds-page电泳的基本原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分析技术，通过电泳分离蛋白质样品的方法得到了广泛的应用。
本文将着重介绍SDS-PAGE电泳的基本原理。
一、SDS-PAGE电泳的概念SDS-PAGE是一种已经被广泛应用的蛋白质分离技术，它的全称是聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）。
这种电泳技术利用聚丙烯酰胺凝胶作为分离介质，通过直流电场将蛋白质样品分离出不同电荷和大小的蛋白质成分。
二、SDS-PAGE电泳的原理1. 聚丙烯酰胺凝胶SDS-PAGE电泳中所使用的凝胶是由聚丙烯酰胺构成的。
聚丙烯酰胺凝胶具有一定的孔隙结构，可以根据蛋白质的大小和电荷来调整孔隙的大小，从而实现不同大小的蛋白质的分离。
2. SDS处理SDS是指月桂基硫酸钠，它是一种阴离子表面活性剂。
在SDS-PAGE 电泳中，将样品中的蛋白质经过SDS处理后，蛋白质表面都会均匀地吸附一定数量的SDS分子，并且使蛋白质呈负电荷。
这样，所有的蛋白质分子都会带有类似的电荷密度，可以消除蛋白质的本身的电荷特性，使蛋白质在电场作用下只受到电场力的作用，而不受到其他因素干扰。
3. 蛋白质分离将经过SDS处理的蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶上，然后通过电泳进行分离。
经电泳分离后，蛋白质会根据其大小和电荷迁移到不同位置，从而使不同的蛋白质分离开来。
三、SDS-PAGE电泳的应用SDS-PAGE电泳技术在生物化学和分子生物学研究领域应用广泛。
它可以用于研究蛋白质的分子量、纯度和比例，也可以用于检测蛋白质的存在和表达水平，同时还可以用于鉴定蛋白质的异构体等。
四、SDS-PAGE电泳的发展SDS-PAGE电泳技术自问世以来，经过不断的改进和完善，在蛋白质分离和分析领域一直处于领先地位。
未来，随着科学技术的不断进步，SDS-PAGE电泳技术也将会迎来新的发展，并在更广泛的领域得到应用。
SDS-PAGE电泳实验步骤
SDS-PAGE电泳实验步骤垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋⽩质⼀、实验⽬的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蛋⽩质的分⼦量的原理和基本操作技术。
⼆、实验原理蛋⽩质是两性电解质，在⼀定的pH条件下解离⽽带电荷。
当溶液的pH⼤于蛋⽩质的等电点(pI)时，蛋⽩质本⾝带负电，在电场中将向正极移动；当溶液的pH⼩于蛋⽩质的等电点时，蛋⽩质带正电，在电场中将向负极移动；蛋⽩质在特定电场中移动的速度取决于其本⾝所带的净电荷的多少、蛋⽩质颗粒的⼤⼩和分⼦形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶是由⼀定量的丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合⽽成的三维⽹状孔结构。
本实验采⽤不连续凝胶系统，调整双丙烯酰胺⽤量的多少，可制成不同孔径的两层凝胶；这样，当含有不同分⼦量的蛋⽩质溶液通过这两层凝胶时，受阻滞的程度不同⽽表现出不同的迁移率。
由于上层胶的孔径较⼤，不同⼤⼩的蛋⽩质分⼦在通过⼤孔胶时，受到的阻滞基本相同，因此以相同的速率移动；当进⼊⼩孔胶时，分⼦量⼤的蛋⽩质移动速度减慢，因⽽在两层凝胶的界⾯处，样品被压缩成很窄的区带。
这就是常说的浓缩效应和分⼦筛效应。
同时，在制备上层胶(浓缩胶)和下层胶(分离胶)时，采⽤两种缓冲体系；上层胶pH=6.7—6.8，下层胶pH＝8.9；Tris —HCI缓冲液中的Tris⽤于维持溶液的电中性及pH，是缓冲配对离⼦；CI-是前导离⼦。
在pH6.8时，缓冲液中的Gly-为尾随离⼦，⽽在pH＝8.9时，Gly的解离度增加；这样浓缩胶和分离胶之间pH的不连续性，控制了慢离⼦的解离度，进⽽达到控制其有效迁移率之⽬的。
不同蛋⽩质具有不同的等电点，在进⼊分离胶后，各种蛋⽩质由于所带的静电荷不同，⽽有不同的迁移率。
由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在的浓缩效应，分⼦筛效应及电荷效应，使不同的蛋⽩质在同⼀电场中达到有效的分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加⼊⼀定浓度的⼗⼆烷基硫酸钠(SDS)，由于SDS带有⼤量的负电荷，且这种阴离⼦表⾯活性剂能使蛋⽩质变性，特别是在强还原剂如巯基⼄醇存在下，蛋⽩质分⼦内的⼆硫键被还原，肽链完全伸展，使蛋⽩质分⼦与SDS充分结合，形成带负电性的蛋⽩质—SDS复合物；此时，蛋⽩质分⼦上所带的负电荷量远远超过蛋⽩质分⼦原有的电荷量，掩盖了不同蛋⽩质间所带电荷上的差异。
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程
SDS-PAGE蛋白电泳标准操作规程----(纯度检测)一.目的：检测蛋白质的纯度是否达到生产抗体的要求。
二.依据：《分子克隆手册》，Ab-mart公司内部标准。
三. 职责：质量控制部。
四.试剂与水：所有试剂为分析纯（AR）；水为蒸馏水或超纯水。
五. 器皿与耗品：所有玻璃器皿使用前用玻璃清洁剂清洗, 80℃烤干。
tube、tip一次性使用。
六. 仪器设备：电泳仪（电源1--300V）电泳槽灌胶模具染色具凝胶扫描仪七. 环境要求：相对洁净环境，室温。
八. 溶液的配置：1.A液：1.5MTris·HCl pH8.8称取18.15gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至8.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）2.B液: 1MTris·HCl pH6.8称取12.1gTris碱(分析纯)加适量的超纯水溶解,用浓盐酸(分析纯)调pH值至6.8,加超纯水定容至100 ml。
贴上标贴，4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）3.C液: 30%丙烯酰胺称取29.2g丙烯酰胺(分析纯),0.8gN,N’-甲叉双丙烯酰胺(分析纯), 加适量的超纯水溶解,再定容至100 ml,用滤纸过滤,。
贴上标贴，避光4℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）4.D液:10%SDS称取10gSDS(分析纯),用超纯水溶解至100 ml.贴上标贴，室温储存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）5.E液:10%过硫酸胺称取10g过硫酸胺(分析纯), 用超纯水溶解至100 ml。
贴上标贴，-20℃保存。
此溶液有效使用期限为三个月。
（溶液配置台帐见附件）6.F液:TEMED(amersco)7.电泳缓冲液(10X)称取60.57g Tris碱(分析纯),288.268g甘氨酸(分析纯),20gSDS(分析纯),加超纯水定容至2000ml，临用前加超纯水稀释10倍，贴上标贴，室温储存。
SDS—PAGE凝胶电泳(细致分析)
SDS-PAGE电泳的基础原理和实验步骤1.名称：SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳2.原理：此项技术的原理，是根据样品中蛋白质分子量大小的不同，使其在电泳胶中分离。
不同的蛋白质在不同的pH值下表现出不同的电荷，同时蛋白质具有不同的大小和形状。
为了使蛋白在电泳中的迁移率只与分子量有关，我们在上样前，通常会进行一些处理。
上样缓冲液由Tris-HCl （pH6.8）、甘油，10％SDS、β-巯基乙醇、0.1％溴酚蓝以及蒸馏水组成。
其各自的作用如下述：SDS 即十二烷基硫酸钠，是一种阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构；β-巯基乙醇是强还原剂，它可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键。
由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或者单个肽链，因此测定结果只是亚基或者单个肽链的分子量。
同时，SDS与蛋白质结合引起蛋白质的构象改变，形成长椭圆棒状，不同蛋白质短轴长度都一样，长轴随蛋白分子量不同而不同，这样就消除了性状的影响。
另外，解聚后的氨基酸侧链和SDS结合成蛋白- SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的电荷量，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
甘油用以增大样品液密度，使加样时样品溶液可以快速沉入样品凹槽底部。
样品处理液中通常还加入溴酚蓝染料，用于监控整个电泳过程。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的分辨率。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
样品液和浓缩胶中Tris-HCl均为pH6.8,上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸（pH8.3）,分离胶含Tris-HCl(Ph8.8).电泳启动时，蛋白样品处于pH6.8 的上层，pH8.8 的分离胶层在下层，上槽为负极，下槽为正极。
sds-page的分离原理
sds-page的分离原理
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，其分离原理主要基于蛋白质的大小和电荷差异。
具体而言，SDS-PAGE包括以下几个步骤：
准备样品：将待分离的蛋白质样品加入含有SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（如2-巯基乙醇）的缓冲液中。
SDS可以使蛋白质带负电荷，并且通过断裂蛋白质的二级和三级结构，使其获得线性结构以便于分离。
加载样品：将经过处理的样品加载到聚丙烯酰胺凝胶的样品孔中。
电泳：应用电场使蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中迁移，通常正极位于凝胶底部，负极位于顶部。
由于SDS提供了负电荷，蛋白质在电场作用下向阳极迁移。
同时，凝胶的孔径大小可以根据需要进行调整，以便不同大小的蛋白质能够得到有效分离。
分离：由于蛋白质的迁移速度与其分子量呈反比关系，较小的蛋白质在电泳过程中移动得更快，而较大的蛋白质则移动得较慢。
这样，在电泳过程中，蛋白质会被分离成一个个带状区域，形成所
谓的蛋白质条带。
可视化：完成电泳后，可以使用染色剂（如Coomassie蓝染剂）对凝胶进行染色，使蛋白质条带可见。
通过测量蛋白质条带的迁移距离和参考标准物质的迁移距离，可以计算出待分离蛋白质的相对分子量。
总之，SDS-PAGE利用SDS和电泳技术，根据蛋白质的大小和电荷差异，实现了对蛋白质的分离与分子量的估计。
SDS-PAGE电泳实验步骤
垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质一、实验目得学习ＳDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(ＳDS—ＰAGＥ)测定蛋白质得分子量得原理与基本操作技术、二、实验原理蛋白质就是两性电解质,在一定得ｐH条件下解离而带电荷。
当溶液得pH大于蛋白质得等电点(pＩ)时,蛋白质本身带负电,在电场中将向正极移动;当溶液得pH小于蛋白质得等电点时,蛋白质带正电,在电场中将向负极移动;蛋白质在特定电场中移动得速度取决于其本身所带得净电荷得多少、蛋白质颗粒得大小与分子形状、电场强度等。
聚丙烯酰胺凝胶就是由一定量得丙烯酰胺与双丙烯酰胺聚合而成得三维网状孔结构、本实验采用不连续凝胶系统,调整双丙烯酰胺用量得多少,可制成不同孔径得两层凝胶;这样,当含有不同分子量得蛋白质溶液通过这两层凝胶时,受阻滞得程度不同而表现出不同得迁移率。
由于上层胶得孔径较大,不同大小得蛋白质分子在通过大孔胶时,受到得阻滞基本相同,因此以相同得速率移动;当进入小孔胶时,分子量大得蛋白质移动速度减慢,因而在两层凝胶得界面处,样品被压缩成很窄得区带。
这就就是常说得浓缩效应与分子筛效应。
同时,在制备上层胶(浓缩胶)与下层胶(分离胶)时,采用两种缓冲体系;上层胶ｐＨ=6、7—6。
8,下层胶pH=8.9;Tris—HCＩ缓冲液中得Triｓ用于维持溶液得电中性及pＨ,就是缓冲配对离子;ＣI－就是前导离子。
在pH6.８时,缓冲液中得Gly—为尾随离子,而在pH＝8、９时,Gly得解离度增加;这样浓缩胶与分离胶之间ｐH得不连续性,控制了慢离子得解离度,进而达到控制其有效迁移率之目得。
不同蛋白质具有不同得等电点,在进入分离胶后,各种蛋白质由于所带得静电荷不同,而有不同得迁移率、由于在聚丙烯酰胺凝胶电泳中存在得浓缩效应,分子筛效应及电荷效应,使不同得蛋白质在同一电场中达到有效得分离。
如果在聚丙烯酰胺凝胶中加入一定浓度得十二烷基硫酸钠(SDS),由于SDＳ带有大量得负电荷,且这种阴离子表面活性剂能使蛋白质变性,特别就是在强还原剂如巯基乙醇存在下,蛋白质分子内得二硫键被还原,肽链完全伸展,使蛋白质分子与SDS充分结合,形成带负电性得蛋白质—SDS复合物;此时,蛋白质分子上所带得负电荷量远远超过蛋白质分子原有得电荷量,掩盖了不同蛋白质间所带电荷上得差异、蛋白质分子量愈小,在电场中移动得愈快;反之,愈慢。
SDS-PAGE-蛋白电泳分析
SDS－PAGE 蛋白电泳分析一、目的掌握SDS-PAGE 电泳原理与方法二、电泳原理聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(简称Acr) 和交联剂N，N’—亚甲基双丙烯酰胺（简称Bis）在催化剂作用下，聚合交联而成的具有网状立体结构的凝胶，并以此为支持物进行电泳。
聚丙烯酰胺凝胶电泳可根据不同蛋白质分子所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率将蛋白质分离成若干条带，如果分离纯化的样品中只含有同一种蛋白质，蛋白质样品电泳后，就应只分离出一条区带。
SDS 是一种阴离子表面活性剂能打断蛋白质的氢键和疏水键，并按一定的比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷，掩盖了各种蛋白分子间天然的电荷差异。
因此，各种蛋白质-SDS 复合物在电泳时的迁移率，不再受原有电荷和分子形状的影响，而只是棒长的函数。
这种电泳方法称为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（简称SDS—PAGE）。
由于SDS-PAGE 可设法将电泳时蛋白质电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度，因此常用来鉴定蛋白质分离样品的纯化程度，如果被鉴定的蛋白质样品很纯，只含有一种具三级结构的蛋白质或含有相同分子量亚基的具四级结构的蛋白质，那么SDS—PAGE 后，就只出现一条蛋白质区带。
三、试剂配制1．30% 丙烯酰胺：将29g 丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml 的水中。
加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。
用过滤器（0.45μm 孔径）过滤除菌，查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中保存于室温(丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料)。
2．1M Tris-Cl: 称取12.191g Tris 碱溶于80ml 蒸馏水中，用浓HCl 调到所需pH 值，定容至100ml。
sds-page蛋白凝胶电泳原理
在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理的讨论之前，我们首先需要了解蛋白质和电泳技术的基本概念。
蛋白质是生物体内功能最丰富的大分子化合物，它们参与了生命的方方面面，包括结构、酶活性、信号传导等。
而电泳技术则是一种基于电场作用将带电粒子分离的方法，它在生命科学研究中有着广泛的应用。
SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理是一种常用于分离和鉴定蛋白质的技术，其原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系。
现在让我们深入探讨SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的原理和相关细节。
1. SDS-PAGE蛋白凝胶电泳的基本步骤在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，首先需要将待测样品中的蛋白质在含有SDS（十二烷基硫酸钠）的缓冲液中进行变性处理，使得蛋白质呈线性结构并且带有负电荷。
之后，将处理过的蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，并施加电场使得蛋白质开始迁移。
根据蛋白质的分子质量，它们将在凝胶中以不同的速率迁移，最终实现分离。
2. SDS的作用原理SDS是一种带有负电荷的表面活性剂，它的主要作用是使得蛋白质呈线性构象，并且使得蛋白质的带电量与其分子质量成正比。
这样一来，不同分子质量的蛋白质在电场中受到的阻力相对应也会不同，从而实现蛋白质的分离。
3. 凝胶电泳的原理凝胶电泳是利用凝胶作为分离介质的电泳方法。
凝胶可以是聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶或者琼脂糖琼脂糖凝胶。
在SDS-PAGE蛋白凝胶电泳中，聚丙烯酰胺凝胶是最常用的分离介质。
它的基本原理是利用凝胶的孔隙大小来实现对蛋白质的分离，分子质量较大的蛋白质会受到较大的阻力从而迁移较慢，分子质量较小的蛋白质则会迁移得更快。
4. 电泳条件的影响在进行SDS-PAGE蛋白凝胶电泳实验时，电泳条件的设定对分离结果有着重要影响。
电场强度的大小、电泳时间的长短、凝胶浓度等都会影响蛋白质的迁移速度和分离效果。
总结而言，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳原理基于蛋白质在电场中的迁移速度与其分子质量成反比的关系，通过SDS的作用使得蛋白质呈现线性构象并且带有负电荷，再利用凝胶电泳对不同分子质量的蛋白质进行分离。
sds-page的原理,说明其在物质分离与检测的步骤
序一：认识SDS-PAGESDS-PAGE（Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质电泳技术，可以对蛋白质进行分离和检测。
它通过凝胶的孔隙大小和电泳的受力使蛋白质在凝胶中进行分离，是生物化学实验中的重要手段。
今天我们就来深入探讨SDS-PAGE的原理及在物质分离与检测中的步骤。
序二：SDS-PAGE的原理在SDS-PAGE技术中，其原理主要包括两个方面：SDS和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
1. SDS的作用SDS是一种阴离子表面活性剂，它的主要功能是将蛋白质变性并赋予负电荷。
蛋白质经过SDS处理后，其构象被完全展开，获得了相同的质量比电荷的分布，使得蛋白质在电泳过程中只受到电场的作用而不再因其本身的结构而迁移速度有差异。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶是一种网状结构的凝胶，其孔隙大小可以根据需要调整，能够使蛋白质根据其分子大小在凝胶中被有效地分离。
序三：SDS-PAGE在物质分离与检测中的步骤1. 样品处理需要将待测样品进行SDS处理，在加热的条件下，SDS可以使蛋白质获得带负电的线性结构，这样可以消除蛋白质的构象差异，从而在电泳过程中只受到电场的作用而进行迁移。
2. 样品加载处理好的样品需要被加在SDS-PAGE的凝胶孔中，然后进行电泳操作。
3. 电泳电泳的原理是利用电场的作用，使具有电荷的离子或分子在电场中移动。
在SDS-PAGE中，蛋白质通过受到电场的作用，根据其分子大小在凝胶中被有效地分离。
4. 凝胶染色蛋白质在凝胶中分离后需要进行染色，通常使用银染或共染技术，使蛋白条带清晰可见，便于进一步的分析。
序四：SDS-PAGE的个人观点和理解通过对SDS-PAGE的原理及在物质分离与检测中的步骤的了解，我深刻认识到这一技术在蛋白质研究领域中的重要性。
SDS-PAGE能够对蛋白质进行高效分离和定量，为蛋白质的性质和功能研究提供了有力的手段。
SDSAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理
S D S A G E电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]SDS－PAGE电泳的基本原理及浓缩胶浓缩样品的原理SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）是目前最常用的分离蛋白质的电泳技术SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，这种复合物由于结合大量的SDS，使蛋白质丧失了原有的电荷状态形成仅保持原有分子大小为特征的负离子团块，从而降低或消除了各种蛋白质分子之间天然的电荷差异，由于SDS与蛋白质的结合是按重量成比例的，因此在进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。
当分子量在15KD到200KD之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：logMW=K-bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
SDS-PAGE电泳成功的关键是什么？①溶液中SDS单体的浓度SDS在水溶液中是以单体和SDS-多肽胶束的混合形式存在，能与蛋白质分子结合的是单体。
为了保证蛋白质与SDS的充分结合，它们的重量比应该为1∶4或1∶3。
②样品缓冲液的离子强度因为SDS结合到蛋白质上的量仅仅取决于平衡时SDS单体的浓度，不是总浓度，而只有在低离子强度的溶液中，SDS单体才具有较高的平衡浓度。
所以，SDS电泳的样品缓冲液离子强度较低，常为10-100 mM。
③二硫键是否完全被还原只有二硫键被完全还原以后，蛋白质分子才能被解聚，SDS才能定量地结合到亚基上从而给出相对迁移率和分子质量对数的线性关系。
sdspage分离蛋白质实验报告
sdspage分离蛋白质实验报告
SDS-PAGE分离蛋白质实验报告
引言
SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）是一种常用的蛋白质分离技术，通过电泳原理将蛋白质按照其分子量大小进行分离。
本实验旨在利用SDS-PAGE技术对不同来源的蛋白质进行分离，并观察其分离效果。
材料与方法
1. 样品制备：收集不同来源的蛋白质样品，如动植物组织、细胞培养液等。
2. 样品处理：将样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，并在100℃下煮沸5分钟，使蛋白质变性。
3. 准备SDS-PAGE凝胶：按照实验要求制备SDS-PAGE凝胶。
4. 样品加载：将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中。
5. 电泳分离：在设定好的电泳条件下进行电泳分离。
6. 凝胶染色：将分离后的蛋白质凝胶进行染色，观察分离效果。
结果与讨论
经过SDS-PAGE电泳分离后，观察到不同来源的蛋白质在凝胶上呈现出不同的条带。
通过比较不同样品的分离效果，可以发现不同来源的蛋白质在分子量和丰度上存在差异。
此外，通过与已知分子量标准蛋白质进行对照，可以进一步确定待测蛋白质的分子量。
结论
本实验通过SDS-PAGE技术成功分离了不同来源的蛋白质样品，并观察到了它们的分子量差异。
这为进一步的蛋白质研究和分析提供了重要的数据支持。
同
时，本实验也展示了SDS-PAGE技术在蛋白质分离领域的重要应用价值。
结语
通过本次实验，我们对SDS-PAGE技术有了更深入的了解，并获得了宝贵的实验数据。
期待未来能够进一步应用这一技术，探索更多蛋白质的分离与分析。
实验二聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离血清蛋白质
目的 1 强化学生对电泳基本原理的理 解与记忆。 2 熟记聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 蛋白质的基本原理、学会操作。
原理
带有电荷的颗粒在电场中泳动的现象叫电 泳。带正电荷的泳向负极，带负电的泳向 正极。许多生物分子都带有电荷，其电荷 的多少取决于分子性质及其所在介质的pH 及其组成。混合物中各组分在电场中的泳 动速度，首先和本身所带的净电荷多少、 分子量大小和形状有关。一般来说，带电 越多，分子量（颗粒）越小而且是球形的， 则泳动速度就快。反之，则慢。因此，在 一定时间内，由于各组分移动距离的不同， 而达到分离鉴定各组分的目的。
实验结果分析
胶槽1
94 000 62 000 43 000
2
3
31 000 20 100 14 400
图1 标准蛋白质与待测样品电泳图谱
注：胶槽1 标准蛋白；胶槽2、3 样品蛋白
思考题
该实验中如何去除蛋白质间电荷效应的？ 在不连续体系 SDS-PAGE 中 , 分离胶与浓缩胶中 均含有TEMED和AP,试述其作用?
注意事项
1．丙烯酰胺有神经毒性，可经皮肤，呼吸道 等吸收，故操作时一定要注意防护。 2．蛋白加样量要合适。加样量太少，条带不 清晰；加样量太多则泳道超载，条带过宽而重 叠，甚至覆盖至相邻泳道。 3．对多种蛋白而言，电流大则电泳条带清晰， 但电流过大，玻璃板会因受热而破裂。 4.过硫酸铵溶液最好为当天配置，冰箱里储存 也不能超过一周。
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)是一种人 工合成的凝胶，它是由丙烯酰胺 (Acr)和交联剂亚甲基双丙烯酰胺 (Bis)在催化剂作用下，聚合交联 而成的含有酰胺基侧链的脂肪族 大分子化合物。
SDS-PAGE电泳标准操作流程
SDS-PAG电泳标准操作规程1、目的建立SDS-PAG电泳的标准操作规程，确保电泳操作有序进行，保证电泳的安全性、有效性。
2. 范围与职责适用SDS-PAG电泳操作岗位。
配制岗位操作人员对本标淮实施负责，QA 检查员、生产主管负责监督。
3. 程序：3.1. 制胶3.1.1组装胶架将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。
放于制胶架上夹紧，下端紧贴密圭寸条。
3.1.2分离胶的配置3.121 10% 分离胶配方如下表:3.122 灌胶混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内（胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm）。
3.1 . 2.3 液封在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空气，使胶面平整。
静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
3.1.3浓缩胶的配置3.1.3.1 5% 浓缩胶配方下表:3.1.3.2插入制胶梳混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内（分离胶上方），轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。
约30分钟，聚合完全。
3.2. 电泳3.2.1安装电泳槽将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。
两块10%勺凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。
将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。
倒入1X tris-gly 电泳缓冲液。
3.2.2 样品处理对于蛋白样品直接取80 U的样品，依次加上20"5x buffer （加了B-巯基乙醇），混匀。
对于菌体或组织等固体样品，取少量样品加100ul 2x buffer （加了B-巯基乙醇）煮沸10分钟。
3.2.3 加样用移液枪取处理过的样品溶液10"l ，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker 可加在不同的孔槽中。
SDSAGE蛋白电泳方法
S D S A G E蛋白电泳方法 Document serial number【LGGKGB-LGG98YT-LGGT8CB-LGUT-SDS-PAGE一. 实验原理SDS 是一种阴离子表面活性剂，在蛋白质溶液里加入 SDS 和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原， SDS 能使蛋白质的氢键、疏水键打开并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS 复合物。
在一定条件下，SDS 与大多数蛋白质的结合比例为 :1。
由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。
SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。
蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪茄烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的 SDS 复合物的短轴长度都一样，约为，而长轴则随蛋白质的 Mr 成正比的变化。
基于上述原因，蛋白质-SDS 复合物在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只与椭圆棒的长度有关，也就是蛋白质 Mr 的函数。
二. 试剂器材30%凝胶贮液(100mL)：称取试剂Acr 29.2g和Bis 0.8g置于100mL烧杯中，向烧杯中加入约60mL双蒸水，充分搅拌溶解后加双蒸水定容至100mL，置于棕色瓶内4℃贮存，每过1-2个月应重新配制；注意：丙稀酰胺具有很强的神经毒性，并可通过皮肤吸收，其作用有积累性，配制时应戴手套和口罩等。
分离胶缓冲液 mol/L Tris-HCl，pH ，100mL)：称取Tris 18.2g 溶于约80mL双蒸水，用6mol/L的HCl 调整pH值至，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；堆积胶缓冲液(0.5 M Tris-HCl，pH ，100mL)：称取Tris 6.0g溶于约80mL双蒸水，用1mol/L的HCl 调整pH值至，加双蒸水定容到100mL，4℃ 贮存；电泳缓冲液(1L)：称取试剂Tris 3.03g和甘氨酸 14.4g置于500mL烧杯中，向烧杯中加入约400mL双蒸水充分溶解，再加入10%SDS溶液，以双蒸水定容至1L (自然pH值为，无需再调)，4℃ 贮存，可重复使用5-6次；2×加样缓冲液(10mL)：取下列试剂置于10mL塑料离心管中L Tris-HCl缓冲液10%SDS溶液甘油巯基乙醇溴酚蓝 0.02g，混匀后1mL分装，-70℃可贮存6个月；10%AP：称取(NH4)2S2O3 1.0 g，溶于双蒸水中，分装成每份1mL，-20℃贮存；TEMED：分装成每份1mL，4℃避光贮存；水饱和正丁醇(100mL)：在玻璃瓶中加入50mL双蒸水和50mL正丁醇，振摇。
SDSAGE电泳操作规范
S D S A G E电泳操作规范集团标准化工作小组 [Q8QX9QT-X8QQB8Q8-NQ8QJ8-M8QMN]聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。
它有两种形式：非电泳（Native-PAGE）及-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完整状态，并依据的大小、蛋白质的形状及其所附带的而逐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅根据蛋白质亚基分子量的不同就可以分开蛋白质。
该技术最初由shapiro于1967年建立，他们发现在样品介质和中加入离子和强（SDS即）后，蛋白质亚基的主要取决于亚基分子量的大小（可以忽略电荷因素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白分子的二、三级结构。
而强如，二硫苏糖醇(DTT)能使半胱氨酸残基间的断裂。
在和凝胶中加入和SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS 结合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超过了蛋白原有的，这样就消除了不同分子间的电荷差异和结构差异。
SDS-PAGE一般采用的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统相比，能够有较高的。
浓缩胶的作用是有堆积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁移作用而被浓缩至一个狭窄的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl缓冲液，电极液选TRIS/甘氨酸。
电泳开始后，HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少量的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，因此一起向正极移动，其中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超过蛋白，因此在后面形成低区，而与低电导区成反比，因而产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子迅速移动，形成以稳定的界面，使蛋白聚集在移动界面附近，浓缩成一中间层。
此鉴定方法中，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状无关。
sds-page电泳的原理
sds-page电泳的原理
SDS-PAGE电泳是一种常用的蛋白质分离技术，其原理是利用蛋白质的分子大小和电荷差异在凝胶中进行电动力学分离。
首先，将待分离的蛋白质样品用SDS（十二烷基硫酸钠）缓冲液进行处理，使蛋白质完全解性，并在分子表面结合一定数量的SDS分子。
SDS的作用是给予蛋白质相同的电荷密度，使蛋白质在电场中迁移速度与分子量成反比。
这样，蛋白质在电场的作用下，由负极迁移到正极。
同时，在电解液缓冲液中加入还原剂（如2-巯基乙醇）和丙二醇等添加剂，可以防止蛋白质在电泳过程中发生氧化反应，保持还原态。
然后，将蛋白质样品加载到聚丙烯酰胺凝胶孔中，然后施加直流电场。
由于缓冲液和凝胶都是离子导电的，电场通过凝胶时会造成凝胶中的离子产生移动，形成离子漂移流。
分子量较小的蛋白质会受到凝胶的糊精网络的限制，迁移速度较慢；而分子量较大的蛋白质迁移速度较快。
这样，不同分子量的蛋白质会在凝胶中产生分离。
最后，电泳结束后，将凝胶从电泳槽中取出，并经过染色或转印等进一步处理。
染色后，可以观察到不同大小的蛋白质在凝胶中形成的带状条带。
根据已知分子量的标准蛋白质样品的迁移距离绘制标准曲线，就可以确定待测蛋白质的分子量。
总之，SDS-PAGE电泳利用蛋白质的分子大小和电荷差异，在凝胶中进行电动力学分离，是一种常用的蛋白质分析技术。
AGE,SDSPAGE电泳分离
◆酸性电泳系统
‸采用pH4.0左右的电泳缓冲液，电泳向负极进行.下槽接负极，上槽接正极，以亚 甲基绿作指示染料
‸适用于分析酸性和碱性蛋白，即pI>4.0的蛋白均适用
◆ PAGE的用途
‸分析蛋白酶的纯度
※蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能
※电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开
⊕猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另 一个亚基则在SDS -PAGE中是向负极泳动，因而被忽视
€ 若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢 €若带正电，泳动速度则加快
€若不带电，颗粒也会向负极移动
一般要选择电渗较少的固体支持物 酶的纯度鉴定（分析电泳）
SDS-PAGE、PAGE、IEF（电泳纯）
‽ 酶全酶和亚基分子量测定
SDS-PAGE、PAGE ‽ pI测定
IEF ‽ 酶的分离纯化（制备电泳）
⊿负极泳动的蛋白容易被忽视
⊿解释有些蛋白的电荷不均一性
⊕很多蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF 却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认 为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。 ⊕猪生长激素经SDS- PAGE后只有28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。
三，主要采用的电泳技术(支持物)
‽ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率 € Native-PAGE--- 蛋白在天然状态下的电泳 € SDS-PAGE------ 蛋白在SDS变性下的电泳 ‽ 琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳)
琼脂糖凝胶为电泳的支持物. 方便但分辨率低 ‽ 醋酸纤维素薄膜电泳
ₒ如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到1:1.4,它 就可能向负极泳动。
SDSAGE电泳操作规范
聚丙烯酰氨凝胶电泳一简介作用原理：聚丙烯酰胺凝胶为网状构造，拥有分子筛效应。
它有两种形式：非电泳（Native-PAGE）及 - 聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）；非变性聚丙烯酰胺凝胶，在电泳的过程中，蛋白质能够保持完好状态，并依照的大小、蛋白质的形状及其所附加的而渐渐呈梯度分开。
而SDS-PAGE仅依据蛋白质亚基分子量的不一样就能够分开蛋白质。
该技术最先由 shapiro 于 1967 年成立，他们发此刻样品介质和中加入离子和强（SDS即）后，蛋白质亚基的主要取决于亚基分子量的大小（能够忽视电荷要素）。
二作用SDS是阴离子去污剂，作为变性剂和助溶试剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，损坏蛋白分子的二、三级构造。
而强如，二硫苏糖醇 (DTT) 能使半胱氨酸残基间的断裂。
在和凝胶中加入和 SDS后，分子被成多肽链，解聚后的氨基酸侧链和SDS联合成蛋白- SDS，所带的负电荷大大超出了蛋白原有的，这样就除去了不一样分子间的电荷差异和构造差异。
SDS-PAGE一般采纳的是不连续缓冲系统，与连续缓冲系统对比，能够有较高的。
浓缩胶的作用是有聚积作用，凝胶浓度较小，孔径较大，把较稀的样品加在浓缩胶上，经过大孔径凝胶的迁徙作用而被浓缩至一个狭小的区带。
当样品液和浓缩胶选TRIS/HCl 缓冲液，电极液选 TRIS/ 甘氨酸。
电泳开始后， HCl解离成氯离子，甘氨酸解离出少许的甘氨酸根离子。
蛋白质带负电荷，所以一同向正极挪动，此中氯离子最快，甘氨酸根离子最慢，蛋白居中。
电泳开始时氯离子泳动率最大，超出蛋白，所以在后边形成低区，而与低电导区成反比，因此产生较高的电场强度，使蛋白和甘氨酸根离子快速挪动，形成以稳固的界面，使蛋白齐集在挪动界面邻近，浓缩成一中间层。
此判定方法中，蛋白质的迁徙率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和分子形状没关。
三电泳过程蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁徙率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等要素。
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➢可消除电荷对迁移率的影响
◆浓度梯度凝胶的 配制
‸需采用梯度混合器，配制时，浓溶液置于混合室，稀溶液置于贮存室
◆碱性电泳系统
‸用pH8.3的电泳缓冲液，电泳向正极进行.下槽接正极，上槽接负极，以 溴酚蓝为指示染料
‸最常用 ‸可用于分析绝大多数的蛋白酶，因为其pI<8.3，即蛋白酶带负电
◆酸性电泳系统
‸采用pH4.0左右的电泳缓冲液，电泳向负极进行.下槽接负极，上槽接正极，以亚 甲基绿作指示染料
‸适用于分析酸性和碱性蛋白，即pI>4.0的蛋白均适用
◆ PAGE的用途
‸分析蛋白酶的纯度
※蛋白泳动与蛋白大小，电荷和形状有关，凝胶兼有分子筛的功能
※电泳的分辨率很高，可以把不同的蛋白酶分开
⊕猪生长激素可能含两种不同的亚基，其中28kD是个普通蛋白；而另 一个亚基则在SDS -PAGE中是向负极泳动，因而被忽视
◆ SDS-PAGE的原理
ₒ巯基乙醇使蛋自中的二硫键还原
ₒSDS破坏蛋白质的非共价键
→使含有亚基的蛋白质解离为各个亚基
ₒ1g蛋白和1.4g SDS结合形成蛋白-SDS胶束。SDS 带大量的负电荷
→各种蛋白-SDS胶束均带负电,且电荷量相近,电泳迁泳率 只取决于胶束(亚基Mr)大小
ₒ SDS与蛋白结合，并引起蛋自构象的变化
越大,泳动速度越快
‽ 溶液pH值 溶液pH值决定了溶液中蛋白酶的带电的性质如带何种 电荷个带电的多少
‽ 离子强度
溶液的离子强度越高，颗粒的泳动速度则越慢。反之则越快。一般电泳溶 液的离子强度为0.02-0.2
‽ 电渗 在电场中，液体对于固体支持物的相对移动称为电渗
在毛细管电泳中，毛细管是由石英为材料，含硅酸成分， 带负电荷，使毛细管中溶液感应而带正电荷。水分子便向负极 移动，并带动溶液中的蛋白酶等颗粒一起向负极移动
Amino acid Content ( %) Amino acid Content ( %)
Asp
2.03
Thr
1.32
Ser
4.11
Glu
3.02
Gly
4.56
Ala
2.09
Cys
----
Val
5.19
Met
----
IIe
1.13
Leu
1.97
Tyr
2.16
Phe
57.05
Lys
10.15
His
➢胶束中蛋白电荷量不能忽视
ₒ碱性组蛋白和酸性铁氧还蛋白在SDS-PAGE所测亚基 Mr偏高 ※组蛋白亚基Mr为21kD，但测定出为35kD
组蛋白的正电荷抵消了SDS部分负电荷
※铁氧还蛋白的亚基Mr只有8kD，但Rf=0.8
铁氧还蛋白不能和SDS充分结合
ₒ强碱性的精蛋白在SDS-PAGE中会沉淀
可能是精蛋白的正电荷和SDS的负电荷相差无几
三，主要采用的电泳技术(支持物)
‽ 聚丙烯酰胺凝胶电泳
同时具有电荷和分子筛的双重作用，故具很高的分辨率 € Native-PAGE--- 蛋白在天然状态下的电泳 € SDS-PAGE------ 蛋白在SDS变性下的电泳 ‽ 琼脂糖凝胶电泳(核酸电泳)
琼脂糖凝胶为电泳的支持物. 方便但分辨率低 ‽ 醋酸纤维素薄膜电泳
⊿负极泳动的蛋白容易被忽视
⊿解释有些蛋白的电荷不均一性
⊕很多蛋白经一些方法证实是纯的，如SDS-PAGE后只有单带，但IEF 却含多个pI。目前对其中的原因众说纷纭，尚无公认的解释，有人认 为是空间构象不同所引起，但未有确切的证据。 ⊕猪生长激素经SDS- PAGE后只有28kD带，IEF却有6.0-7.2等五个pI。
◆均一胶和梯度胶
聚丙烯酰胺凝胶通常由浓缩胶和分离胶组成
浓缩胶:丙烯酰胺浓度均为4%,起蛋白上样和浓缩的作 用
分离胶:起分离蛋白的作用, 丙烯酰胺浓度可以是相同的 (均一胶),也可以是不同的(梯度胶)
◆梯度胶电泳的特点
※分离胶的丙烯酰胺浓度由上至下形成 从低到高的连续梯度,一般是4%-20%
1.01
Arg
4.21
Pro
-----
Trp
-----
见:梁秀文等.植物绿叶粗蛋白在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨 酸的碱性蛋白的测定. 热带亚热带植物学报,2006,14（2）：126-129
․植物绿叶乙醇酸氧化酶含有向负极泳动的 蛋白
Fig.SDS-denatured glycolate oxidase from B. campestris ssp. chinensis var. utillis leaves was subjected to SDS-PAGE (A), CE (B) and acetate cellulose membrane electrophoresis (C). The polarity was shown and the arrow indicates the original of protein sample
ₒ如果碱性蛋白和SDS结合率很低，达不到1:1.4,它 就可能向负极泳动。
ₒ碱性蛋白能充分和SDS结合，但其所带正电荷比 SDS负电荷还要多，使蛋白-SDS胶束带正电，同样 会向负极泳动
․植物绿叶粗蛋白中含大量负极泳动的蛋白
负极
正极 菜心绿叶粗蛋白经SDS-醋酸纤维素薄膜电泳,下 方为正极,箭头处为蛋白样品点样的位置
ₒ蛋白-SDS胶束中蛋白/SDS比例并非都是 1:1.4 ₒ蛋白-SDS胶束中蛋白电荷量并非都可以忽视 ₒ同一蛋白能以不同的比例和SDS结合 ₒ蛋白-SDS胶束甚至可以带负电荷
➢胶束中蛋白/SDS的比例并非都是
1:1.4
ₒ空间位阻妨碍蛋白和SDS的充分结合
※糖蛋白:糖蛋白的糖基会形成空间位阻,亚基Mr的 对数与其电泳迁泳率不成线性关系 ※蛋白受体:二硫键丰富,不容易彻底解离为亚基, 所测亚基Mr会偏高 ※含辅酶的复合蛋白，多酶复合体等:其亚基Mr可 能测不准
ₒ蛋白-SDS胶束在水溶液中都成椭圆形，其短轴长 度都为18A左右
ₒ蛋白-SDS胶束长轴的长度和蛋白亚基Mr成正比
➢SDS-PAGE的主要用途 ₒ测定蛋白亚基Mr ₒ研究蛋亚基组成
ₒ研究蛋白纯度
可结合PAGE 、HPLC、IEF等
➢SDS—PAGE的优点
ₒ分辨率高(如果是梯度胶) ₒ精确度高(测定误差不超过10%) ₒ方便易行
四 聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
◆ 聚丙烯酰胺凝胶的形成 ※丙烯酰胺和甲叉双聚丙烯酰胺为聚合单体,在聚 合催化剂的催化下,聚合为聚丙烯酰胺凝胶
※聚合的催化剂
▲过硫酸铵和四甲基乙二胺(TEMED)
▲光和化学核黄素
※ 丙烯酰 胺
甲叉双丙 有烯毒酰，液胺体
聚合 催化剂
聚丙烯酰胺凝胶 无毒，固体.
◆聚合单体丙烯酰胺的浓度和凝胶孔径的关系
His
------ - ---- 1.53 Arg
2.53 1.44 3.00
见:曾秋莲等. 植物中在SDS-PAGE中向负极泳动的富含苯丙氨酸的蛋 白的发现. 中国生物化学与分子生物学报, 2006, 22(1):86-90
․发现蛋白-SDS胶束向负极泳动 的意义 ⊿蛋白性质和蛋白组学研究有缺陷
※一条带表明纯度高（电泳纯）
‸分析蛋白酶的全酶分子量
★蛋白酶在电场中的泳动速度 决定于：
⊕蛋白酶形状和大小（全酶分子量） ⊕蛋白酶的净电荷量 ⊕电场强度 ⊕溶液pH值 ⊕离子强度 ⊕电渗
★全酶分子量的对数(Log Mr)和泳动距离成反比
◆ PAGE的局限性
☆如果蛋白酶不同的多聚态并存，纯度高但也可能呈2-3条带
€ 若蛋白酶带负电，泳动速度则变慢 €若带正电，泳动速度则加快
€若不带电，颗粒也会向负极移动
一般要选择电渗较少的固体支持物(不带电)
二，电泳技术的应用范围
‽ 酶的纯度鉴定（分析电泳）
SDS-PAGE、PAGE、IEF（电泳纯）
‽ 酶全酶和亚基分子量测定
SDS-PAGE、PAGE ‽ pI测定
IEF ‽ 酶的分离纯化（制备电泳）
1.98 1.77 1.25
Cys
--- ----- -----
Val
7.49 1.38 1.76
Met
---- ----- -----
IIe
2.32 1.64 0.92
Leu
2.89 2.89 1.66
Tyr
1.48 1.90 2.10
Phe
60.00 65.62 62.30 Lys
10.15 6.17 3.06
不同的蛋白酶的带电性质（带电量和带何种电荷），大小和形状不同，在一 定的电场下，它们的移动方向和移动速度也不同，从而得到分离。
可分离不同的蛋白酶 (制备性电泳) 分析其蛋白性质如分子量和等电点等(分析性电泳)
移动方向
颗粒在电场中的移动方向，决定于它们所带电荷的种类
※带正电荷的颗粒向电场的负极移动 ※带负电荷的颗粒则向电场的正极移动 ※净电荷为零的颗粒在电场中不移动
☆如果蛋白和杂蛋白的pI相差很大，也要注意有些 杂蛋白容易被忽视，因为两者泳动方向不同
☆蛋白和电泳缓冲液的pH相同，蛋白不会泳动
☆电泳和其它方法如HPLC（高压液相色谱）结合起来，判断蛋白酶的纯度会更可
靠!
五 SDS-PAGE
在十二烷基硫酸钠(SDS) 存在的条件下所作 的聚丙烯酰胺凝胶电泳,称为SDS-聚丙烯酰 胺凝胶电泳，简称SDS-PAGE
移动速度
在电场中，颗粒的泳(移)动速度通常用迁移率来表示。 迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度
在电场中的泳动速度主要决定于
‽ 颗粒（蛋白酶）本身所带的净电荷量