实验讲义

酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。

一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。

酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。

酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸入细胞内，在无氧的条件下，经过体内酶的作用，把单糖分解为二氧化碳和酒精。

此作用即酒精发酵。

C6H i2O6（葡萄糖）T 2 C2H5OH（酒精）+2 CO2 f 在酿酒酵母酒精发酵的生产和应用中，由于细胞破碎和酶纯化等操作往往导致酶活性和稳定性都受影响，从而降低产酒精效率。

而利用细胞固定化可以很好的解决这一问题。

微生物细胞固定化方法主要有三种：载体结合法，交联法和包埋法，其中固定包埋法是目前比较理想的方法。

包埋法就是将微生物细胞均匀地包埋在多孔的水不溶性的紧密结构中，细胞中的酶处于活化状态，因而活性高，活力耐久。

目前，利用聚乙烯醇（PVA）—海藻酸盐是包埋法中比较高效的一种，这种方法以PVA-海藻酸钠作为混合溶胶，将酵母细胞固定起来进行酒精发酵，不仅可以使细胞浓度增加，而且可以多次使用，减少了酵母培养增殖所消耗的糖分；操作简单、过程迅速、颗粒不粘连、颗粒强度大大提高，且增加了颗粒的生物活性和稳定性，因此可实现连续化生产，提高酒精生产效率。

【实验一】一、酵母菌的分离与培养一、【实验目的】学习用选择性培养基分离酵母菌。

二、【实验原理】大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH值为4.5〜6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。

酵母菌生长迅速，在液体培养基中比霉菌生长得快。

利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。

三、【实验仪器和材料】1、实验材料：成熟葡萄试剂：0.1%吕氏（Loeffier）美蓝染液配制方法：A 液：美蓝（methylene blue, 又名甲烯蓝）0.3 g, 95%乙醇30 ml；B 液：0.0l% KOH l00ml 。

混合A 液和B 液即成，根据需要可配制成稀释美蓝液。

2、培养基：（1）乳酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）：豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g）, pH值4.5。

配制方法：1）先将豆芽称60 g加蒸馏水300 ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至250 ml左右，制成20%的豆芽汁；2）加入葡萄糖，用乳酸调pH 值至4.5 左右，然后加蒸馏水定容至300 ml；3）分装9 ml于小试管中，高压蒸汽灭菌于，115 °C, 20 min。

（2）YPG培养基（500 ml）:酵母膏（5 g）、蛋白胨（10 g）、葡萄糖（10 g）、琼脂（10 g）、pH值6.5〜6.8。

配制方法：1）称取酵母膏5 g,蛋白胨10 g，葡萄糖10 g,放入500 ml烧杯中，然后加入400 ml蒸馏水；2）使用HCI及NaOH调整pH值6.5〜6.8,加蒸馏水定容至500 ml，再放入琼脂10 g；3）装入三角瓶，塞上棉塞，用报纸包扎瓶口。

高压蒸汽灭菌，于115 C, 20 min，冷却至50-55 C 左右时倒入无菌平皿。

3 、器材烧杯、玻璃棒、三角瓶、培养皿、试管、吸管、移液枪、漏斗、纱布、瓷缸、接种环、刮铲、载玻片、显微镜、酒精灯、高压蒸汽灭菌锅、载玻片、盖玻片四、【实验步骤】1、富集培养（第1天）：取葡萄皮于90 ml无菌水，放置于摇床150 rpm，摇晃5 min，取出后稍静置。

用无菌枪头吸取上清液1 ml 接入9 ml 的乳酸豆芽葡萄糖培养液中，同时做一个不接菌液的空白对照管一起培养。

置28〜30C培养箱中培养20-24小时（第2, 3天）。

2、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.1%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。

活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。

（第2天）水一碘液浸片的观察：在载玻片中央加一小滴革兰氏染色用碘液，然后在其上加 3 小滴水，取少许酵母菌液放在水一碘液中混匀，盖上盖玻片。

3、镜检：取少许富集的菌液观察酵母菌的形态。

（第2 天）4、菌液稀释：用无菌枪头吸取0.5 ml 富集菌液，加入装有4.5 ml 无菌水的试管中，吹吸几次，让菌液混合均匀，稀释成10-1稀释液。

再用1 ml无菌枪头，吸取10-1稀释液0.5 ml，移入装有4.5 ml 无菌水的试管中，吹吸混匀，即成10-2稀释液。

同样做法再一次，做成10-3稀释液。

5、倒平板培养（第2 天）：倒YPG 培养基平板，凝固待用。

用无菌枪头分别吸取10-2、10-3浓度的稀释液0.1 ml于YPG平板上，用涂布棒将菌液在平板上涂抹均匀。

平放桌面30 min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，置28〜30 C再培养24 h或稍长（过长则霉菌长出）（第3，4 天）。

6、纯化：从长有单菌落的平板中选取典型的酵母菌菌落，用接种环挑取一环的酵母菌，在YPG平板中采用划线分离法分离酵母菌。

并同时制片做纯度检查。

若不纯，应进一步挑取该菌落采用划线分离，直至获得纯培养体为止。

涂片镜检，菌落观察。

（第4，5 天）7、菌种保藏：将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内4 C下保存。

（第4，5 天）五、【注意事项】1、美兰染色浓度和时间严格掌握；2、平板培养时间不宜过长，过长则霉菌长出。

六、【思考题】1、绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征。

2、说明观察到的吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间对死活细胞数的影响。

【实验二】二、发酵菌株的筛选一、【实验目的】学习用显色剂及杜氏小管判断各分离酵母菌的发酵能力。

二、【实验原理】TTC（2 ，3，5 一氯化苯基四氮哇）是一种显色剂，它对酵母的代谢产物发生呈色反应，通过它可以判断酵母中呼吸酶活力的大小，即酵母产酒精能力的高低。

在一定培养基上培养的酵母菌落上覆盖一层TTC 显色剂后会显不同颜色，产酒精能力强的酵母菌落成深红色，次之为粉红色。

酵母进行酒精发酵过程会产生CO?，根据杜氏小管中产气多少可以间接判断酵母发酵能力的强弱。

三、【实验材料】A 、培养基TTC上层培养基：TTC 0.05 g、葡萄糖0.5 g、琼脂1.5 g、水100 ml:TTC 下层培养基:YPG 琼脂。

孚L酸豆芽葡萄糖培养液（300 ml）:豆芽（60 g）、葡萄糖（6 g），乳酸调pH值至4.5。

B 、器材平皿、试管、杜氏小管、接种针四、【实验步骤】（l ）酵母菌一级筛——TTC 法:将分离得到的各菌株依次接入TTC下层培养基的平皿中，每个平板接8〜10株（第4天），培养24h （第5天），长出菌落然后倒入TTC上层培养基，30 C下保温（阴暗处）2〜3 h。

比较各菌株间的颜色深浅，颜色深的菌株呼吸酶活力强，有较强的产酒精能力。

选取原始平板中对应的颜色较深的10〜20 株菌，作为二级筛的出发菌株。

（2）酵母菌二级筛——杜氏小管观察法选取上述显色较深的酵母菌落（同时接种一颜色较浅的菌落作为对照），挑取一接种环接入乳酸豆第5 天），培养24 h 后（第6 天），观察杜氏管中产气芽葡萄糖培养液中，同时试管内倒置一杜氏小管情况。

打开棉塞，嗅闻是否有酒精气味。

记录产气及酒精气味情况，并于显色情况进行比较。

根据杜氏小管中产气多少分为5个等级:(1) “ ++++表”示杜氏小管中充满气体；(2) “ +++表”示杜氏小管中充满3/4 气体；(3) “ +表+”示杜氏小管中充满1/2 气体；(4) “ +表'示'杜氏小管中充满l/4 气体；(5) 一“ ”表示杜氏小管中没有气体。

五、【注意事项】1、TTC 法筛选要注意避光；2、放置杜氏小管时，注意把杜氏小管中的气体排干净，不要残留气体。

六、【思考题】1、列表并对比分析酵母菌落显色深浅与杜氏小管中产气多少之间的关系。

2、使用显色指示剂进行酵母初筛有哪些好处？实验三】三、发酵菌株的鉴定一、【实验目的】学习酵母菌的鉴定方法，熟悉使用分子生物学手段进行微生物鉴定。

二、【实验原理】微生物鉴定是科研及生产过程中非常重要的工作。

可以通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行鉴定。

三、【实验仪器和材料】A 、DNA 提取需要配置的试剂高盐的TE buffer终浓度配制50 ml10 mM Tris.Cl, pH 8.0 0.5 ml（1M 母液）0.1 mM EDTA, pH 8.0 0.01 ml（0.5M 母液）1 M NaCl 1.8 g室温可保存几年CTAB 提取液终浓度配制200 ml2%（W/V） CTAB4 g100 mM Tris.Cl, pH8.0 20 mM EDTA, pH8.0 1.4 M NaCl 室温可保存几年10 XCTAB/NaCI 溶液（10%CTAB/0.7 M NaCI ）在80 ml H 2O 中溶解4.1 g NaCI ，缓慢加入10 g CTAB ，同时加热并搅拌。

如果需要，可加热 至65 C 溶解。

定容至 100 ml 。

其它化学试剂：异丙醇、乙醇、液氮、Taq 酶、dNTPs 、弓I 物。

B 、仪器移液枪（10、100、1000l ,0.2 ml PCR 管，枪头，2 ml eppendof 管，饭盒。

四、【实验步骤】1. 形态学鉴定： （第 7 天）A ．菌落形态观察 按普通微生物实验指导书观察所分离的真菌菌落特征。

B. 细胞形态学观察 按普通微生物实验指导书简单制片法观察，先低倍镜，后高倍镜观察并绘制细胞形态图。

2. 分子生物学鉴定：（ 1 ）酵母 DNA 的提取（ CTAB 法提取真菌基因组 DNA ）（第 7,8 天）1） 取少量酵母菌落连同部分培养基一起放入研钵中，加入液氮粉碎，然后加入800卩l 2% 65保温的2«TAB 抽提液，混匀，65C 保温30〜60 min 。

2） 加入800 □的氯仿/异戊醇（24： 1），轻缓颠倒混匀，10000 r/min ，离心5 min 。

3） 取上清（约600卩,1）加入1/10体积（约60 Q1的65C 的CTAB/NaCl 溶液，颠倒混匀。

4） 用等体积（约600 □的氯仿/异戊醇（24： 1）抽提，10000 r/min ，离心5 min 。

5） 取上清（约450卩,1）加入0.8 V 的异丙醇沉淀核酸，颠倒混匀，（如沉淀可见，继续做下步，否贝-20 C 保温 10~20 min ）。