土壤微生物计数法

土壤微生物计数法
土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。

土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。

1.1培养计数法
1.1.1概要
在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。

因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。

这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。

稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。

最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。

根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。

1.1.2稀释平板法
一、试剂配制
常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。

按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。

凝固后的培养基可加热溶解后使用。

二、仪器设备
广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。

三、操作步骤
（1）土壤系列稀释液制备
取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。

迅速用灭菌的移液管吸取10-1土壤稀释液10ml，放入灭菌的装有90ml水的广口瓶中，塞上橡皮塞，混合均匀，此为10-2土壤稀释液。

再如此依次配制10-3、10-4、10-5和10-6系列土壤稀释液。

上述操作均在无菌条件下进行，以避免污染。

（2）平板制备和培养
从两个稀释倍数的土壤稀释液中（细菌和放线菌通常用10-5和10-6土壤稀释液，真菌用10-2和10-3稀释液）吸取1.00ml（吸前摇匀），分别放入五套培养皿中（注意每变换一次浓度，须更换一支移液管）；再向培养皿内注入45～50℃的培养基10ml，立即混合均匀，静置凝固后，倒置放于培养箱中培养。

细菌和放线菌在28℃下培养7～10d，真菌在25℃下培养3～5d。

（3）镜检计数
尽管使用不同的培养基，但细菌、放线菌和真菌都可能在同一个培养基上生长，所以必须用显微镜做进一步的观察。

明显有菌丝的一般是真菌，真菌的菌丝为丝状分枝，比较粗大；而放线菌菌丝呈放射状，比较细。

细菌有球状和杆状，有些细菌也形成细小的菌丝。

酵母菌的菌落与细菌的菌落很相似，但在显微镜下容易分辨。

酵母菌个体比较大，一般有圆形、椭圆形、卵形、柠檬形或黄瓜形，有些还有瘤状的芽。

在两级稀释度中，选细菌和放线菌的菌落数为30～200个、真菌菌落数为20～40个的培养皿各5个，取其平均值计算出每组的菌落数。

如果菌落很多，可将其分成2～4等份进行计数。

微生物生物量可以通过微生物细胞个体大小和密度计算得到。

（4）计算
土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W
式中M为菌落平均数：D为稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

1.1.3最大或然计数法（MPN）
一、试剂配制
培养基配制与稀释平板法基本相同，采用试管培养时，培养基中不需加琼脂。

二、食品设备
试管（2㎝×18㎝），其他同稀释平板法。

三、操作步骤
（1）土壤系列稀释液中制备
按稀释平板法制备土壤系列稀释液，一般配制10-1～10-6的稀释液。

（2）接种和培养
从上述土壤系列稀释液中各取1ml接种到平板培养基或试管液体培养基中，每个稀释度重复3～5次，同时设置空白对照，以检验是否被污染。

因微生物类型和生长速度不同，所要求的稀释倍数、培养基和培养时间都有差别(表1-1)。

根据微生物类型分别在28～30℃培养7～30d。

培养结束时，记录出现菌落的平板数量或出现特征反应的试管数。

表1-1 几种主要土壤微生物生理群MPN计数方法
（3）计算
通常将有微生物生长的最后3个稀释度中出现微生物菌落的平板数作为微生物生长指标，从最大或然数表中查出最大或然数近似值，按下列公式计算样品中的微生物数量：
土壤微生物数量（cfu·g-1）=MD/W
式中M为最大或然数近似值；D为全部出现菌落的最高稀释倍数；W为土壤烘干质量（g）。

例如，某土壤系列稀释液1ml接种到5个平板，经培养后，10-3～10-5的稀释液全部出现菌落；接种10-6稀释液的5个平板只有4个出现菌落；接种10-7稀释液的只有1个出现菌落；接种10-8稀释液的全部没有菌落。

由此得到土壤的微生物生长指标为541，查最大或然数表（见附录三，表三）得到其最大或然数近似值为17，乘以第一位数的稀释倍数105，再除以土壤烘干质量即可得到土壤微生物数量。

微生物生长的数量指标都应当是三位数。

但是不管重复数多少，第一位数字如重复数相等，即代表全部重复都出现菌落的最高稀释倍数的数值。

后两位数字依次是以下两个稀释度出现菌落的平板数量。

如果以下稀释液还出现了微生物菌落，则将其出现微生物菌落的重复数加到第三位数上。

例如，10-3～10-8系列稀释液（4个重复）出现菌落的平板数分别为4，4，3，2，1和0.这里10-7稀释液出现菌落的平板数为1，将其加到前一稀释液（10-6）的平板数上，即得该土壤的微生物生长指标为433，查表得最大或然数近似值为30，计算得到每克土壤（新鲜重）的微生物数量为3.0×105。

应注意：如果出现微生物生长的稀释度比没有出现微生物生长的稀释倍数低，则说明微生物在稀释液中不是均匀分布的，在这种情况下就需要对实验方案进行核查。

1.1.4方法评论
最初研究土壤微生物的方法是培养计数法，该方法的优点在于可测定土壤中可培养的、不同类型的微生物数量，包括细菌、真菌和放线菌，特别是可用于测定可培养的、具有特殊功能的微生物种群，如氨化细菌、硝化细菌、反硝化细菌、解磷菌和固氮菌等。

该方法存在的问题是，仅能测定在培养基上迅速生长繁殖，并能够形成菌落或有某种特征的土壤微生物种群，而大部分土壤微生物种群不能在培养基上生长。

另外，在培养基上所形成的菌落可能来自多个细胞，也有可能由菌丝（或多个细胞）发育成菌落。

因此，培养计数法所测定的微生物数量，通常不到土
壤中微生物实际数量的1%，故不能作为土壤微生物的真实数量。

此外，该方法即使用于测定土壤中可培养的微生物数量，测定结果的精确度和重复性较差。

1.2直接镜检计数法
1.2.1概要
由于土壤微生物的特性和培养基的局限性，通过在培养基上生长的菌落数量来间接地计算土壤微生物数量，一般只能测量出土壤中很少的一部分微生物。

因此，一些研究者提出了直接镜检计数法，主要包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法。

使用一般的染色剂进行涂片染色，镜检时很难区别死的微生物细胞和土壤颗粒，这里仅介绍FDA染色涂片测定活菌丝数和FITC染色测定活细菌数的方法。

涂片法的基本原理：将一定量的土壤悬浮液涂抹在载玻片上，风干染色后进行镜检计数，从而计算出单位质量土壤的微生物数量。

由于使用特别的染色剂可着色活细胞，从而可测定土壤活体微生物数量。

琼脂薄片法的基本原理：在制备土壤悬浮液时加入一定量琼脂，在进行土壤分散的同时进行加热，取一定量的土壤-琼脂悬浮液制成琼脂薄片，染色后进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

膜过滤的基本原理：将土壤悬浮液用无菌水稀释，取一定量的稀释液染色后，用微孔膜过滤，对微孔膜上的微生物进行镜检计数，再计算出单位质量土壤的微生物数量。

1.2.2 FDA染色涂片法测定活菌丝数
一、试剂配制
磷酸盐缓冲液（0.06mol·L-1）：8.28 g 溶于1L去离子水，10.68g 溶于1L去离子水；将两种溶液按28﹕72的比例混合，调节pH值使其与土壤pH值大致相同。

FDA染色液：见附录二。

琼脂溶液（1.5%）：1.5g琼脂溶于100ml磷酸盐缓冲液中（pH7.6）。

二、仪器设备
三角瓶（200ml），试管（15ml），振荡机，载玻片（图1-1），盖玻片，荧光显微镜等。

图1-1 染色-镜检法涂片
外圆面积1cm2，半径5.64㎜，内圆半径3.64㎜，镜检必须在外圆边缘约1.7㎜以内的区域进行
三、操作步骤
（1）土壤分散
取10.00g新鲜土壤（＜2㎜）于200ml三角瓶中，加入95 ml 0.06 mol·L-1磷酸盐缓冲溶液，充分振荡15 min。

（2）染色
取1 ml 土壤悬浮液于15 ml的试管中，加入4 ml 磷酸盐缓冲溶液，再加入1 ml FDA染色液。

室温下培养3 min 后，加入1 ml 琼脂溶液，混匀。

（3）涂片和镜检
取0.1 ml 上述土壤-染色液-琼脂混合液均匀地涂于如图1-1所求的载玻片上，盖上盖玻片，迅速用荧光显微镜进行镜检计数。

镜检计数方法见下文的琼脂薄片法。

（4）计算
土壤活菌丝的生物体积及生物量碳计算方法同琼脂薄片法。

1.2.3 FITC染色涂片法测定活细菌数
一、试剂配制
Tris-盐酸溶液I ：6.35 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

Tris-盐酸溶液II ：25.4 g 三羟基氨基甲烷溶于800 ml 去离子水，用浓盐酸调节pH值至7.5，定溶至 1 L。

INT溶液：2 g 氯化2-（p-碘苯基-3-p-硝基苯）-5-苯四氮唑溶于1 L Tris-盐酸溶液II中。

NADH-NADPH混合溶液：0.4 g NADH和0.4 g NADPH溶于100 ml Tris-盐酸溶液II中。