测序结果处理方法及聚类分析(DOC)

一、测得序列的拼接及处理

1、送样类型

a非克隆法（如PCR产物、PCR产物纯化回收等）

由于此类型样品，两端的引物序列一般在测序的过程中会有缺失，很难找全引物序列，仅能找到部分引物序列，因此对于此类型样品的测序结果可以不做引物序列的查找，后续需要可再做引物序列的查找。

b克隆法（片段通过TA克隆或其他载体构建等）

此类型样品，目的片段两端的引物可以很完整的保存在载体中，引物序列亦是测序片段，所以引物序列比较完整，可以找到引物的完整序列，因此可以通过查找引物序列而找到目的片段的起始位置。

2、测序方法

观察峰值图可用软件“bioedit”

a单向测通

对于此种测序结果基本上单条序列不需要拼接，通过观察序列峰值图来初步判断序列结果的准确性，一般来说峰越尖越好，套峰越少越好。

b双向测通

对于此种测序结果，除了要观察峰值图的好坏外，要得到完整的序列，还需要对双向序列进行拼接，利用DNASTAR中seqMan进行拼接，点击“NEW”、“add sequence”（一般为abi格式，选择双向测序结果）、“assemble”，“contig”，一般保存完整的片段长度即选择“All”，亦可保存其中的片段长度，保存格式一般选择“fas”格式以便在不同的编辑软件中使用。具体步骤如下图。

3、对测得的序列进行比对及聚类分析

一般来讲，可以将所有需要进行比对的序列粘贴在一个记事本中，保存的格式最好

为“fas”格式，，利用软件“MEGA”中“Align”打开所需序列，依据序列的特性进行选择如DNA或protein，然后添加所有需要进行比对的序列。

可根据序列的具体情况进行选择比对的方法，本教程选择“ClustalW”法。

析，可保存为该软件格式，或其他格式。

进行序列数据模型的分析，如图

结果选择建树

聚类完成。

4、进化树构建

如若要构建进化树，则需要将目的片段序列，至“NCBI”或其他网站上进行“blast”，得到近源种或属，即指比对分值比较高的序列，同时需要选择亲缘关系较远的种或属序列，作为参考序列，进行比对和聚类分析，即得到进化树