种子扩大培养
合集下载
7-种子扩大培养
小结
• 种子扩大培养的目的是什么？ • 何谓种子接种龄、接种量？ • 为什么种子要逐级扩大培养？ • 影响种子质量的因素有哪些？ • 保证种子质量有哪些措施？
3，培养时间和冷藏时间
（1）培养时间 • 一般来说，衰老的孢子不如年轻的孢
子，因为衰老的孢子已在逐步进入发 芽阶段，核物质趋于分化状态。过于 衰老的孢子会导致生产能力的下降。 • 措施：孢子培养的时间应该控制在孢 子量多、孢子成熟、发酵产量正常的 阶段终止培养。
（2）冷藏时间
• 斜面冷藏对孢子质量的影响与孢子成熟程 度有关。如土霉素生产菌种孢子斜面培 养4天左右即于4 C冰箱保存，发现冷 藏7~8天菌体细胞开始自溶。而培养5天以 后冷藏，20天未发现自溶。
1，细胞或菌体 • 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观（
色素、颗粒等）
单细胞：菌体健壮、菌形一致、均匀整 齐，有的还要求有一定的排列或形态；
霉菌、放线菌：菌丝粗壮、对某些染料 着色力强、生长旺盛、菌丝分枝情况和 内含物情况好。
2，生化指标 • 种子液的糖、氮、磷的含量和pH变
化。
3，产物生成量
（1）种子罐级数的确定
种子罐的作用在于使孢子瓶中有限数量的孢 子发芽、生长并繁殖成大量菌丝体，接入发酵罐 培养基后能迅速生长，达到一定菌体量，以利于 产物的合成。
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次 数，这一般根据菌种生长特性、孢子发芽及菌 体繁殖速度，以及所采用发酵罐的容积而定。
细菌：生长快，种子用量比例少，级数 也较少，二级发酵。
• 生产规模发酵罐的接种，包括两个方 面：
从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一 个种子罐，
从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
种子扩大培养
如：柠檬酸生产的制种，用麸皮培养基产生大量 孢子直接用于种子罐接种。
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶 中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 如：用灰色链霉菌生产链霉素
用卡那链霉菌生产卡那霉素
对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管 斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
4，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的 产量有一定的关联。
如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关 系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
1、培养基
构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用 量都会对孢子的质量造成影响 如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的 麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢 子质量均有一定影响。 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不 同，孢子质量也不同。
2、培养温度和湿度 温度： 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 如龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子接入 发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前， 菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生 产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。
湿度：制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量 和质量有较大影响。
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但 也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体 的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
2）各级种子的移种方法
孢子悬浮液一般采用微孔接种法接种，摇瓶菌丝种子 可在火焰保护下接入种子罐。 种子罐与发酵罐间的接种方式主要采用差压法
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，可以 用摇瓶液体培养法。孢子接入含液体培养基的摇瓶 中，恒温振荡培养，获得菌丝体，作为种子。 如：用灰色链霉菌生产链霉素
用卡那链霉菌生产卡那霉素
对于不产孢子的细菌，生产上一般采用将试管 斜面菌种接入茄瓶斜面或摇瓶培养 如：谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸
4，酶活力 种子液中某种酶的活力，与目的产物的 产量有一定的关联。
如土霉素发酵中，种子液的淀粉酶活力与发酵单位有一定关 系，可通过测定种子液中淀粉酶的活力判断种子质量
二、影响种子质量的因素
（一）影响孢子质量的因素
1、培养基
构成孢子培养基的原材料，其产地、品种、加工方法和用 量都会对孢子的质量造成影响 如： 四环素、土霉素生产中，配制产孢斜面培养基用的 麸皮，因小麦产地、品种、加工方法及用量的不同对孢 子质量均有一定影响。 制备霉菌用的大米，其产地、颗粒大小、均匀程度不 同，孢子质量也不同。
2、培养温度和湿度 温度： 温度对多数品种斜面孢子质量有显著的影响。 如龟裂链霉菌在高于37˚C培养时，孢子接入 发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基氮回升提前， 菌丝过早自溶，效价降低等现象。一般各生 产单位都严格控制孢子子斜面的培养温度。
湿度：制备斜面孢子培养基的湿度对孢子的数量 和质量有较大影响。
虽然种子罐级数随产物的品种及生产规模而定，但 也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速了孢子发芽及菌体 的繁殖，也可相应地减少种子罐的级数。
2）各级种子的移种方法
孢子悬浮液一般采用微孔接种法接种，摇瓶菌丝种子 可在火焰保护下接入种子罐。 种子罐与发酵罐间的接种方式主要采用差压法
种子的扩大培养名词解释
种子的扩大培养名词解释
农业和科学是紧密联系在一起的，从古至今，改良农作物也一直是提高作物品质和效率的重要方式之一。
改良农作物一般涉及品种改良、育种和种子改良等，其中种子改良是改良农作物的重要方式之一，其中包括种子的扩大培养。
扩大培养，是指将植物原色质组织发育至比原色质组织更大的程度，而发育度由细胞膜和细胞壁及细胞固有的特性决定。
扩大培养的目的是为了将植物的细胞增大，形成更大的种子以提高其生物产量和生物效率。
扩大培养的基本原理是营养物质通过细胞膜被吸收，吸收的营养物质再经过细胞板进行变化，以满足细胞的营养和活动需求。
细胞生长过程中，细胞膜和细胞壁发生变化，使细胞产生更多的蛋白质，细胞分裂更多次，以达到膨大的目的。
扩大培养具有很多优势，它可以有效地提高植物的生长速度，从而改善作物质量；它可以增加植物的适应能力，降低对环境的敏感性；它还可以降低由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的抗逆性。
扩大培养的实践也要依据植物的特性而定，比如植物体内的营养物质储备差别，植物体内的养分分配，植物发育程度等。
通常在实验中，需要对外部环境因素进行控制，如光照、温度和湿度，确保植物生长条件良好，才能获得理想的种子扩大培养结果。
总之，种子的扩大培养作为改良农作物的重要方式，可以有效地改善作物质量，增加由病原菌引起的病害，抵抗病虫害，提高植物的
抗逆性。
但是，为了获得理想的种子扩大培养结果，需要对外部环境因素进行控制，以确保植物生长条件良好。
第六章种子扩培
原始菌种（出发菌种）
三角瓶培养（摇床）
种子罐培养 e.g. yeast：
原始菌种（出发菌种）
10ml 麦汁试管
250ml 三角瓶培养
（27 °C ~28 °C ，3天） （25°C， 2天） 5~10 L卡氏罐 （15 °C ~20 °C ，3~5天）
B：生产车间种子制备： 种子罐的作用：使有限数量的孢子(菌体)发芽、生长、 并繁殖成大量的菌丝体(菌体)，满足发酵罐的需要（菌体生 长和产物形成）。实验室种子进入种子罐有孢子进罐法和 摇瓶菌种进罐法。 种子罐级数的确定：种子罐级数是指制备种子逐级扩 培的次数。 依据：菌种生长特性，孢子发芽及菌体繁殖的速度以 及所用的发酵罐的容积。
出来的生产能力。
感官判断：看颜色、闻气味 理化指标测定： 1、pH值 2、培养基灭菌后的糖、氨基氮 3、菌体形态、浓度 4、产物量 5、残糖浓度 6、酶活力 （如土霉素生产，淀粉酶的活力与发酵单位 有一定的关系）。
六、工业微生物培养的类型
静置培养法：即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不 通 空气进行培养发酵，也称为嫌气性培养。 通气培养法：生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长 的环境必须供给空气，以维持一定的溶解氧水平 ， 使菌体迅速生长和发酵，也称为好气性培养。
一般情况：培养基糖分要少，氮源要多，无 机盐所占的比例要大。种子罐和发酵罐培养基 成分趋于一致也有好处，种子很快适应，但各 成分的数量根据目的各自确定。 总之，各成分选择得当，才能发挥菌种的
特征，提高产量。
2、 培养条件：
温度、pH值、湿度、培养时间和冷藏时间等都影响种子质
量。
温度：影响孢子质量
种子多，种子液中含有大量的胞外水解酶，有利于 对基质的利用。生产菌迅速占据了整个培养环境，减少 染菌机会。但种子过多，易使菌体（菌丝体）生长过快， 培养液粘度增加，溶氧降低，产物合成受影响。
种子扩大培养 认识种子扩大培养
4 种子扩大培养
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
种子的扩大培养
1.实验室种子制备 1）斜面种子培养或扁瓶固体培养基培养
液体试管培养
2）液体培养
三角瓶液体培养
2.生产车间种子制备 1）种子罐级数的确定：不超过四级种子罐 2）接种量的确定：不同微生物发酵的接种 量不同。制霉菌素为0.1~1%,肌苷酸发酵为 1.5~2%,霉菌一般为10%。
接种菌龄：指种子罐内培养的菌体开始移种到下一级种子 罐或发酵罐前的培养时间，选择适当的接种菌龄十分重要， 一般接种菌龄以对数生长中后期为宜。 双种法：以2个种子罐的种子接入1个发酵罐的接种方法。 倒种法：以适宜的发酵液倒出一部分对另一发酵罐作为种 子的接种方法。 混种法：以种子罐和发酵液混合作为发酵罐种子的接种方 法。 种醪：接入种子罐中的种子经培养后所得的含有一定菌体 浓度的种子液。 专性好氧菌： 转性厌氧菌： 兼性好氧菌或兼性厌氧菌：
一、种子制备工艺及生产操作过 程
扁瓶固体培养基 培养
种子
斜面种子培养
液体种子培养
一级种子罐培养
发酵罐培养
二级种子罐培养
种子具备的条件： 1 ）细胞生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延迟期短。 2 ）生理状态稳定。 3 ）菌体总量及浓度能保证大容量发酵罐的要求。 4 ）无杂菌污染，保证纯种发酵。 5 ）保持稳定的生产能力。
种子及发酵：孢子（或菌丝）接入到体积较小的种 子罐中，经培养后形成大量菌丝，这样的种子成 为一级种子。 接种：将无菌状态分离的菌落或斜面孢子，或是试 管、三角瓶、发酵罐内的菌体接入其他的培养容 器内灭过菌的培养基中的操作过程。 接种量：指移种的种子液体积和培养液体积比值。 接种量的大小由发酵罐内菌体的生长繁殖速度决 定。
发酵工程第五章 种子扩大培养
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。 培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
１、实验室种子制备
• 放线菌、霉菌、芽孢杆菌、孢子制备采用 何种培养方法？ 固体培养 • 不产孢子、产孢子弱的细菌菌体制备采用 何种方法？ 液体培养
例子
卡氏罐：制备酵母种子
２、生产车间种子制备
• 实验室制备孢子或摇瓶培养细胞种子经种 子罐扩大培养，满足种子罐需要。 • 种子罐种子培养
• • • • 一级种子→二级发酵 二级种子→三级发酵 三级种子→四级发酵 种子罐的级数主要决定于菌种的性质和菌体生 长速度及发酵设备的合理应用。在满足种子罐 需要前提下，种子级数越低越好。
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列
PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程 安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 二级种子 → 发酵
• 确保无染菌 染菌检测有那些方法？
显微镜检查法 肉汤培养法
平板（双碟）培养法
种子液进行生化分析
三、种子异常的分析
• ⑴菌种生长发育缓慢或过快：菌种老化、 培养基不合适、接种量少、染菌易过慢； 培养基含氮量高，接种量过大，菌体生长 快。 • ⑵菌丝结团：搅拌效果不佳、染菌、接种 量少 • ⑶菌丝粘壁：搅拌效果不佳
种子的扩大培养
种子异常分析
1、菌种生长速度过慢 2、菌丝结团 3、菌丝粘壁
第三节
种子制备过程的技术概要
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁
殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 可以用液体培养法。
搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3
搅拌转速300r／ min
500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级 到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养
(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基 200mI，灭菌后置于冲程7．6cm、频率96次 ／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温 度33~34℃ (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
水质的影响：地区不同、季节变化 和水源污染，均可造成水质波动， 影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不 同代谢类型的菌落，氮源品种越多， 出现的菌落类型也越多，不利于生 产的稳定。
措施
培养基所用原料要经过发酵试验合格才可
2.5第五节 种子的扩大培养
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11%
0.025% 0.015%
薯干粉主要原料
成分
麦芽汁 薯干粉 (NH4)2SO4 琼脂
斜面 麦汁
2%
种子罐 发酵
10% 22-28% 0.5%
（３）种子罐级数确定的依据 种子罐级数取决于： ①种子的性质（生长繁殖性能）； ②孢子瓶中孢子的密度（密度大则级数少）； ③孢子发芽及菌丝繁殖速度； ④发酵罐中种子的最低接种量； ⑤种子罐与发酵罐的容积比；
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
1、斜面 (AS1.299) 培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2 培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
４、种子制备的注意事项 （１）种子培养物选择的原则
➢ 获得一定数量和质量的菌丝体
生产车间阶段： 在生产车间阶段，最终一般都是获得一定数量的菌丝体。
菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
（2）培养基选择的原则
实验室阶段：
为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较精细。
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。
③两步法液体深层培养 在酶制剂和氨基酸生产中应用较多。控制菌 体在不同生长期的条件。
6.种子的扩大培养
生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
第四章 种子的扩大培养
一、影响种子质量的因素及控制
针对以上影响因素，提出如下的解决措施：
（1）培养基所用原料要经过发酵试验合格才 可使用。 （2）严格控制灭菌后培养基的质量。 （3）斜面培养基使用前，需在适当温度下放 置一定时间。 （4）共生产用的孢子培养基要用比较单一的 氮源，作为选种或分离用的培养基则采用 较复杂的有机氮源。
2、培养条件
（3）产物生成量
（4）酶活力：种子液中某种酶的活力，与目的 产物的产量有一定的关联。
第二节 种子培养的条件
一、影响种子质量的因素及控制 生产过程中影响种子质量的因素通常
有：孢子的质量、培养基、培养条件、
种龄、接种量。
一、影响种子质量的因素及控制
1、培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现 象，其主要原因是：原材料质量波动。 此外，地区不同、季节变化和水源污染， 均可造成水质波动，影响种子质量。 菌种在不同固体培养基上可呈现多种不同 代谢类型的菌落，氮源品种越多，出现的 菌落类型也越多，不利于稳定生产。
生产中主要对以下几方面进行稳定检查：
（1）细胞或菌体的外部特征：对于单细胞，要 求菌体健壮、菌形一致、均匀整齐；对于霉 菌、放线菌，要求菌丝粗壮、对某些染料着 色力强、生长旺盛、俊熙分枝情况和内含物 情况好。 （2）生化指标：主要包括种子液的糖、氮、磷 的含量和 pH 变化与正常的基质消耗曲线相近。
3、种子扩大培养的目的
（1）接种量的需要 （2）菌种的驯化
（3）缩短发酵时间、保证生产水平Βιβλιοθήκη 二、发酵生产中对种子的要求
发酵生产过程中的种子必须满足以下条件：
（1）菌种细胞的生长活力强，移种至发酵罐 后能迅速生长，迟缓期短； （2）生理性状稳定； （3）菌体总量及浓度能满足大容量发酵罐的 要求； （4）无杂菌污染； （5）保持稳定的生产能力。
种子扩大培养
选择有利于孢子发芽和菌体生长的培养基； 营养上要易于被菌体直接吸收和利用； 营养成分要适当丰富和完全，氮源和维生素含量要 高
营养成分要尽可能与发酵培养基相近。
6.2.2培养条件
（1）温度 温度对多数品种斜面孢子质量有显著 的影响。 如土霉素生产菌种在高于37˚C培养时， 孢子接入发酵罐后出现糖代谢变慢，氨基 氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等 现象。 一般各生产单位都严格控制孢子斜面的培 养温度。
2，生产啤酒的酵母菌一般保存在麦芽汁琼脂或 MYPG培养基（培养基配制：3克麦芽浸出物，3克 酵母浸出物，5克蛋白胨，10克葡萄糖和20克琼脂 与升水中）的斜面上，于4℃冰箱内保藏。每年移 种3-4次。将保存的酵母菌种接入含10ml麦芽汁的 试管中，再于25℃培养2-3天后，再扩大至含有 250-500ml麦芽汁的500-1000ml三角瓶中，再于 25℃培养2天后，移种至含有5-10L麦芽汁的卡氏培 养罐中，于15-20℃培养3-5天即可作含100L麦芽汁 的发酵罐种子。从三角瓶到卡氏培养罐培养期间， 均需定时摇动或通气，使酵母菌液与空气接触，以 有利与酵母菌的增殖。 麦芽汁试管斜面→麦芽汁试管→麦芽汁三角瓶→麦 芽汁卡氏罐种子罐
舒琴， 林产化学与工业，2004
镜检：24小时多个杆菌首位相连成线形，处于繁殖旺盛期 30小时开始出现芽孢
4，接种量
接种量：是指移入的种子液体 积和接种后培养液体积的比例。 接种量的大小决定于生产菌种 在发酵罐中生长繁殖的速度， 采用较大的接种量可以缩短发 酵罐中菌丝繁殖达到高峰的时 间，使产物的形成提前到来， 并可减少杂菌的生长机会。
种龄 培养条件
培养基
6.2.1培养基
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其 主要原因是原材料质量波动。
第二章 种子扩大培养
好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为 液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体 积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养 基内传递。 这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位 体积的表面积越大，生长速度越快。
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
第三章 种子扩大培养
3
• 4．生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施 • （1）适宜的保存方法：主要原理是利用低温、干燥、
真空；如斜面、砂土、矿物油。 • （2）限制使用期：斜面1-2月移植；砂土1-2年。 • （3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌 • （4）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后
第三章 种子扩大培养
1
• 1、种子扩大培养：将保存在砂土管，冷冻干燥管中处 于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁 瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量的纯种的过程。
这些纯种培养物称为种子。
• 2．种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得 到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供 大规模生产用。
种量0.1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少 的，如制霉菌素，Nystatir只用1%）
②根据种子质量：活力高则接种量少 • 现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-
25%， • 大接种量优点和缺点:
15
• 优点： • a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则
• 种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。 • 3．生产菌种的基本要求 • 一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产
菌，作为生产菌要有一定条件和要求：
2
• （1）高产稳产性能：合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特 性包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。
• （2）要求较粗放：较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多 种的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短， 生产工艺简便——用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一 定抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。
• 4．生产上的防止菌种的变异和衰退，采取以下措施 • （1）适宜的保存方法：主要原理是利用低温、干燥、
真空；如斜面、砂土、矿物油。 • （2）限制使用期：斜面1-2月移植；砂土1-2年。 • （3）减少传代次数，限制菌种的开启次数，为防染菌 • （4）定期分纯：必用单细胞或单孢子的分离，分离后
第三章 种子扩大培养
1
• 1、种子扩大培养：将保存在砂土管，冷冻干燥管中处 于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经扁 瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养而获得一定数量和质 量的纯种的过程。
这些纯种培养物称为种子。
• 2．种子培养任务：保持生产菌种的优良生产性能，得 到比较纯净的种子，菌健壮，还要有足够的量，以供 大规模生产用。
种量0.1-5%，酵母菌10%，霉菌放线菌7-15%（但霉菌也有少 的，如制霉菌素，Nystatir只用1%）
②根据种子质量：活力高则接种量少 • 现相当多的产品采用大接种量，如庆大霉素发酵的接种量达20-
25%， • 大接种量优点和缺点:
15
• 优点： • a.可缩短发酵罐中菌的生长期，则产物合成的时间可提前，则
• 种子培养质量的好坏，关系到发酵产物的产量、质量。 • 3．生产菌种的基本要求 • 一个发酵产物可有多种产生菌，但产生菌不等于生产
菌，作为生产菌要有一定条件和要求：
2
• （1）高产稳产性能：合成能力高，遗传性相对稳定（遗传特 性包括生产性能，生理特性，形态特性）菌种不衰退、难变异。
• （2）要求较粗放：较易培养，生长繁殖较快，可利用比较多 种的原料，此原料要求经济易得。培养快表现在发酵周期短， 生产工艺简便——用一般的生产方法可生产，易提炼，要有一 定抗污染的能力，包括抗杂菌，抗噬菌体。
第二章-种子的扩大培养
(2)培养条件 • 接种量：0.8~1.0％ • 培养温度：32~34℃ • 培养时间：7~8h • 通风量： • 50L种子罐1:0.5 • 搅拌转速340r／min； • 250L种子罐1:0.3 • 搅拌转速300r／ min • 500L种子罐1:0.25 • 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 • 种龄：7~8h • pH：7.2左右 • OD值净增0.5左右 • 无菌检查(-) • 噬菌体检查(-)
种子罐培养：
获得足够的菌种数量； 种子罐的培养基接近发酵罐培养的醪液成分和 培养条件，使菌体适应发酵环境。
种子罐级数的确定
种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次 数
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制，并 减少由于多次转种而带来的染菌机会以及减少因 种子罐生长异常而造成的发酵波动 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的种子 以满足发酵的需求
（5）pH
●
pH影响菌体的生长和代谢
（6）通气搅拌
影响培养基中的溶氧，通气过大或搅拌速度过快容易导致某些酶失 活或菌体细胞破裂。
●
3、接种量和种龄的影响
移入种子的体积 接种量＝ ————————— 接种后培养液的体积
接种量大小最终以实践定。
接种量过多：菌丝生长过快、溶 氧不足，衰老细胞增加等，发酵 后劲不足 种量过少：延长发酵周期，形成 异常形态，而且易造成染菌。 以生产菌种在发酵罐中的繁殖速 度为依据 接种量的大小直接影响发酵周期。
碳源和氮源不太丰富（ 碳源约1%，氮源不超过
0.5%）。碳源丰富易造成生理酸性的营养环境，不 利于放线菌孢子形成；氮源丰富有利于菌丝繁殖不 利于孢子形成。
第五章种子的扩大培养
玉米淀粉双酶糖 4.0， 玉米浆 1.5 ，甘蔗糖 12 / 20 蜜 1.0, 液氨，复合维生素 01 mg/L， 无机 m3 盐等
玉米淀粉双酶糖 13-14， 玉米浆 0.06-0.08 ， 154 / 240 甘蔗糖蜜 1.0, 液氨，维生素 50 g， 无机盐 m3 等
三级种子的特点： ① 种量更大，生长速度快：
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体
采用被孢霉进行Υ亚麻酸发酵时接种量可以明显影响菌丝体 的形态，从而影响菌体干重和Υ亚麻酸产量。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安瓿管 → 斜面孢子 → 大米孢子 → 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
1. 斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天，注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
2. 大米孢子
培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素 为7-15%。但是一般认为大一点好。
双种：两个种子罐接种到一个发酵罐中。
倒种：一部分种子来源于种子罐，一部分来源于发 酵罐。
接种量对菌体形态和产Υ亚麻酸的影响
杨博， 中国油脂，2002
Υ亚麻酸是人体必需多价不饱和脂肪酸，是人体前列 腺素的前体，在预防与治疗心脑血管疾病、糖尿病治 疗、增强免疫力、抗癌和保护皮肤等方面具有重要作 用。发酵法生产Υ亚麻酸成了当今研究的一个热点。
种子的扩大培养
二、青霉素生产的种子制备
制备过程
安培管
→ 斜面孢子 → 大米孢子
→ 二级种子 → 发酵
→ 一级种子
一、斜面孢子
培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等
培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
二、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆）
培养条件：25℃、7天，控制湿度
3，放线菌孢子的制备
放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。培养温度一般为28℃。培养时间为 5~14天。
（二）液体种子制备
1，好氧培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。其过程如下： 试管→三角瓶→摇床→种子罐
1 种子罐的作用
主要是使孢子发芽，生长繁殖成菌（丝） 体，接入发酵罐能迅速生长，达到一定的 菌体量，以利于产物的合成。
种子罐级数
是指制备种子需逐级扩大培养的次数，取 决于： （1）菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖 速度； （2）所采用发酵罐的容积。
种子罐级数的确定
细菌：生长快，种子用量比例少，级数也较少， 二级发酵。 茄子瓶→种子罐→发酵罐 霉菌：生长较慢，如青霉菌，三级发酵 孢子悬浮液→一级种子罐（27℃,40小时孢子发 芽，产生菌丝 ）→二级种子罐（27℃，10~24小 时，菌体迅速繁殖，粗壮菌丝体）→发酵罐 放线菌：生长更慢，采用四级发酵 酵母：比细菌慢，比霉菌，放线菌快，通常用一 级种子
3. 二级种子(种子罐) 培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%