wb原理步骤及总结
WB操作原理以及流程细节
WB操作原理以及流程细节WB操作，也称为网络蜘蛛操作，是指利用网络爬虫技术从Web上抓取数据的过程。
在这个过程中，网络蜘蛛会按照指定的规则和策略自动从互联网上爬取网页，并将抓取到的数据进行提取和处理。
WB操作的基本原理是通过HTTP和HTML协议来实现，主要包括以下几个步骤：1.网络请求：首先，网络蜘蛛需要发送HTTP请求到目标网站的服务器，请求获取相应的网页内容。
2.响应获取：服务器接收到请求后，会返回一个HTTP响应，其中包含了网页的内容和一些其他的信息（如状态码、响应头等）。
4.URL处理：在解析HTML源码的过程中，网络蜘蛛会提取出网页中的URL链接。
它会根据一定的规则和策略，对这些URL进行处理，包括去重、过滤和调度等操作。
5.深度遍历：网络蜘蛛会根据一定的遍历策略，继续将这些URL作为新的请求去访问，以实现对网站的深度遍历。
整个WB操作的流程可以表示为以下几个步骤：1.初始化操作：网络蜘蛛会首先进行初始化工作，包括配置相关参数、设置种子URL、建立数据库连接等。
2.URL管理：网络蜘蛛会维护一个URL队列，用于存放待访问的URL。
它会根据一定的调度策略从队列中取出URL，并加入到已访问的URL集合中。
3.网络请求和响应获取：网络蜘蛛会发送HTTP请求到目标网站，然后等待服务器返回HTTP响应。
它会根据响应的状态码和内容进行判断和处理。
4.内容解析和数据处理：网络蜘蛛会解析HTTP响应，提取出网页的HTML源码，并根据规则和策略从中提取出感兴趣的数据。
然后它会对这些数据进行处理，包括清洗、格式化和存储等操作。
5.URL处理和遍历：网络蜘蛛会从解析出的HTML源码中提取出新的URL链接，并根据一定的规则对这些URL进行处理。
它会根据一定的遍历策略，将这些URL加入到URL队列中，以便后续的访问和处理。
6.循环迭代：网络蜘蛛会不断地循环执行上述的操作，直到URL队列为空或达到设定的条件，如爬取的网页数量达到一定阈值等。
wb实验凝胶电泳的原理
wb实验凝胶电泳的原理
wb实验（Western blot）是一种分子生物学技术，可用于检测蛋白质的存在、定量、大小和性质。
其原理基于凝胶电泳技术，通过将蛋白质样品经过蛋白质电泳分离后，将其转移到固定膜上进行检测。
具体实验步骤如下：
1. 准备蛋白质样品：通常将细胞或组织进行破碎，取其中的蛋白质作为样品。
2. 准备凝胶：将聚丙烯酰胺等材料制成凝胶，制成蛋白质电泳胶。
3. 加载样品：将样品加入凝胶孔中，可以使用样品加载缓冲液来保持稳定。
4. 电泳：将凝胶放入电泳槽中，将电泳缓冲液注入电泳槽内，接通电源，施加电场，蛋白加载入凝胶中，经过分离。
5. 转移：将分离好的蛋白质移至电泳膜上。
常用的转移方法有湿式转移和干式转移两种。
6. 探针反应：使用合适的探针来反应目标蛋白质，通常是特异性抗体。
此时蛋白质与抗体发生反应，生成免疫复合物，可以使用色素等手段进行检测。
总的来说，wb实验的原理就是通过电泳分离蛋白样品，再用探针来检测、定位目标蛋白质。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和分离蛋白质的实验方法，广泛应用于生物医学和生物化学领域。
它通过将复杂的蛋白质混合物按照分子大小分离，并使用特异性抗体来探测目标蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理及操作流程。
一、基本原理WB实验主要基于蛋白质的电泳分离和免疫染色原理。
具体步骤如下：1.样品制备：首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质，并经过适当的处理，如裂解细胞、破碎细胞膜等，以获取纯净的蛋白质样品。
2. SDS-电泳：将样品加入聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel），随后进行电泳。
这一步骤会根据蛋白质的分子大小进行分离。
3.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚乙烯2.2-羟基苯基酮（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以更容易进行免疫染色。
4.封闭：将转膜后的膜进行封闭，通常使用牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉等阻断非特异性结合位点。
5.抗体反应：加入目标蛋白质特异性的抗体，使其与特定抗原位点结合。
6.洗涤：将膜洗涤以去除非特异性的抗体。
7.免疫染色：加入酶标记的辅助抗体，它与目标抗体结合，并携带可检测信号物质（如酶或荧光染料）。
8.显色：加入合适的底物，使酶标记的辅助抗体产生可视化的颜色或荧光信号。
9.分析：通过成像设备（如X射线胶片或荧光成像系统）观察和记录目标蛋白质的表达。
二、操作流程下面是一份WB实验的基本操作流程，具体步骤可能因实验目的和实验条件而有所变化。
1.样品制备：a.收集细胞或组织样品，并使用适当的缓冲液裂解细胞膜。
b.添加蛋白质提取试剂，并彻底裂解细胞。
c.离心裂解后的细胞，收集上清液，其中含有目标蛋白质。
2.SDS-电泳：a.准备好聚丙烯酰胺凝胶，通常使用8%至12%的分辨胶。
b.加载待测样品和分子量标记蛋白质到凝胶中。
c.进行电泳，常用条件为100V持续电解，直到样品顶到凝胶底部。
3.转膜：a.准备合适大小的PVDF或硝酸纤维素膜，并剪成和凝胶一样大小。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
WB实验基本原理
WB实验基本原理1. 概述WB实验（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析技术，通常用于检测特定蛋白质在样本中的存在与表达水平。
WB实验具有高度的灵敏度和特异性，可以在复杂的混合物中检测目标蛋白质，并测定其相对含量。
本文将介绍WB实验的基本原理和实验步骤。
2. 实验步骤WB实验主要包括以下几个步骤：样本制备首先，需要从细胞或组织中提取蛋白质样本。
常用的方法是使用细胞裂解缓冲液将细胞或组织完全裂解，并使蛋白质溶于缓冲液中。
裂解过程中最好加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂以避免蛋白质降解。
完成裂解后，离心样品并收集上清液，该液体中含有被裂解的细胞或组织的蛋白质。
SDS-PAGE电泳接下来，将蛋白质样品经过SDS-PAGE电泳进行分离。
SDS-PAGE是一种聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术，通过加入电场使蛋白质在凝胶中沿着电场方向迁移。
在SDS-PAGE过程中，蛋白质样品中的蛋白质会被SDS和还原剂处理，使其在凝胶中以其分子量为依据进行分离。
转膜在蛋白质样品分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上以进行进一步检测。
通常使用聚氟乙烯（PVDF）或亲水性的聚酰胺（nitrocellulose）膜进行转膜。
转膜过程中，蛋白质会通过电泳方法从凝胶中迁移到膜上形成相应的蛋白质“印迹”。
阻断与孵育转膜完成后，需要对膜进行阻断处理，以避免非特异性结合。
常用的阻断方法是在膜上加入含有非特异性蛋白质（如牛血清蛋白）的缓冲液，使其与膜上的非特异性结合位点结合，从而阻断不相关的反应。
接下来，将目标蛋白质的特异性抗体加入孵育缓冲液中，并将膜浸入其中进行孵育。
抗体与膜上的目标蛋白质结合，形成抗原-抗体复合物。
探针标记为了检测膜上的特定蛋白质，探针标记是必需的。
可以使用酶标记的二抗或荧光标记的二抗作为探针，与抗体进行特异性结合。
常见的酶标记物有辣根过氧化物酶（HRP），而常见的荧光标记物有荧光素等。
信号检测与图像分析在探针标记完成后，使用相应的底物进行信号的检测。
WB实验原理
WB实验原理WB实验（Western Blot）是一种常用的生物化学实验技术，用于检测和识别蛋白质。
本文将介绍WB实验的基本原理和步骤，以及其在科研和临床应用中的重要性。
一、WB实验的原理WB实验是通过将复杂的混合物中的蛋白质分离、电泳、转移和检测，来研究特定蛋白质的存在与表达水平。
其原理主要包括以下几个步骤：1. 蛋白质提取与电泳分离：首先，需要从细胞或组织中提取目标蛋白质。
常用的方法包括细胞裂解、超声破碎等。
然后，将提取得到的蛋白质样品进行电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2. 转移：将分离后的蛋白质通过电泳转移到聚乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜上，这样可以使蛋白质固定在膜上，方便后续的检测。
3. 阻断与抗体探针：在转移的蛋白质膜上进行阻断处理，防止非特异性结合和减少背景信号。
然后，通过与目标蛋白质有特异性结合的一抗探针进行孵育，使其与目标蛋白质特异性结合。
4. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，二抗具有与一抗结合的能力。
通常，二抗会标记着某种信号发生物，如辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP），这些信号发生物能够发出具体的发光信号。
5. 显示与分析：通过染色剂与特定的底物反应，使目标蛋白质发出可见的光信号，然后使用成像系统记录光信号。
最后，使用分析软件定量分析蛋白质带的强度。
二、WB实验的步骤根据上述的原理，WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解：将待检测的细胞或组织进行细胞裂解，使用细胞裂解液溶解细胞膜，并释放目标蛋白质。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白质样品注入电泳胶槽中，通过应用电场，根据蛋白质的大小和电荷分离蛋白质。
3. 蛋白质转移：将分离的蛋白质转移到膜上，通常使用温和的电压和适当的时间进行转移。
4. 阻断与孵育：在转移的膜上进行阻断处理，再用一抗孵育膜，使其与目标蛋白质结合。
5. 二抗与信号发生物：加入与一抗来源物种不同的二抗，再加入信号发生物，使目标蛋白质产生光信号。
WB原理步骤及总结(杂项)
蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
与大多数蛋白质的结合比为，由于带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液分离胶水、丙烯酰胺混合液、（）、、过硫酸铵、浓缩胶水、丙烯酰胺混合液、、过硫酸铵、×–甘氨酸电泳缓冲液碱、甘氨酸、，用去离子水定容至×凝胶加样缓冲液（），β巯基乙醇，甘油，溴酚蓝，转移缓冲液，甘氨酸，甲醇，加去离子水至，，加去离子水至（），，µβ巯基乙醇，用水定容到实验步骤—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约处，停止灌胶。
wb抗体原理
wb抗体原理
WB（Western Blot）是一种常用的免疫学技术，用于检测蛋白质在复杂混合样品中的表达情况。
WB抗体原理如下：
1. 样品制备：首先，需要将待检测的蛋白质样品经过蛋白质提取和电泳分离的步骤，将蛋白质沿着凝胶中的凝胶孔移动，分离成不同的带状条带。
2. 转移：接下来，将凝胶上的蛋白质条带转移到聚丙烯酰胺薄膜或硝酸纤维素膜上，形成蛋白质的镜像。
3. 阻断：为了防止非特异性结合，将蛋白质镜像放入含有蛋白质（如牛血清白蛋白）的溶液中进行阻断，使膜上所有未特异性结合位点被占据。
4. 抗原结合：将膜和特异性抗体一起孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
抗体可以识别目标蛋白质的特异性位点。
5. 洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除未结合的抗体。
6. 抗原检测：将与目标蛋白质结合的抗体检测出来。
这通常通过二次抗体进行，该二次抗体与用于包被蛋白质的一抗体结合。
二抗常用的是与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光标记的抗体，可以产生可见的信号。
7. 显色：通过加入特定的底物，使酶催化产生显色或发光信号。
这些信号可以通过X射线或荧光成像系统进行检测和分析。
通过以上步骤，可以确定样本中是否存在目标蛋白质，并评估其表达水平。
WB抗体原理基于抗原-抗体的特异性结合，并通过酶催化等方式展现出来。
wb浓缩胶原理
wb浓缩胶原理
WB浓缩胶原理是指通过过滤和浓缩的方法，将胶原蛋白溶液
中的水分和杂质去除，使得胶原蛋白浓度增加，从而得到高浓度的胶原蛋白溶液。
具体步骤如下：
1.首先将胶原蛋白溶液通过滤纸或膜过滤器进行初步过滤，去
除较大的杂质和颗粒；
2.将初步过滤后的溶液收集到容器中，并通过离心机进行离心，使得溶液中的固体颗粒和水分分离；
3.将离心后的上清液倒出，留下沉淀的胶原蛋白物质；
4.将胶原蛋白物质溶解在适量的溶液中，并通过旋转蒸发器或
真空浓缩器进行蒸发，使得溶液中的水分逐渐蒸发；
5.不断加热和搅拌溶液，使得胶原蛋白逐渐凝聚和浓缩；
6.经过一段时间的浓缩和凝聚，得到浓缩胶原溶液。
通过WB浓缩胶原原理，可以得到高浓度的胶原蛋白溶液，
用于制备胶原蛋白产品或进行相关实验研究。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验，即Western Blot实验，是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来，然后用特定的抗体结合目标蛋白，最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中，主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先，将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中，进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后，将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上，通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后，将膜进行封闭处理，以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合，然后进行洗脱，接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱，以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一，它通过特定底物的化学反应产生发光信号，用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分，包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程，保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制，避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性，避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中，要注意洗脱的次数和时间，严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后，要及时清洗和维护仪器设备，妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍，相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时，一定要认真细致，严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助，谢谢阅读！。
WB的原理、操作及注意事项
WB的原理、操作及注意事项WB的原理、操作及注意事项原理：通过电泳区分不同的组分，并转移⾄固相⽀持物，通过特异性试剂（抗体）作为探针，对靶物质进⾏检测，蛋⽩质的Western 印迹技术结合了凝胶电泳的⾼分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点，可检测到低⾄1?5ng （最低可到10- 100pg）中等⼤⼩的靶蛋⽩。
⼀、抗原的选择和制备A：样品的制备1 组织：组织的处理⽅法：组织洗涤后加⼊3倍体积预冷的PBS0C研磨，加⼊5X STOFbuffer , 180W6mins , 0C 超声波破碎，5000rpm,5mins 离⼼，取上清。
加⼊B -ME（9.5ml 加⼊0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，⽤时取出，直接溶解上样。
2 细胞：细胞的处理⽅法：离⼼收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加⼊ 5 x STOPbuffer，收集，180W6mins , 0C超声波破碎，5000rpm,5mins 离⼼，取上清。
加⼊B -ME（9.5ml 加⼊0.5ml）, 溴酚蓝（9.5ml加⼊0.5ml ）煮沸10min，分装后于-20 C保存，⽤时取出，直接溶解上样。
3 分泌蛋⽩的提取（特例）：直接收集分泌液，加⼊B -ME、溴酚蓝制样。
B:蛋⽩的定量⽅法及影响蛋⽩定量原因1. 双缩脲法：双缩脲法是第⼀个⽤⽐⾊法测定蛋⽩质浓度的⽅法。
在需要快速，但不很准确的测定中，常⽤此法。
硫铵不⼲扰显⾊，这对蛋⽩质提纯的早期阶段是⾮常有利的。
双缩脲法的原理是Cu2+与蛋⽩质的肽键，以及酪氨酸残基络合，形成紫蓝⾊络合物，此物在540nm波长处有最⼤吸收。
双缩脲法常⽤于0.5g/L ?10g/L 含量的蛋⽩质溶液测定。
⼲扰物有硫醇，以及具有肽性质缓冲液，如Tris、Good缓冲液等。
可⽤沉淀法除去⼲扰物，即⽤等体积10%^的三氯醋酸沉淀蛋⽩质，然后弃去上清液，再⽤已知体积的1mNaOH溶解沉淀的蛋⽩质进⾏定量测定。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的生物学实验方法，用于检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理基于免疫学技术，主要包括以下几个步骤：1. 细胞裂解，首先需要将待检测的细胞或组织样品进行裂解，使得蛋白质释放出来。
2. 蛋白质分离，裂解后的蛋白质需要通过电泳或其他方法进行分离，以便后续的检测。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常采用电泳转印的方法。
4. 抗体结合，将特异性的一抗与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
WB实验的具体步骤如下：1. 细胞裂解，将含有蛋白质的细胞或组织样品加入裂解液中，使用超声或搅拌等方法进行充分裂解。
2. 蛋白质分离，将裂解后的蛋白质样品加入聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
3. 蛋白转移，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，通常使用半干法或湿法转印。
4. 抗体结合，将膜中的蛋白质与特异性的一抗结合，通常需要进行过夜孵育，以保证抗体与蛋白质的充分结合。
5. 信号检测，通过添加化学发光底物或染色底物，检测抗体与蛋白质复合物的信号，得到目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
在进行WB实验时，需要注意以下几点：1. 样品处理，样品的裂解和处理过程需要在低温和无酶的条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 抗体选择，选择特异性良好的一抗和二抗，以确保实验结果的准确性。
3. 数据分析，对实验结果进行准确的数据分析，包括目标蛋白的相对表达水平和统计学分析。
四、实验应用。
WB实验广泛应用于生物医学研究领域，可以用于检测蛋白质的表达水平、翻译后修饰和相互作用等。
在癌症、免疫学、神经科学等领域具有重要的应用价值。
总之，WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，掌握其原理和步骤对于开展生物学研究具有重要意义。
WB试验每步原理和技术及试剂的分析
WB试验每步原理和技术及试剂的分析WB（Western Blotting）试验是一种常用的蛋白质分析技术，通过将复杂的混合蛋白质样品进行分离、转移、固定和检测，从而鉴定所感兴趣的蛋白质。
以下是WB试验的每步原理、技术及试剂的分析：1.蛋白质提取：首先需要从细胞或组织中提取蛋白质。
该步骤的目的是破坏细胞膜并释放细胞质中的蛋白质。
蛋白质提取的方法通常包括细胞裂解和蛋白质的沉淀。
-细胞裂解：细胞膜的破裂可以通过机械方法（如超声波破碎仪）或化学方法（如离心及化学裂解剂）来实现。
-蛋白质沉淀：提取的细胞裂解液通常含有其他细胞组分，如核酸、多肽和小分子化合物。
这些杂质会影响后续的蛋白质电泳分离。
因此，本步骤通常会进行蛋白质的沉淀以去除杂质。
常用的沉淀试剂包括三氯醋酸（TCA）和四氯化钛（TCA）。
2.SDS-电泳分离：经过蛋白质提取和沉淀后，将蛋白质样品进行电泳分离。
这是通过SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳）技术实现的。
该技术利用带负电的SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行界面活性剂处理，使所有蛋白质呈现负电荷，并在线性凝胶中按照分子质量大小进行分离。
-凝胶制备：通常使用7.5%或12%的聚丙烯酰胺凝胶来分离蛋白质。
聚合物原液将与TEMED（N，N，N´，N´-四甲基乙二胺）和铵过硫酸铵（APS）等催化剂混合。
-电泳条件：电泳过程中，将样品加载到凝胶孔上，并在恒定电流下进行电泳。
较大分子量的蛋白质会迁移得更慢，较小分子量的蛋白质则会迁移得更快。
3.蛋白质转移：蛋白质分子在凝胶中的分离只是半成品，需要将蛋白质转移到膜上以进行后续的蛋白质检测。
这是通过蛋白质半湿式或湿式转印技术实现的。
-半湿式转印：在半湿式转印中，凝胶和膜将分别与蛋白质转印缓冲液一起放置在蛋白质转印池中。
经过一段时间的转印，蛋白质将从凝胶逐渐转移到膜上。
-湿式转印：湿式转印利用蛋白质转印缓冲液进行蛋白质转印，凝胶和膜与蛋白质转印缓冲液完全接触，并在恒定的电流下进行转印。
WB原理、步骤及总结
实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/L Tris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1 mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL 实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
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wb实验WB实验导言：WB实验（Western Blotting）是一种广泛应用于生物医学研究中的实验技术，它通过将蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳分离，再将被分离的蛋白质转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上，最后使用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
本文将详细介绍WB实验的基本原理、步骤和应用。
一、基本原理1.1 蛋白质电泳分离在WB实验中，首先将待测蛋白质与断裂蛋白质加入SDS-PAGE （聚丙烯酰胺凝胶电泳）胶液中，然后通过电泳，根据蛋白质的分子量以及电荷特性，将蛋白质从胶液中分离出来。
当电流作用于聚丙烯酰胺凝胶时，蛋白质会根据其电荷和分子量的不同，在电场中迁移。
1.2 蛋白质转移接下来，将蛋白质从SDS-PAGE胶液中转移到固定在聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
这一步骤通常使用电泳转移装置，通过电流将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
此过程可以进一步将蛋白质进行定量或定性分析。
1.3 特定抗体检测转移完成后，利用特定抗体对目标蛋白质进行检测。
特异性抗体与目标蛋白质结合后，通过化学或光学方法可可视化目标蛋白质。
常见的可视化方法包括荧光染色、酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射性探针等。
二、实验步骤2.1 样品制备样品的制备是WB实验的关键步骤之一。
需要将待测蛋白质从细胞或组织中提取出来，并进行蛋白质浓度的测定。
可以使用细胞裂解液来破坏细胞膜，释放蛋白质。
同时，可以使用加热和还原剂来使蛋白质在电泳过程中分离。
2.2 SDS-PAGE电泳分离将样品和标准蛋白质分别加载到预制的凝胶槽中。
开启电源，设定适当的电流和运行时间，进行电泳分离。
分离完成后，将凝胶放入转移装置中。
2.3 蛋白质转移将凝胶转移到聚乙烯膜或硝酸纤维素膜上。
同时提供足够的电流，并根据蛋白质大小和热力学性质设置适当的时间，以确保蛋白质可以完全转移到膜上。
2.4 特定抗体检测将蛋白质膜进行一定的前处理步骤，如预浸泡、阻断和洗涤。
然后，加入特定的一抗，与目标蛋白质结合。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用来检测目标蛋白在细胞或组织中的表达水平，是生物学研究中常用的实验技术之一。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理主要基于蛋白质的电泳分离和免疫印迹技术。
首先，将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，接着用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过化学发光或显色反应来检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
1. 样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，加热变性，然后进行电泳分离。
2. 凝胶电泳，将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，连接电源进行电泳分离，直至蛋白样品分离完全。
3. 转膜，将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以选择湿式转膜或半干式转膜的方法，转膜时间和电流密度需要根据蛋白的大小和数量进行调整。
4. 封闭，将转膜后的膜放入封闭液中，封闭蛋白质膜上的非特异性结合位点，减少后续免疫印迹过程中的非特异性结合。
5. 抗体结合，将封闭后的膜与特异性一抗抗体孵育，使抗体与目标蛋白结合。
6. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的抗体。
7. 二抗结合，将膜与辣根过氧化酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
8. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的二抗。
9. 显色或发光，根据实验需要选择化学发光或显色反应，观察目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
1. 样品制备时需加入还原剂和变性剂，使蛋白完全变性并且带有负电荷，便于电泳分离。
2. 蛋白转膜时，需保持膜的完整性，避免出现气泡和损坏，影响后续的免疫印迹效果。
3. 免疫印迹过程中的抗体孵育和洗膜步骤需要严格控制时间和条件，以保证特异性结合和减少非特异性结合。
4. 显色或发光反应的时间和条件也需要根据实验情况进行优化，以获得清晰的实验结果。
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）
实验时间WB详解（原理、试剂、步骤及问题解答）Western Blot 实验原理WB 是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
Western Blot 分类根据显色方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光 ECLiii.底物荧光 ECFiv.底物 DAB 呈色现在常用的有底物化学发光 ECL 和底物 DAB 呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用 HRP 标记）：反应底物为过氧化物 + 鲁米诺，如遇到 HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
实验常见的问题指南01参考书推荐A. 对初学者看什么资料比较好？解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual， wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
02针对样品的常见问题此处内容较多，有部分答案省略，想查看更多详情，请点击【阅读原文】查看。
B. 做线粒体膜 UCP2 蛋白的 Western Blot（以下简写成 Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120 μg，换了个santa cloz 的一抗仍不行。
是什么原因？蛋白酶抑制剂单加 PMSF 行吗？解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。
同时，建议检查Western Blot 过程，提高一抗浓度。
对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF 就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
C. 细胞水平要做Western Blot，多少细胞提的蛋白够Western Blot？解答：一般地 5* 106 就足够了。
WB实验的基本原理及操作流程
WB实验的基本原理及操作流程WB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG 检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
WB原理、步骤及总结.doc
WB原理、步骤及总结实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S 检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水3.3mL、30%丙烯酰胺混合液4.0mL、1.0mol/LTris（pH8.8）2.5mL、10%SDS0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED0.004mL5%浓缩胶水2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris–甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8）100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS转移缓冲液Tris2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris1.21gNaCl8.77g，Tween-201mL，加去离子水至1LStripping1.3mLTris（pH6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm处，停止灌胶。
WB操作原理以及流程细节
WB实验的基本原理及操作流程【实验原理】一个基因表达终极结果是产生相应的蛋白质(或酶)。
因此检测蛋白质是测定基因表达的主要标志，检测蛋白质的方法很多，除ELISA法外，也可用与检测DNA和RNA相类似的吸印方法。
前两法有“南”和“北”之意，故本法遂被延伸称为Western(西)印迹法，该法能用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出与专一抗血清结合的专一性蛋白质。
将聚丙烯酰胺凝胶上分辨出的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上并与第一抗体共孵。
第一抗体专一地与待分离蛋自质的抗原决定簇结合，然后用另一种蛋自质，如135I-蛋白A或辣根过氧化物酶连接的山羊抗IgG检测已结合上去的抗体。
本法所需时间6小时或过夜。
蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳几乎所有蛋白质电泳分析都在聚丙烯酰胺凝胶上进行，而所用条件总要确保蛋白质解离成单个多肽亚基并尽可能减少其相互间的聚集。
最常用的方法是将强阴离子去污剂SDS与某一还原剂并用，并通过加热使蛋白质解离后再加样于电泳凝胶上。
变性的多肽与SDS结合并因此而带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在聚丙烯酰凝胶电泳中的迁移只与多肽的大小相关。
在达到饱和的状态下，每克多肽约可结合1.4克去污剂，借助已知分子量的标准参照物，则可测算出多肽链的分子量。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续缓冲系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH值与离子强度不同于配胶缓冲液，当两电极间接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中所含的SDS多肽复合物向前推进。
样品通过高度多孔性的积层胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带(或称积层)。
曲于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，故大大提高了SDS聚丙烯酰胺凝胶的分辨率。
最广泛使用的不连续缓冲系统最早是由Ornsstein(1964)和Davis(1964)设计的，样品和积层胶中含Tris-Cl(pH6.8)，上下槽缓冲液含Tris-甘氨酸(pH8.3)，分离胶中含Tris-Cl(pH8.8)的。
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实验原理蛋白质印迹是把电泳分离的蛋白质转移到固定基质上，然后利用抗原抗体反应来检测特异性的蛋白分子的技术，包括三个部分：SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳，蛋白质的电泳转移，免疫印迹分析。
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质相对分子质量，SDS是阴离子去污剂，能断裂蛋白质分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏其高级结构。
SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4:1，由于SDS带有大量的负电荷，与蛋白质结合时掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别，使各种蛋白质带有相同密度的负电荷，形似长椭圆棒，蛋白迁移率与蛋白质相对分子质量的对数呈线性关系。
因此，利用相对分子质量标准蛋白所作的标准曲线，可以求得未知蛋白的相对分子质量。
电泳后蛋白质分子嵌在凝胶介质中，探针分子很难通过凝胶孔，将蛋白质从凝胶转移到固定基质上可以对蛋白质进行免疫检测分析。
方法有两种：①水平半干式转移即将凝胶和固定基质似三明治样夹在缓冲液浸湿的滤纸中间，通电10~30min可完成②垂直湿式转移即将凝胶和固定基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电2~4h或过夜可完成。
固定基质通常有硝酸纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜和尼龙膜。
蛋白质转移到固定化膜上之后，通过蛋白质染料如丽春红S检测膜上的总蛋白，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白剩余量，以验证转移是否成功。
用抗体作为探针进行特异性的免疫反应检测抗原蛋白，分为4步：①用非特异性、非反应活性分子封阻固定化膜上未吸附蛋白的自由结合区，以防止作为探针的抗体结合到膜上，出现检测时的高背景②固定化膜用专一性的一抗温育，使一抗与膜上的抗原蛋白分子特异性结合③酶标二抗与一抗特异结合④加入酶底物，适当保温，膜上便可见到颜色反应，检测出抗原蛋白区带。
主要溶液10%分离胶水 3.3mL、30% 丙烯酰胺混合液 4.0mL、1.0mol/L Tris（pH8.8）2.5mL、10% SDS 0.1mL、10%过硫酸铵0.1mL、TEMED 0.004mL5%浓缩胶水 2.7mL、30%丙烯酰胺混合液0.67mL、1.0mol/LTris0.5mL、10%SDS0.04Ml/10%过硫酸铵0.04mL、TEMED0.004mL1×Tris –甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03g、甘氨酸18.77g、SDS 1g，用去离子水定容至1L2×SDS凝胶加样缓冲液Tris-HCl（pH6.8） 100mmol/L，β-巯基乙醇10%，10%甘油，0.01%溴酚蓝，10%SDS 转移缓冲液Tris 2.45g，甘氨酸11.25g，甲醇100mL，加去离子水至1LTBSTTris 1.21g NaCl 8.77g，Tween-20 1mL，加去离子水至1LStripping1.3mL Tris （pH 6.8），4mL10%SDS，140µlβ-巯基乙醇，用水定容到20mL实验步骤1 SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳⑴凝胶配置①分离胶的配置：将配置好的分离胶液混匀后迅速倒入胶槽中，至距离短玻璃板顶端约2cm 处，停止灌胶。
检查是否有气泡，若有用滤纸条吸出。
然后在胶液界面上加蒸馏水进行水封。
15~30min后，凝胶和水封层界面清晰，说明胶已经聚合完全，然后用滤纸吸取水封层，滤纸切勿接触到凝胶面。
（使蛋白样品分离）②浓缩胶的配置：将配置好的浓缩胶灌注在分离胶之上，直至短玻璃板的顶端，然后插入样品槽梳子。
室温下浓缩胶聚合，约20~30min。
（使蛋白样品浓缩）⑵蛋白样品的处理将蛋白样品溶于样品溶解液，终浓度为0.5~1mg/ml。
然后转移到小离心管中，轻轻盖上盖子（不能塞紧，以免加热时液体迸出），在100℃沸水浴中加热3min，取出冷却后备用，使用前需要将样品离心除去颗粒物质。
暂时用不到的话，可放在﹣20℃冰箱长期保存，使用时沸水浴中加热3min，以除去亚稳聚合态物质。
上样前的样品一定要均匀以防电泳时出现纵向条带。
⑶加样拔去样品槽梳子，倒入电极缓冲液，没过短板约0.5cm以上，若样品槽中有气泡，用枪头挑除。
按顺序向凝胶样品槽中加入标准蛋白和未知蛋白样品，每孔的加样量要相同，一般加样体积为10~30µl，加样时枪头深入到加样槽内，尽量接近底部，记录加样顺序。
⑷电泳上槽接负极，下槽接正极，打开直流稳压电源，先80V过了浓缩胶后改为120V，待溴酚蓝指示剂迁移到凝胶下沿1cm时停止电泳。
2 蛋白质的电转移⑴水平半干式电转移①戴乳胶手套剪滤纸6张，滤纸长与宽比SDS—PAGE胶各大1cm。
②裁剪与SDS—PAGE胶长宽相等的NC膜。
③将3张滤纸和SDS—PAGE胶浸在负极转移液中待用。
④将另3张滤纸和NC转移膜浸在正极转移液中待用。
⑤将浸在负极转移液中的滤纸取出，尽量少带液体，置于转移槽负极上，然后在负极滤纸上依次铺放SDS—PAGE胶、NC膜、3张用正极转移液饱和的滤纸。
注意排除气泡，因为气泡会产生高阻抗点，形成低效印迹区，即所谓“秃斑”。
⑥盖上石墨阳极板，设定50mA恒流，转移一定时间。
⑵垂直湿式转移①凝胶片的平衡：把电泳后的凝胶从玻璃板上转移至成有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡30~60min,以除去胶中的SDS，使其pH及离子强度和印迹缓冲液相一致，防止凝胶发生膨胀或皱缩。
②将转移缓冲液冷却至4℃③准备NC膜和滤纸：戴乳胶手套裁剪与凝胶大小相同的NC膜和4张滤纸，用转移缓冲液浸润膜和滤纸15min，直到没有气泡，④将海绵在转移缓冲液中充分浸湿⑤打开蛋白质转移槽的转移夹，依次放入：浸湿的海绵，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，用转移缓冲液浸过的胶，NC膜，两张用转移缓冲液饱和的滤纸，浸湿的海绵，然后合上转移夹。
⑥转移槽中倒入转移缓冲液，然后将转移夹置于槽中，凝胶靠近负极NC膜靠近正极将转移槽放到4℃冰箱内，电转移，恒流80mA，4 h。
3 免疫印迹分析⑴NC膜上总蛋白的染色和脱色：将电泳转移完后的NC膜取出，置于培养皿中。
丽春红S染色3min后，用铅笔轻轻标出标准蛋白带的位置以备计算特异性蛋白质相对分子质量所需。
然后，用丽春红S脱色液轻轻漂洗数次至红色消失。
⑵特异性抗体检测①脱色后的NC膜置于培养皿中，加入封闭液，并在水平摇床上不断振摇，室温下封闭2h 以上。
（将膜上未结合目的蛋白的区域封闭以防止一抗的结合）②倒出封闭液，加入漂洗液，水平摇床上不断振摇，洗膜3次，每次5min。
（除去封闭液）③漂洗完后，将膜转移至杂交袋中，加入特异性一抗，4℃摇床过夜或室温放摇3h（一抗与目的抗原蛋白特异性结合）④利用水平摇床，用TBST洗膜3次，每次5min。
（洗去未结合的一抗）⑤将膜转移到稀释的酶标二抗中，在室温下孵育30min⑥倾去二抗，用TBST洗膜，室温摇洗三次，每次5min，蛋白面朝上，置于保鲜膜中，将ECL的A液和B液以1:1体积混合，于暗室中，按0.05-0.1ml/㎝2的量滴加于膜表面，孵育1min，滤纸吸去多余液体用保鲜膜包好，立即于暗室内曝光数秒。
在暗室中，将 1×显影液和定影液分别到入塑料盘中。
在红灯下取出 X－光片，剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大 1cm）。
打开 X-光片夹，把 X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时。
根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为 1min 或5min，曝光完成后，打开X-光片夹，取出 X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为 1～2min（20～25℃），温度过低时（低于 16℃）需适当延长显影时间。
显影结束后，马上把 X-光片浸入定影液中，定影时间一般为 5～10min，以胶片透明为止。
用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
注意事项①在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
②不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子质量的蛋白③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键、二硫键。
对于多亚基蛋白或含多条肽链的蛋白，SDS—PAGE只能测定它们的亚基或单条肽链的相对分子质量。
④尽量除去核酸、多糖、脂类等干扰分子。
⑤蛋白质样品在处理过程中应低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶对其进行修饰⑥尽量使用新鲜的loading buffer，样品要与loading buffer混合均匀，⑦不可将蛋白质反复冻融使用以防改变蛋白质的抗原特性，⑧Buffer一定要漫过梳子孔，否则可能会发现蛋白跑不动。
⑨电泳时先用低电压跑过浓缩胶，再换高电压跑分离胶，特别是对于高分子量的目的蛋白，⑩硝酸纤维素（NC)膜：NC与蛋白质靠疏水作用结合，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小。
非特异性本底显色浅。
价格低廉，使用方便。
但结合在NC上的小分子蛋白质在洗涤时易丢失。
NC韧性较差，易损坏。
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜：与蛋白质亲和力高，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上的正电基团，使其更容易与带负电荷蛋白结合。
但价格上稍贵。
为了便于观察电泳效果和转膜效果，以及判断蛋白分子量大小要先将膜晾干，然后浸入20%的甲醇，待完全浸湿后取出透光观察即可看到蛋白条带（适用于PVDF膜）。
传统方法是将膜用1×丽春红染液染5min（于脱色摇床上摇），然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
从转膜完毕后所有的步骤，一定要注意膜的保湿，避免膜的干燥，否则极易产生较高的背景。
高背景可能的原因：膜未均匀浸泡。
膜或缓冲液污染。
封闭不充分。
抗体与封闭液出现交叉反应。
抗体浓度过高。
解决方法有：转膜前用100%甲醇将膜完全浸泡。
杂交前检测一抗、二抗。
检测一抗、二抗与封闭液是否有交叉反应。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准，通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜的效果也可以用丽春红染色液对膜进行染色，以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色，以观察蛋白的残留情况。
作用定性分析蛋白质，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量，分析目的蛋白表达的特异性。
蛋白样品的制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。