碱裂解法提取质粒操作步骤开始操作
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3、怎样去除蛋白质？ （已经学过） 留有质粒DNA的上清，经酚和氯仿去除蛋白质后, 用乙醇沉淀质粒DNA，即得到质粒DNA.
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0
10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0
纯化原理：离子交换柱层析等
小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit
可用于大部分分生实验
质粒的电泳
开环 线性 超螺旋
质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂 ，因此可以自由旋转从而消除 张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成.
（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置
冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。
（去除蛋白质）
（4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色 沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25： 24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。
质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环
重组质粒的鉴定
平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有 或未含有质粒的细胞，却无法区分含 有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒
质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
质粒电泳
空质粒 重组质粒
质粒酶切电泳
a:酶切前 b:酶切后
重组质粒分子量变大 而在电泳中滞后 注： 观察质粒的电泳带型
取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。 电泳结束后照像保存，结果分析。
质粒提取方法
电泳时讲授10-20min
质粒的量 质粒的纯度要求
质粒的大小
决定使用不同的方法
如：
如：
质粒过大：温和裂解
质粒大小适中：碱裂解，煮沸法
2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体
0.2mol/L
NaOH
1%
SDS
录像5分钟：（8：20~8：25）
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH
60 ml
5mol/L 醋wenku.baidu.com钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
大肠杆菌遗传物质
质粒分子量较小，大小只 有普通细菌染色体DNA的百分 之一。
基因组DNA分子量较大， 细菌基因组约含3000个基因， 5106 bp。
基因组DNA容易断裂线性化
碱裂解法提取质粒的原理
原理：
1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱 性条件下发生变性。
2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形 成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；
上次实验小结
1、观察自己组的实验结 果：转化平板
*培养板在37oC 培养12-16h 卫星菌：培养时间过长
2、实验中的难点
*制备效率高的感受态细胞
实验四
开始实验操作前：本次实验介绍10-15min
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂 小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法
质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求） 要求不同的纯化方法
方法举例：
经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一 样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置
继续实验操作
（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。
（去除RNA）
（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
质粒DNA的制备
开始操作：
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：）
取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。
（2）（细菌的裂解：）
加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。
注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。
分析质粒切不开的原因。
插入片段
（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的 氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/ 分 离心 5min 。
（沉淀DNA）
（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积 的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。
上午实验结束
下午实验内容
１ 继续提取质粒： 获取及溶解沉淀的质粒DNA 2 质粒DNA电泳分析：
特点：纯度最高（可获得
缺口环状或 线状DNA
闭环质粒DNA
高质量的超螺旋质 粒DNA）、最贵、 最麻烦
应用：大量制备质粒；基 因注射，基因转染 等对质粒质量要求 高的实验
常用方法：小量碱裂解法
特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）
测序、转染（细提）
质粒提取试剂盒
满足不同需要的试剂盒
质粒载体
筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点
质粒提取原理：
质粒提取有多种方法，但 都包含有3个基本步骤： 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。
√去除蛋白质 √去除RNA
*酚-氯仿抽提法 *RNase消化
√去除基因组DNA
？？？
质粒DNA与基因组DNA的区别
1、部位不同： 2、大小不同：
碱裂解法提取质粒试剂：
1) 细胞悬浮液（溶液I）--悬浮菌体 50 mmol/L 葡萄糖 25 mmol/L Tris.Hcl PH 8.0
10 mmol/L EDTA.Na2 PH 8.0
纯化原理：离子交换柱层析等
小量制备质粒kit 大量制备质粒kit 去除内毒素制备质粒kit
可用于大部分分生实验
质粒的电泳
开环 线性 超螺旋
质粒DNA的存在形式有3种: 1、共价闭环DNA:常以超螺旋 形式存在 2、开环DNA:质粒DNA两条链 中有一条发生一处或多处断裂 ，因此可以自由旋转从而消除 张力,形成松弛的环状分子 3、线性DNA:因质粒DNA的两 条链在同一处断裂而造成.
（3）（中和：）加入150l中和液，上下颠倒混合后置
冰上 5min， 12,000转/分， 4℃离心 5min。
（去除蛋白质）
（4） 将上清移至另一离心管中(注意不要混入白色 沉淀物)，加入等体积的TE饱和的酚/氯仿/异戊醇(25： 24:1)混和液，振荡混匀1min，12,000转/分离心 5min。
质粒DNA的3种形式泳动速度:超螺旋>线性>开环
重组质粒的鉴定
平板筛选：大多数情况下，平板筛选只能区分含有 或未含有质粒的细胞，却无法区分含 有空质粒或重组质粒的细胞 提取的质粒
质粒电泳筛选重组质粒
重组质粒的进一步酶切鉴定
质粒电泳
空质粒 重组质粒
质粒酶切电泳
a:酶切前 b:酶切后
重组质粒分子量变大 而在电泳中滞后 注： 观察质粒的电泳带型
取10 l 的质粒DNA 加2 l 上样液混匀。 加到0.8%琼脂糖凝胶的加样孔内。 电泳条件：100V 40min。 电泳结束后照像保存，结果分析。
质粒提取方法
电泳时讲授10-20min
质粒的量 质粒的纯度要求
质粒的大小
决定使用不同的方法
如：
如：
质粒过大：温和裂解
质粒大小适中：碱裂解，煮沸法
2) 细菌裂解液（溶液II） --裂解菌体
0.2mol/L
NaOH
1%
SDS
录像5分钟：（8：20~8：25）
3）中和液（溶液III） ----中和NaOH
60 ml
5mol/L 醋wenku.baidu.com钾
11.5ml
冰醋酸
28.5ml
水
4）20mg/ml RNase----降解细菌RNA 工作浓度30～50 g/ml 其他试剂作用和成分同实验一。
大肠杆菌遗传物质
质粒分子量较小，大小只 有普通细菌染色体DNA的百分 之一。
基因组DNA分子量较大， 细菌基因组约含3000个基因， 5106 bp。
基因组DNA容易断裂线性化
碱裂解法提取质粒的原理
原理：
1、强碱和SDS裂解细菌，细菌中的质粒或基因组DNA在碱 性条件下发生变性。
2、怎样去除基因组DNA？ 当加入酸性物质进行中和时，质粒DNA很快复性， 染色体DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起难以复性而形 成沉淀，经离心随细胞碎片一起去除；
上次实验小结
1、观察自己组的实验结 果：转化平板
*培养板在37oC 培养12-16h 卫星菌：培养时间过长
2、实验中的难点
*制备效率高的感受态细胞
实验四
开始实验操作前：本次实验介绍10-15min
小量制备质粒和电泳分析
质粒……
质粒
是存在于细菌染色体外的小型闭 合环状双链DNA分子，在宿主细 胞内可独立自主复制并赋予宿主 细胞一定的遗传性状
大量提取质粒：二次扩增细菌，纯化方法要复杂 小量提取质粒：单克隆培养，普通碱裂解法
质粒纯度：要求高纯度、无内毒素等等 （满足各种转基因实验的要求） 要求不同的纯化方法
方法举例：
经典的方法：CsCl-溴化乙锭梯度密度离心
原理：不同结构和大小的DNA参入的溴化乙锭的量不一 样从而在CsCl梯度密度离心中处于不同的位置
继续实验操作
（7） 12,000 转/分离心5min。 弃上清，室温干燥质粒DNA 5-10min。
（去除RNA）
（8）用20l含RNase的水溶解质粒DNA， 轻轻吹打混合。 37 ℃保温10min
20 l质粒 DNA溶液
取出10 l放于另一个离心管中备用 剩余10 l用于下一步酶切
质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳
质粒DNA的制备
开始操作：
碱裂解法提取质粒操作步骤
（1）（细菌的收获：）
取1.5 ml 工程菌液6,000转/分，离心2min， 弃上清。
（2）（细菌的裂解：）
加入200l预冷的细胞悬浮液（溶液I）悬浮细菌 加入200l细菌裂解液（溶液II）， 颠倒混合离心管内容物，待溶液变粘稠为止。
注： 粘稠 ：开盖后出现拉丝现象，证明DNA已经游出。
分析质粒切不开的原因。
插入片段
（5）将上层水相移至另一离心管中，加入等体积的 氯仿/异戊醇(24:1)溶液，振荡混匀1min， 12,000转/ 分 离心 5min 。
（沉淀DNA）
（6）将上层水相移至另一离心管中，加入2.5倍体积 的无水乙醇， 置-20℃沉淀10－15 min。
上午实验结束
下午实验内容
１ 继续提取质粒： 获取及溶解沉淀的质粒DNA 2 质粒DNA电泳分析：
特点：纯度最高（可获得
缺口环状或 线状DNA
闭环质粒DNA
高质量的超螺旋质 粒DNA）、最贵、 最麻烦
应用：大量制备质粒；基 因注射，基因转染 等对质粒质量要求 高的实验
常用方法：小量碱裂解法
特点：小量质粒制备、最简便、快捷 应用：质粒酶切鉴定、克隆（粗提）
测序、转染（细提）
质粒提取试剂盒
满足不同需要的试剂盒
质粒载体
筛选标记 MCS（多克隆位点） 复制原点
质粒提取原理：
质粒提取有多种方法，但 都包含有3个基本步骤： 1)培养细菌使质粒扩增； 2)收集裂解细菌； 3)分离纯化质粒DNA。
√去除蛋白质 √去除RNA
*酚-氯仿抽提法 *RNase消化
√去除基因组DNA
？？？
质粒DNA与基因组DNA的区别
1、部位不同： 2、大小不同：