细胞爬片实验方案
细胞爬片免疫荧光实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min，PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；
5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；
第二天：
6. 加荧光二抗：PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；
注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；
8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞生物学实验-细胞爬片
二、实验目的
1．巩固细胞传代技术。 2．掌握细胞爬片的方法。 3. 为细胞骨架的观察提供实验材料
三、实验材料及设备
1.细胞 CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa
2.试 剂 DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶
3.仪 器
超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜
4.其它用品： 盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、 试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、 废液缸。
细胞传代（II） -------细胞爬片
2018.10.19
一、实验原理
1.细胞爬片
细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在 玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片， 细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也 可以用细胞爬片专用玻片。使用普通盖玻片时， 要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高 压灭菌。专用玻片通常已经过处理可直接使用。
6. 加两滴管含10%FCS的DMEM培养基反复冲瓶壁上 的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成 细胞悬液，细胞计数，将细胞稀释成1105/mL）
7. 在35mm培养皿中加入1 mL细胞悬液+1 ml完全培 养基，镜下观察细胞密度和状态，标记细胞名称及 操作者。
8. 将细胞放入5%CO2、37℃培养箱培养，至下次课 期间换液即可。
9. 整理实验用品。
下次课内容：细胞骨架及细胞核染色 11月2日：期中考试（已学操作，无菌规范）
四、实验步骤：
1. 将超净台内物品，按照无菌操作要求摆放。
2. 用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养 皿中。
3. 打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉 或吸出培养基。细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。
细胞爬片免疫组化步骤
1.转染48小时后，弃去旧液，1ml PBS洗两遍用BD公司的固定透膜液400ul （Fixation and Permeabilization Solution）于4度冰箱内固定透膜20分钟后，PBS洗两遍
2.用弯曲的针头挑起爬片，镊子夹出置于载玻片上，内源性过氧化物酶阻断剂室温（无色液体）孵育10分钟
3.吸水纸吸去阻断剂后将玻片在摇床上PBS中洗3次，每次5分钟。
（若洗的次数多则细胞脱片程度也有可能加大，摇洗的力度也不宜过高）
4.滴加试剂A（蓝色液体）室温孵育10分钟，用吸水纸从一侧吸去，勿洗。
5滴加20倍稀释的单抗，800倍稀释的感染血清，于湿盒内37度孵育2小时。
6.吸水纸吸去稀释后的一抗，在摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
7.滴加试剂B（黄色液体）室温孵育10分钟。
8.吸水纸吸去试剂B后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
9.滴加试剂C（橙色液体）室温孵育10分钟。
10.吸水纸吸去试剂C后，于摇床上PBS洗3次，每次5分钟。
11.显色剂DAB显色。
细胞免疫荧光实验步骤
细胞爬片免疫荧光实验步骤第一天：1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；3. 0.5%Triton X-100( PBS配制)室温通透20min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭30min；5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃孵育过夜；第二天：6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7. 复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。
10000-30000左右2.给药处理24h。
3.PBS洗三遍。
4. 4％冷的多聚甲醛固定15分钟，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
（避光）5.0.5％Triton X－100（PBS配）破膜15min，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
6.5%BSA （牛血清白蛋白，PBS配）封闭60分钟,不用洗。
7.加一抗孵育（5%BSA配），4℃摇床过夜。
8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）9. 回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。
10. 0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。
细胞爬片的方法与心得
细胞爬片的方法与心得【爬片的准备】1、爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2、应用盖玻片，可根据自己的需要剪裁成合适的大小，以备置于6孔板、12孔板或24孔板；3、将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍（个人认为主要目的是冲洗干净就可以了），放在饭盒或者培养皿（一定是玻璃的哦，要不然就……）中烘干后进行高压消毒。
【培养板的准备】1、泡酸过夜2、冲洗，烘干（1、2步骤与前大致相同）3、放入超净工作台用紫外线照1～2小时就可以用了（在照之前可以将爬片一并放入，若细胞贴壁能力不强，可经多聚赖氨酸浸片后放入。
贴壁能力强的话，就可以省略了，进行紫外线消毒）注：此步自己的经验是爬片可以先浸入消毒后的PBS内，紧接着放入培养板内。
目的：浸过PBS的爬片依靠表面的液体，可以用培养板孔底贴和紧密，以利于细胞长到爬片上。
（自己刚开始做的时候，经常就是细胞全都长在了爬片与培养板之间，爬片上细胞罕见。
）【细胞爬片】1、胰酶消化细胞后计数2、根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可3、第二天即可进行干预措施多聚赖氨酸的浓度要求应该不严格，主要就是将贴壁能力弱的细胞固定上去，如0.1％（w/)，消毒可用紫外线照射。
园子里搜到的玻片的处理方法：玻片泡酸，自来水冲洗数遍，去离子水冲洗，就像细胞培养瓶等的那种处理就可以。
然后放在小饭盒或者玻璃皿里高压灭菌。
再烤干备用。
将玻片用灭菌镊子放于培养皿中，加细胞。
整个过程注意无菌操作就是了。
也没啥难的。
要注意的是：1.泡过酸的玻片特别脆。
用镊子夹着过水。
要冲得充分，和那些细胞培养用玻璃管，瓶等的原则一样。
2.如果你觉得玻璃片太大。
可以在泡过酸，水冲洗过用磨石在玻璃片上划痕，掰开。
我曾将一个玻璃片分成4个小片，在12孔，24孔板里放一两片那种。
3.有个问题我一直没有解决好：就是加上培养基后玻璃片拿动培养皿时，玻璃片会窜，常会压到长在皿底部的细胞。
细胞爬片的免疫组化
细胞爬片的免疫组化（05-9-25）
实验目的：
1、通过免疫组化的方法观察C6细胞GFAP和MAP2的表达情况；
2、进一步熟悉和完善免疫组化的方法；
3、进一步检测现有一抗是否起作用。
实验准备：
1、接种两天、生长状态良好的细胞爬片；
2、免疫组化/荧光公共实验平台；
3、一抗，SP试剂盒，DAB显色剂等。
主要过程：
1、爬片弃废液，PBS洗3min×3遍；
2、4％PFA室温固定10min；
3、PBS洗3min×3遍；
4、加SP试剂盒中的A（过氧化物酶阻断剂），室温作用10min；
5、PBS洗3min×3遍；
6、加B（正常非免疫动物血清封闭液），室温作用10min；
7、加一抗：mouse anti GFAP 1：50，MAP2 1：50各50μl对照加等量PBS，4℃
保湿8h；
8、PBS洗3min×遍；
9、加C（生物素化二抗），室温作用10min；
10、PBS洗3min×3遍；
11、加D，室温作用10min；
12、PBS洗3min×3遍；
13、新鲜配制的DAB显色，显微镜下观察，适时终止（5min左右，PBS洗
掉）；
14、PBS洗3min×3遍；
15、苏木素复染胞核1min，自来水小心冲洗至玻片呈蓝色；
16、梯度酒精脱水（70％、80％、90％、95％、100％）各5min；
17、二甲苯/无水乙醇1：1 10min；
18、二甲苯透明：15min×2；
中性树胶封片，观察、拍照。
细胞爬片 细胞生物学实验报告
细胞生物学实验报告细胞爬片姓名：学号：班级：专业：同组成员：一、实验原理细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。
使用普通盖玻片是，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。
专用玻片通常已经过处理可直接使用。
细胞爬片常用的方法有两种：（1）细胞爬片时用无菌小镊子将处理好的玻片放到细胞培养板中，可按照普通细胞传代的方法进行细胞的消化和传代。
细胞会在玻片上贴壁生长。
特别提示：比如在六孔板中放入爬片,六孔板的孔底面积往往会比爬片面积多出一部分，加细胞悬液时常常就是细胞铺满整个孔底，有时细胞生长会出现边缘现象，就是靠近边缘密度要高些,这样处于中央玻片上爬的细胞数量就可能相对较少，实验中所需的细胞数量要比实际在玻片中生长的细胞多。
（2）另一种方法是将玻片放入孔板的孔内后,加细胞悬液时只滴到玻片上,一直滴到液体布满整个玻片又不会溢出玻片边缘(因为液体表面张力作用可以很容易做到这一点!)，小心将孔板放在培养箱中，待细胞贴壁后取出，再滴加培养基布满整个孔底，继续培养，这样玻片上的细胞生长的密度就会很集中，相对比较节省细胞。
二、实验目的1．巩固细胞传代技术。
2．掌握细胞爬片的方法。
3. 为细胞骨架的观察提供实验材料三、实验器材1.细胞CHO细胞、鸡胚成纤维细胞、HeLa2.试剂DMEM培养基、血清、抗生素、胰酶3.仪器超净工作台、CO2培养箱、倒置相差显微镜4.其它用品：盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿、试管、移液管，滴管，酒精灯、75％酒精棉球、废液缸。
四、方法与步骤（1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。
要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。
（2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。
打开照明灯。
（3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。
细胞爬片RNAFISH具体步骤及说明
细胞爬片RNAFISH具体步骤及说明细胞爬片RNA FISH具体说明及步骤一、检测原理RNA荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization），简称为RNA FISH，是一种重要的非放射性原位杂交技术。
传统的RNA FISH，直接在oligos上标记荧光素，根据碱基互补配对原则，与待检测的RNA特异结合，通过荧光显微镜以检测荧光信号，该方法一般需要20个oligos以上，以便检测到较强较多的荧光信号点。
本系统中SA（链霉亲和素蛋白）是一类四聚体蛋白，大小为66KDa，每一分子SA能够与四分子生物素进行高度特异性的结合，且两者之间的亲和力较强。
应用该原理，我们将染料Cy3偶联到SA蛋白上，一分子SA能偶联上6个Cy3；同时在探针上标记生物素，将两者在体外进行亲和连接，大约每个SA能与4条oligo-Biotin结合，每个SA上有6个Cy3，也就是每一条探针上连接了6个Cy3，因此该方法具有一定的放大信号的作用二、实验方法贴壁细胞（以48孔板为例）1.按照1×104细胞/孔的密度将贴壁细胞接种于48孔板（孔内提前放入已处理好的且大小合适的盖玻片）中（建议事先铺在Confocal专用培养皿中），于培养箱中培养过夜；2.吸弃培养基，PBS洗两次，每次5min；3.吸弃PBS，每孔加入100μl 4%多聚甲醛，室温固定15min；4.吸弃4%多聚甲醛，每孔加入100μl 0.5% Buffer A（现用现配）室温处理细胞15min（细胞通透）；5.吸弃0.5% Buffer A，PBS洗两次，每次5min；6.每孔加入100μl 1×封闭液，37°C孵育30min；7.吸弃1×封闭液，每孔加入100μl 2×Buffer C，37oC培养箱放置30min；8.Buffer E提前在73oC水浴锅孵育30 min，至澄清透亮；探针稀释：可参看标签或报告单上所示参数：nmole/OD260，例如：nmole/OD260= 4.17，则在每OD探针干粉制品中加入41.7μl灭菌DEPC水，混匀后即得浓度约为100μmol/L的储存液，建议进行分装后避光储存于-20°C，避免多次冻融操作；10.配制探针工作液：将探针储存液稀释至1μmol/L，放入75°C 水浴锅变性10min，然后与SA-Cy3按比例加入到PBS，（以10μl体系为例，即1μl 1μmol/Lbiotin-probe+1μl1μmol/LSA-Cy3+8μl PBS），37度孵育30min（可做预实验确定探针和SA-Cy3的比例，例如1:1，2:1，4:1，8:1等）；11.将上述10μl探针工作液和90μl Buffer E混匀；12.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl变性后的探针混合液，采取避光措施后置于37oC培养箱中杂交过夜（12-16h）；13.杂交次日，将样本从37oC培养箱取出，吸弃探针混合液，每孔加入100μl0.1% Buffer F于37oC洗涤10min；14.吸弃0.1% Buffer F，每孔加入100μl的2×Buffer C，60oC 洗涤10min，洗涤3次；15.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl 的2×Buffer C，37°C洗涤10min，洗涤3次；（如果背景深时，建议适当提高洗涤温度及次数）16.吸弃2×Buffer C，每孔加入100μl稀释后的DAPI工作液，避光染色10 -20min；17.吸弃DAPI工作液，PBS洗涤2次，每次5min；18.滴加甘油或抗淬灭剂，盖上盖玻片，封片胶封片于荧光显微镜下观察。
细胞免疫荧光实验顺序
精心整理细胞爬片免疫荧光实验步骤
第一天：
1.在培养板中将已爬好细胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
7.复染核：滴加DAPI避光孵育5min，对标本进行染核，PBST5min×4次洗去多余的DAPI；8.用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤
1.在24孔板里加500微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以30-50%汇合度较好。
10000-30000
精心整理
左右 2.给药处理24h。
3.PBS洗三遍。
8. 收集一抗，PBS洗三遍，每次5min，摇床。
孵育二抗Alexa Fluor 488（1:1000 ）,室温60min（避光）
9.回收二抗，PBS洗三遍，摇床，每次5min。
10.0.5ug/mLDAPI（5%BSA配，2滴/ml）染核15min。
（避光）
11. PBS洗三遍，每次5min，摇床。
12.取载玻片，滴加10uL抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上，指甲油封片子的对角线。
All steps forIF
1) Remove culture medium and fix cells (a common fixative is 4%
formaldehyde in PBS, for 15 minutes)。
细胞爬片制备
细胞爬片制备细胞爬片制备是一种常用的实验技术，用于研究细胞的形态、结构和功能。
本文将介绍细胞爬片制备的原理、步骤和注意事项。
一、原理细胞爬片制备是通过将细胞附着在载玻片上，使其保持形态并能够观察和分析。
一般来说，细胞爬片制备包括以下几个步骤：细胞培养、处理、固定和染色。
二、步骤1. 细胞培养：将需要研究的细胞株培养在含有合适培养基的培养皿中，确保细胞的健康生长。
2. 处理：根据实验需要，给予细胞相应的处理，例如添加药物、激素或基因转染等。
3. 固定：用适当的固定剂处理细胞，使其保持在原位，不发生移动或变形。
4. 染色：使用合适的染料对细胞进行染色，以便观察细胞的形态和结构。
三、注意事项1. 细胞培养要注意无菌操作，避免细胞受到污染。
2. 处理细胞时要根据实验设计进行，注意处理时间和浓度的控制。
3. 固定细胞时要选择合适的固定剂和浓度，避免对细胞造成损伤。
4. 染色时要选择适当的染料，并按照染色剂的使用方法进行操作，避免染色不均匀或过度染色。
四、实验结果的分析与展示细胞爬片制备完成后，可以使用显微镜观察细胞的形态和结构，并进行图像的采集和分析。
可以根据实验的需要，选择合适的显微镜镜头和放大倍数，获得清晰的细胞图像。
通过图像分析软件可以对细胞的形态、大小、数量等进行定量化分析，进一步研究细胞的功能和特性。
细胞爬片制备是细胞生物学研究中常用的技术方法之一，可以帮助科研人员观察和分析细胞的形态和结构。
通过细胞爬片制备，可以了解细胞的生理状态和功能，对细胞的研究提供重要的实验依据。
在进行细胞爬片制备时，需要注意细胞的培养、处理、固定和染色等步骤，以及实验结果的分析和展示。
只有掌握了细胞爬片制备的技术原理和操作要点，才能获得准确、可靠的实验结果，推动细胞生物学的发展。
细胞爬片制作(Hela细胞为例)
细胞爬片SOP（以Hela为例）
1、在六孔板中加入细胞爬片，然后铺上5X105个细胞培养24h.
2、待细胞贴壁后，配制转染混合液，将2ugDNA加至250ul无血清DMEM中混匀，室温静置5min；加5ul soinfection 转染试剂加至250ul 无血清DMEM中混匀，室温静置5min；然后将两者混匀室温孵育30min.
3、将转染混合液缓慢而分滴加至6孔板中培养48-72h
4去细胞上清，用PBS清洗2次，新配80%冷丙酮固定液加入细胞中，室温作用10min，
5、PBS洗2遍，每次洗5min。
加入2%BSA（每孔500ul）封闭30min，再次PBS清洗两次
6、加入0.1% Triton-X100（每孔500ul）孵育10min,PBS清洗两次
7、加入稀释好的一抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
8、PBS清洗3次，加入稀释好的二抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
9、用PBS清洗三次后进行细胞核染色。
加1:200稀释好DAPI染色，室温作用30min。
10、用PBS清洗2次后，将爬片取出，用吸水纸吸干表面水并去除周边细胞，用记号笔圈出孵育抗体的细胞。
11、滴一滴封片剂在载玻片上，然后将细胞爬片倒放在载玻片上，用白色指甲油封片。
细胞爬片实验方案
准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS4%多聚甲醛溶液:多聚甲酵40g O.lmol/L磷酸缓冲液至1000 mL方法:称収40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液,加热持续搜拌(或磁力搅拌)使粉末完令溶解,通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L的PBS至1000 mL,充分混匀。
0.1 M (pH 7.4) PBS1 mol/L Na2HP0477.4ml1 mol/L NaH2P0422.6ml蒸馏水加至10001爬片的准备爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片,根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;将剪裁好的爬片,泡酸过夜,捞出后流水洗净,烤干浸泡于75%酒精中备用2细胞爬片用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成细胞悬液,计数,根据需要调整细胞到适当密度。
取无菌的细胞培养板,先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触)。
将玻片小心从洒精中取出,在酒精灯火焰外焰轻轻划过,使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。
待冷却后,将玻片轻轻放入培养板中,然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。
然后置于37°C5%C02的细胞培养箱屮培养。
培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养（2ml, 100µg ml-1 in DMEM）6h后，用PBS冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。
对于贴壁能力较弱的细胞,爬片前应将玻片置于细胞培养板中,用PLL包被至少Ih。
3细胞固定爬片置于37°CPBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15分钟,然后再用37°CPBS将多聚甲醛冲干净,清洗过程要注意手法轻柔,否则细胞会从玻片上脱落。
固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干,然后用50%的甘油PBS溶液封片,备用。
4共聚焦显微镜激发690nm, 荧光在400nm左右。
细胞爬片
第一，盖玻片需要过酸，并且自来水、蒸馏水冲洗干净。
两张或者以上的玻片很容易因为虹吸作用粘到一起，很容易冲不干净，很容易把两张完全重叠在一起的玻片当成一张，一定要看清楚，晾干片子最好是在消毒饭盒中进行，饭盒底面放上纱布，将玻片斜靠在饭盒侧壁，玻片正面不要接触纱布，否则会粘上毛毛的。
然后高压蒸汽灭菌，烤箱中烤干。
第二，爬片前最好用多聚赖氨酸或者层粘蛋白或者胶原溶液处理玻片，未处理过的细胞不容易贴壁，细胞系还好，原代细胞很少能贴得牢。
这一步至关重要，否则在后面用PBS洗片时很容易将细胞洗掉。
用这些促进细胞贴壁的溶液处理玻片后，放到培养皿之前需要用培养基冲洗一到三遍！层粘蛋白和胶原还好，多聚赖氨酸有几次我没冲结果细胞全部不贴壁。
第三，传代消化下来的细胞一定不要过多稀释，将浓一点的细胞悬液吹打混匀后滴在玻片上，几个小时后再追加培养基。
第四，玻片在培养皿中容易漂起，如果事先在皿中铺上液体很可能会不容易揭下来，或者揭下来时出印子在镜下很难看。
漂起的玻片很容易两面都培养出细胞的，这时背面的细胞必须去除，挺难操作的，用PBS冲洗可能会伤到正面的细胞，用小镊子夹玻片很容易夹碎，也很容易脱落，小心点好。
第五，将玻片拿出后一定要记好哪边是正面，最好做玻片时将玻片切成长方形的。
目前市场售的多为18mm x 18mm的盖玻片，或者24mmx24mm的盖玻片，正方形，很难分辨反正面，在某个角上打个缺口，对正方形是不中用的。
可以用小砂轮切一下改成长方形，至于在某个角上用砂轮做个标记，理论上很简单，实际操作有难度。
第六，上面步骤都没问题后，玻片就需要进一步处理了，这里有几个细节，分述如下：1.PBS对玻片是冲洗还是浸泡，我个人认为浸泡好，我吃过冲洗的亏，每一步后都要冲洗2-3次，有时还没等试验做完，大部分细胞已经被冲掉了，呵呵！我当时欲哭无泪啊！2.4%的多聚甲醛或者别的固定液的温度是多少，有人认为4°C的好，有人认为37°C的好，我个人感觉，娇贵的原代细胞先在常温下固定较好，然后放到4°C冰箱中。
实验报告-细胞爬片
细胞生物学实验报告实验三细胞爬片1引言1.1 实验目的1．巩固细胞传代技术。
2．掌握细胞爬片的方法。
3. 为细胞骨架的观察提供实验材料。
1.2 实验原理细胞爬片：细胞爬片就是让玻片浸在细胞培养基内，细胞在玻片上生长，主要用于组织学，免疫组织化学，切片，细胞涂片，原位杂交等。
细胞爬片采用的玻片可以是普通的盖玻片也可以用细胞爬片专用玻片。
使用普通盖玻片时，要按照玻璃器皿的清洗方法进行清洗，并进行高压灭菌。
专用玻片通常已经过处理可直接使用。
2实验仪器、试剂及操作步骤2.1 实验仪器超净工作台、倒置相差显微镜、CO2培养箱、酒精灯、75％酒精棉球、酒精喷壶、试管架、滴管筒（头）、废液缸、镊子、玻璃平皿、盖玻片（无菌）、35mm细胞培养皿（六孔板）、培养瓶等2.2 实验试剂DMEM培养基、血清、抗生素、胰蛋白酶消化液等2.3 实验材料鼠胚成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞2.4 实验步骤1.实验室和超净工作台消毒，紫外照射20Min左右。
2.穿好实验服，进无菌室前穿鞋套、洗手。
3.关闭紫外灯，开日光灯和开风机，超净工作台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，擦拭台面。
4.在显微镜下观察细胞生长状况。
5.用灭菌小镊子将处理好盖玻片轻轻放入35mm培养皿中。
6.打开细胞瓶盖并在酒精灯上轻轻烧口消毒，倒掉或吸出培养基。
7.加一滴管胰酶轻轻漂洗一下细胞，使其湿润整个细胞层，弃胰酶，再加入一滴管胰酶，盖好瓶盖。
8.显微镜下观察细胞的消化状态，待细胞大部分收缩、突起、变圆，细胞边界清晰时，即可竖立或翻转培养瓶停止消化，在超净台内靠近火焰处弃胰酶。
9.加两滴管的DMEM培养基反复冲瓶壁上的细胞层，至全部冲下，滴管轻轻吹打，混匀，成细胞悬液，进行细胞计数。
取少量细胞悬液与EP试管里，检查计数板并清洗，先将盖玻片安放在计数室上面，然后摇匀样品取悬液，从盖玻片边缘滴加细胞悬液，连续2-3次，直至充满计数板和盖玻片间的空隙。
将加好样品的计数板置于显微镜载物台的中央，然后按下列步骤操作：1）找计数室，先在低倍镜下寻找计数板上的大方格位置。
4%多聚甲醛固定细胞爬片流程
4%多聚甲醛固定细胞爬片流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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细胞爬片实验方案
准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS4%多聚甲醛溶液:多聚甲酵40g O.lmol/L磷酸缓冲液至1000 mL方法:称収40g多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液,加热持续搜拌(或磁力搅拌)使粉末完令溶解,通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L的PBS至1000 mL,充分混匀。
0.1 M (pH 7.4) PBS1 mol/L Na2HP0477.4ml1 mol/L NaH2P0422.6ml蒸馏水加至10001爬片的准备爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片,根据自己的需要剪裁成合适的大小,以备置于6孔板、12孔板或24孔板;将剪裁好的爬片,泡酸过夜,捞出后流水洗净,烤干浸泡于75%酒精中备用2细胞爬片用胰酶消化好细胞,充分吹打,使之成细胞悬液,计数,根据需要调整细胞到适当密度。
取无菌的细胞培养板,先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触)。
将玻片小心从洒精中取出,在酒精灯火焰外焰轻轻划过,使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。
待冷却后,将玻片轻轻放入培养板中,然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。
然后置于37°C5%C02的细胞培养箱屮培养。
培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养（2ml, 100µg ml-1 in DMEM）6h后，用PBS冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。
对于贴壁能力较弱的细胞,爬片前应将玻片置于细胞培养板中,用PLL包被至少Ih。
3细胞固定爬片置于37°CPBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15分钟,然后再用37°CPBS将多聚甲醛冲干净,清洗过程要注意手法轻柔,否则细胞会从玻片上脱落。
固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干,然后用50%的甘油PBS溶液封片,备用。
4共聚焦显微镜激发690nm, 荧光在400nm左右。
细胞爬片步骤
细胞爬片细胞爬片【玻片的准备】1. 爬片可用一般的盖玻片，也可用专用爬片；2．将剪裁好的爬片，置于浓硫酸中浸泡并过夜，第二天先用自来水冲洗20遍，再用三蒸水冲洗3遍，放在饭盒或者培养皿中烘干后进行高压消毒再烘干。
4.多聚赖氨酸处理玻片，以使细胞与玻片结合更牢。
【细胞爬片】1. 胰酶消化细胞后计数重悬细胞于完全培养基中。
2. 加细胞时，根据玻片的大小，先在每个孔里准备放爬片的位置滴少量培养基，目的是使玻片与培养皿靠培养基的张力粘合到一起，然后放玻片，防止加细胞悬液时玻片漂起，造成双层细胞贴片。
整个过程注意无菌操作。
3. 根据自己的需要选择合适的细胞密度种入培养板内即可。
4. 待细胞贴壁后，可去上清加含药培养基。
5. 按照实验设计，作用一定时间后取玻片。
取玻片时由于玻片与培养皿底结合较紧，张力较大，我一般将注射器针头针尖向背面弄个小钩，这样将爬片轻轻勾起，用小镊子取出就可以了。
将所需数量的爬片取出时应用酒精灯火焰烧一下针头和镊子。
【细胞爬片的固定】1.细胞爬片取出后，一般用PBS洗x2遍，然后再做固定。
2.室温固定15分钟后，弃去固定液，PBS洗3x3min，洗尽液体。
3.将表面液体吹干，入-20℃保存以下为常用的固定液（1）. 多聚甲醛(常用4%)：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光以及TUNEL染色。
主要检测组织内一些性能娇弱的抗原特别是细胞表面抗原，室温固定15分钟后，将表面液体吹干，入-20℃保存（2）. 甲醛(福尔马林)应用最广缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。
可造成假阴性的染色结果。
（3）. 冷丙酮可用于一般的免疫组化染色。
2 / 2（4）. 95％乙醇，可用于免疫组化。
优点：穿透性强、抗原性保存较好。
缺点：但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。
爬片和组化的实验步骤
爬片和组化的实验步骤实验九组织切片与细胞爬片/涂片的HE染色【实验目的】1．掌握细胞涂片的HE染色方法2．熟悉细胞涂片及爬片的制备方法【实验原理】苏木素-伊红染色又称HE染色，是目前应用最广泛的染色方法。
苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色。
HE染色主要用于显示各种组织的正常成分和病变组织的一般形态结构，各种组织或细胞的一般形态、结构特点和病变的发生、发展及修复的全过程，在质量较佳的HE染色切片上，基本上都可以观察到，从而进行判定或研究。
HE 染色适用于各种固定、包埋方法制作的石蜡切片、冰冻切片和细胞涂片，且切片不易褪色，可以长期保存。
HE染色在病理诊断、教学和科研中具有重要的价值。
【实验方法】1．细胞爬片的制备（1）将灭菌的载玻片放入培养板内。
（2）将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中，根据实验目的选择培养基或加入药物。
（3）将孔板放入37℃二氧化碳孵箱中孵育数小时或过夜，待细胞的贴壁密度符合实验要求时，吸去孔板内的培养基或药物，用37℃预温的0.1mol/LPBS漂洗一次。
（4）吸去孔板内的PBS液，加入4%多聚甲醛室温固定15～30min。
（5）吸去4%多聚甲醛，用PBS漂洗3次，每次间隔3min。
（6）取出细胞爬片，晾干后存放于-20℃或直接进行染色。
2．细胞爬片的制备备选方法将培养好的贴壁细胞消化后离心，计数，按照一定的细胞密度加入孔板中（24孔），根据实验目的选择培养基或加入药物，培养到预定时间点。
取出培养板，1000rpm离心5min后，弃上清。
每孔加入PBS2ml,1000rpm离心5min，弃上清；重复1次，共进行2次洗涤。
3．细胞涂片的制备收集处理的细胞，PBS洗2次后，调细胞密度为0.3～0.5某106/ml,按照每片0.1ml，用涂片离心机制备涂片；或者调细胞密度为0.3～0.5某107/ml,取0.005ml涂于载玻片上。
细胞爬片制作（Hela细胞为例）
细胞爬片制作（Hela细胞为例）
细胞爬片SOP（以Hela为例）
1、在六孔板中加入细胞爬片，然后铺上5X105个细胞培养24h.
2、待细胞贴壁后，配制转染混合液，将2ugDNA加至250ul无血清DMEM中混匀，室温静置5min；加5ul soinfection 转染试剂加至250ul 无血清DMEM中混匀，室温静置5min；然后将两者混匀室温孵育30min.
3、将转染混合液缓慢而分滴加至6孔板中培养48-72h
4去细胞上清，用PBS清洗2次，新配80%冷丙酮固定液加入细胞中，室温作用10min，
5、PBS洗2遍，每次洗5min。
加入2%BSA（每孔500ul）封闭30min，再次PBS清洗两次
6、加入0.1% Triton-X100（每孔500ul）孵育10min,PBS清洗两次
7、加入稀释好的一抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
8、PBS清洗3次，加入稀释好的二抗（每孔50ul）至孔板中间部位，室温孵育1h。
9、用PBS清洗三次后进行细胞核染色。
加1:200稀释好DAPI染色，室温作用30min。
10、用PBS清洗2次后，将爬片取出，用吸水纸吸干表面水并去除周边细胞，用记号笔圈出孵育抗体的细胞。
11、滴一滴封片剂在载玻片上，然后将细胞爬片倒放在载玻片上，用白色指甲油封片。
细胞免疫组化
细胞免疫组化细胞爬片的免疫组化1.细胞爬片，5天后进行免疫细胞组织化学染色定。
2.PBS清洗标本3次各1min。
3.冰丙酮固定15min(或4%多聚甲醛固定30min)。
4.5.PBS7.PBS9.DPBS10.11.12.PBS13.14.PBS15.试剂D（湿盒）37℃30min。
16、PBS清洗标本3次各5min。
17、DAB显色（避光，镜下观察至棕色）约3~10min。
18、蒸馏水洗2次1min。
19、苏木素复染0.5~1min。
20、自来水洗返蓝。
21.梯度酒精脱水75，85，95，100%各3min。
22.二甲苯透明2次3min。
23、中性树胶封片。
注意事项：1、良好的细胞爬片是进行免疫组织细胞的基础，要获得良好细胞爬片须ab2、可用345、细胞爬片固定后在孔板里做免疫组化还是粘到载玻片上再做？1.如果不看荧光，两种都可以，感觉粘好了再做要快一些，但是做的时候要防止脱落。
如果看荧光，就不能用中性树胶粘，直接在24孔，或6孔板里做才可以。
中性树胶要折光，散射的光干扰，没办法看细胞本身的荧光。
2.孔板里做免疫组化较方便，细胞比盖玻片易贴壁，但染色后不能用二甲苯透明、封片（可用甘油）。
细胞爬片固定后粘到载玻片上不太可能，只有开始就让细胞贴在玻片上爬片。
3.我没有在多孔板里做过，其实把细胞爬在盖玻片上也不是很麻烦，偶这样做很少掉片。
1..多谢!!0.04--0.08%议对于细胞爬片，还是尽量快的进行处理，以防不必要的问题!2.louischenwrote:但我的细胞爬片经过4%多聚甲醛固定，PBS冲洗后直接就放在了-20度，还能用于免疫组化吗?!3.mRNA原位杂交经4%多聚甲醛固定,固定液需加DEPC水。
其它建议用甲醇固定。
-20度保存4.如果是4%多聚甲醛固定，然后放在PBS中保存，在4度冰箱里保存两周没问题。
时间再长就没试过了。
5.丙酮中固定5-10分钟，然后风干，放置4度保存过夜应该是没有问题。
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准备：盖玻片、4%多聚甲醇、50%的甘油PBS 4%多聚甲醛溶液:
多聚甲酵40g O.lmol/L 磷酸缓冲液至1000 mL
方法:称収40g 多聚甲醛,置于三角烧瓶中,加入500-800 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液, 加热持续搜拌( 或磁力搅拌) 使粉末完令溶解, 通常需滴加少许NaOH才能使溶液清亮,最后补足0.1 mol/L 的PBS至1000 mL,充分混匀。
0.1 M (pH 7.4) PBS
1 mol/L Na2HP04
77.4ml
1 mol/L NaH2P04
22.6ml
蒸馏水
加至1000
1 爬片的准备
爬片可用一般的盖玻片也可用专用爬片, 根据自己的需要剪裁成合适的大小, 以备置于6孔板、1 2孔板或24孔板; 将剪裁好的爬片, 泡酸过夜, 捞出后流水洗净, 烤干浸泡于75%酒精中备用
2 细胞爬片
用胰酶消化好细胞, 充分吹打, 使之成细胞悬液, 计数, 根据需要调整细胞到适当
密度。
取无菌的细胞培养板, 先加少量培养基(以使玻片与培养板紧密接触) 。
将
玻片小心从洒精中取出, 在酒精灯火焰外焰轻轻划过, 使玻片表面酒精燃烧从而起到灭菌的效果。
待冷却后, 将玻片轻轻放入培养板中, 然后将单细胞悬液一逐滴的滴到上而。
然后置于37°C 5%C02 的细胞培养箱屮培养。
培养一定时间后培养液换为含材料的培养液继续共培养( 2ml, 100卩g ml-1 in DMEM ) 6h
后，用PBS 冲洗两遍去除未被吞噬的纳米颗粒，然后取出爬片。
对于贴壁能力
较弱的细胞, 爬片前应将玻片置于细胞培养板中, 用PLL 包被至少Ih 。
3 细胞固定
爬片置于37 ° C PBS中洗三次,每次10到20秒钟,然后在4%多聚甲醛中室温固定15 分钟, 然后再用37° C PBS 将多聚甲醛冲干净, 清洗过程要注意手法轻柔, 否则细胞会从玻片上脱落。
固定后的细胞爬片置于滤纸上晾干, 然后用50% 的甘油PBS溶液封片,备用。
4 共聚焦显微镜
激发690nm, 荧光在400nm 左右。