临床微生物检验流程
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9
镜检－染液
染色试剂
• 革兰氏染色液套装 R40080 250ml*4
• 抗酸染液套装－分枝杆菌（结核） R40112 250ml*6
• 荧光染液－真菌、微孢子虫等 BactiDrop染色剂
染色质控片
• 抗酸染色、革兰氏染色、隐孢子虫等
10
培养 如果要使细菌生长, 必须满足细菌的需要 :
• 营养琼脂 • 正确的空气环境 • 正确的温度
细菌浓度
3 2
1
24Hrs 48Hrs
24
4
时间
分离培养
目的：获得纯培养后进一步鉴定 1. 无菌部位的标本（血液，脑脊液，胸腹水，关节液，尿液）：
直接接种在液体/固体培养基。 2. 正常菌群存在部位的标本（各种鼻咽，尿道试子，粪便）：
接种至选择或鉴别培养基。 培养条件：37℃ 16-20小时培养，少数需3-4周（如布鲁菌，分枝杆菌） 优点：比直接涂片镜检的阳性率高。
(可以用肉眼观察)
用肉汤来培养是不能区别多种细菌生长还是一种细菌生长 用来增菌
例: 脑心肉汤, 胰酶大豆肉汤...
17
分离培养—培养温度
• 选择正确的温度 :
- 细菌 : 37℃ - 霉菌 : 30℃
培养箱 ?
30℃
37℃
19
分离培养—培养条件
不同的呼吸种类
1
2
3
4
20
分离培养—培养条件
1 - 绝对需氧菌 需要有氧气 它们是利用氧气来产生能量 : 呼吸（一种氧化的代谢作用）
–杆菌，革兰阴性，氧化酶阴性肠杆菌
-杆菌，革兰阴性，氧化酶阳性非发酵菌
31
细菌鉴定—生化特性研究
举例:
细菌新陈代谢研究（酶类代谢）
葡萄糖
发酵糖产酸 酶
无酶
pH减小 颜色变化
TEST (+)
TEST (-)
32
细菌鉴定—生化反应
生化反应： 糖的氧化或发酵
葡萄糖，乳糖，蔗糖， 阿拉伯糖 蛋白质代谢
凝胶，乳类，血 蛋白酶，脲酶，脱羧酶 糖类代谢 脂代谢： 脂肪酶，卵磷脂酵素
病毒 • M4培养基（制成） • M4 RT培养基（制成）
6
镜检
1 - 直接检查 把一滴放在玻片与盖片之间 : 镜片 x 40, dry
• 细菌的存在和数目 • 形态和分类特点 • 动力 • 细胞学：观察细胞
如：白细胞（感染的指使）
7
镜检
2 – 革兰氏染色 细菌学最常用的染色方法 用来给细菌分类
拭子 拭子或注射器
阴道炎, 宫颈炎, 前列腺 炎, 尿道炎, 性病…
脓肿, 腹腔液, 皮肤感染
3
标本运送
马上把标本接种或使用运送培养基
为什么? -细菌是生物 ! - 有必要 : • 保持它们生存 • 防止它们增长
为什么 ? -实验室与采标本的地点距离很远 : 标本是在家里采， 或在病人床边采
4
包被抗体乳胶 细菌
黏附
- 用已分纯的细菌
- 或直接用标本 优势 : 快速 (立即反应)
35
细菌鉴定—显色培养基
• 通过颜色来鉴定 ：
直接在平板上鉴定细菌 : 菌落颜色
用于常见标本 用于常见细菌
重要性 : 节约时间和成本
36
克柔念珠菌 光滑念珠菌 白色念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌
细菌鉴定—分子生物学方法
.25
0.5
1
2
4
MIC = 8µg/ml
8
16
32
41
肉汤微量稀释法
42
琼脂稀释法
• 逐渐增加培养基中的抗生素浓度
12 34
Control
43
12 34
1g/ml
11 34
2g/ml
12
34
4g/ml
琼脂稀释法
12
12
12
12
34
34
34
Control
Strain 1 2 3 4
1g/ml
2g/ml
15
培养－ Oxoid制成培养基
医院常用品项： • 滋养性：营养琼脂、血平板、巧克力平板 • 肠道菌：麦康凯、中国蓝玫红酸、
伊红美蓝、 SS平板 • 分隔平板：血琼脂/麦康凯琼脂、
血琼脂/中国蓝玫红酸琼脂等 • 真菌：沙保氏葡萄糖 • 显色：念珠菌显色培养基、
尿路感染显色培养基
16
培养
• 在液体培养基的生长 : 细菌在营养肉汤里会增生, 令培养基变得浑浊
鉴别纸片：杆菌肽、奥普托欣纸片
33
诊断纸片和诊断条
诊断与鉴定－RAPID生化鉴定 • 快速鉴别多种微生物 • 简单的一步接种 • 4小时有氧孵育 • 独特的颜色反应和明确的结果 • 大容量数据库
34
细菌鉴定—乳胶凝集
• 抗原特性研究 免疫反应 : 抗原-抗体反应 抗体固定于乳胶颗粒 相应抗原出现时抗体主动黏附
25
细菌鉴定
需用条件 : 取得一个纯培养 (如果是多种细菌标本)
第一步 : 分离
把标本接种在营养
1 细菌
1 菌落
26
细菌鉴定
分纯
1
2
2
4
27
3 4
细菌鉴定—细菌分类根据
•族
•属
• 种类
Micrococcaceae微球菌族
Staphylococcus葡萄球菌属
aureus金黄色葡萄球菌
example :
例 ： 弯曲菌， 支原体
5 - 嗜二氧化碳的细菌 有些细菌较喜欢多二氧化碳的环境生长
例 ： 淋病氏菌
22
分离培养—培养条件
• 选择适当的空气环境 :
- 需氧菌 - 兼性需氧菌 - 微需氧菌 - 厌氧菌
- 嗜二氧化碳的细菌
无需产生器
微需氧菌产生器 厌氧产生器 CO2 产生器
23
分离培养—培养时间
• 细菌生长过程
GC
1 g/ml 2g/ml 4 g/ml MIC
+
-
-
- <1
+
+
-
- =2
+
+
+
- =4
+
+
+
+ >4
44
34
4g/ml
E-test
45
药敏试验
临床结果报告分类:
S
Susceptible敏感
R
Resistant耐药
I
Intermediate中介
46
鉴定药敏自动化仪器的使用
对实验室的帮助
1. 加快实验报告的速度 2. 减少人为误差，提高检验结果的准确性 3. 降低患者的治疗费用 4. 提高实验室的经济效益
47
临床微生物实验室的任务
帮助临床医生对感染性疾病作出及时诊断和制定正确治疗方案 评估抗菌治疗的疗效 对感染菌进行流行病学调查和跟踪
48
微生物实验室特点
检测的对象：微小生物 检测的时限：需一定时间的培养 检测结果的临床意义：指导临床用药 国内微生物实验室的现状：
1.检测手段（贫富差异明显） 2.实验室地位较低 3.国内临床医生的诊断治疗习惯 4.实验工作人员素质 5.与临床严重脱节
49
Q&A
50
Together, Everyone Achieves More
51
临床微生物检验流程
微生物实验室工作流程
•1.标本采集 •2.镜检 •3.分离培养 •4.细菌鉴定 •5.药敏试验
涂片染色 血清学检测 DNA 探针 单克隆抗体
待检样本 接种培养
阴性
报告
阳性
涂片染色
ID
AST
报告
2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ本采集
标本
尿/痰 大便 生殖道标本 脓
标本收集
病理
尿道感染/呼吸道感染
肠食物中毒，腹泻
11
分离培养—培养基
- 选择正确的培养基: • 视乎要检测的细菌 • 视乎标本
?
基础培养基 ?
显色培养基 ?
增菌培养基 ?
12
选择性培养基 ?
分离培养—培养基
• 不同种类的培养基
• 基础培养基 : 含最少的营养元素 • 增菌培养基: 基础培养基+ 血, 生长因子... • 选择性培养基 : 加有抗生素或其他 • 显色培养基 : 加有导致产生有颜色菌落的显色底物
培养基可以同时是选择性和增菌, 或选择性和显色...
13
培养
• 在固体培养基的生长 : 把细菌放在营养基上会使细菌增长和形成肉眼可见的组:
菌落 = 1 百万细菌 = 20 代
用来分离
14
培养－ Oxoid干粉培养基
• CM：基础干粉，含有丰富的碳源、氮源、生长因子、选择性抑制因子， 显色剂
• SR：添加剂，通常包装10小瓶/盒，每瓶通常可配制500ml或225ml添加 的培养基，成分通常是抗生素和热敏感的营养成分
• 测抑菌圈直径 • 直径大小对应MIC值 • 根据直径报告S，I，R。
39
纸片扩散法
40
肉汤稀释法
MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION(MIC)最低抑菌浓度 抗生素能抑制细菌可见生长的最低浓度。
不生长 = 抗生素抑制细菌生长 生长 = 抗生素无法抑制细菌生长
Increasing Antibiotic Conc.
标本运送
如果不能马上接种培养基, 在运送过程中把标本储存 :
运送培养基能避免标本干燥
4℃
37℃和/或 运送培养基
尿，大便
?
不需要细菌增生
生殖道标本, CSF, 血, 脓 可能是脆弱的细菌 可能是厌氧菌
5
样本运送－运送培养基
细菌 • Amies培养基 • Stuart’s培养基 • Cary－Blair培养基 • 运送拭子：Amies琼脂凝胶、液体运送拭子
S. Aureus金黄色葡萄球菌
Enterobacteriaceae肠杆菌族
Escherichia埃希氏菌属
coli大肠（杆）菌
E. Coli大肠埃希菌
28
细菌鉴定—倾向性实验
结果能帮助判断细菌的族或属 • 形态学: 球菌或杆菌（形态） 分布情况 染色情况
• 观察平板上的菌落特征：
大小，颜色，外型，气味，在血平板上是否溶血
• 触酶，氧化酶
29
细菌鉴定—酶类检测
– 触酶实验: 还原过氧化氢
2 H2O2 2 H2O + O2
触酶
–氧化酶 : TMPD 氧化的 TMPD
阳性呈现紫红色 (TMPD = N Tetra methyl - para - phenylene - diamine)
30
举例
–球菌，革兰阳性，触酶阳性 葡萄球菌 –球菌，革兰阳性，触酶阴性 链球菌
例 ： 假单胞菌，分支杆菌
2 - 兼性厌氧菌 可在有空气或没有空气下生长， 但是主要的能量是靠发酵产生
例 ： 肠道杆菌
21
分离培养—培养条件
3 - 绝对厌氧菌
只会在没有空气的情况生长。氧气对这些细菌是有 毒的。
所有的能量是从发酵而来 （发酵代谢）
例:
梭菌属细菌
4 - 微需氧细菌 较喜欢在少氧气的环境下生长
革兰氏+ 革兰氏 -
8
紫蓝色 粉红色
其他染色的方法
Coloration with methylene blue亚甲基蓝染色 用于白细胞内的细菌染色
eg : 淋病双球菌
Giemsa吉母萨染色 用于血液或细胞内的细菌染色
Ziehl - Neelsen 齐-奈染色 用于分支杆菌染色
Acridine orange吖啶橙染色 荧光染色用于细菌感染量少的标本
• 分子生物学鉴定： 通过检测特定的DNA片段来鉴定细菌
用细菌或直接用标本进行DNA检测
37
药物敏感实验 (AST)
目的：指导临床合理使用抗生素，控制感染，细菌耐 药性监测
方法： 纸片扩散法(K-B法) E-Test 琼脂稀释法(平板) 肉汤稀释法: 试管 微孔板
38
纸片扩散法
A
B
C G
H
F
D
E
镜检－染液
染色试剂
• 革兰氏染色液套装 R40080 250ml*4
• 抗酸染液套装－分枝杆菌（结核） R40112 250ml*6
• 荧光染液－真菌、微孢子虫等 BactiDrop染色剂
染色质控片
• 抗酸染色、革兰氏染色、隐孢子虫等
10
培养 如果要使细菌生长, 必须满足细菌的需要 :
• 营养琼脂 • 正确的空气环境 • 正确的温度
细菌浓度
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24Hrs 48Hrs
24
4
时间
分离培养
目的：获得纯培养后进一步鉴定 1. 无菌部位的标本（血液，脑脊液，胸腹水，关节液，尿液）：
直接接种在液体/固体培养基。 2. 正常菌群存在部位的标本（各种鼻咽，尿道试子，粪便）：
接种至选择或鉴别培养基。 培养条件：37℃ 16-20小时培养，少数需3-4周（如布鲁菌，分枝杆菌） 优点：比直接涂片镜检的阳性率高。
(可以用肉眼观察)
用肉汤来培养是不能区别多种细菌生长还是一种细菌生长 用来增菌
例: 脑心肉汤, 胰酶大豆肉汤...
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分离培养—培养温度
• 选择正确的温度 :
- 细菌 : 37℃ - 霉菌 : 30℃
培养箱 ?
30℃
37℃
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分离培养—培养条件
不同的呼吸种类
1
2
3
4
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分离培养—培养条件
1 - 绝对需氧菌 需要有氧气 它们是利用氧气来产生能量 : 呼吸（一种氧化的代谢作用）
–杆菌，革兰阴性，氧化酶阴性肠杆菌
-杆菌，革兰阴性，氧化酶阳性非发酵菌
31
细菌鉴定—生化特性研究
举例:
细菌新陈代谢研究（酶类代谢）
葡萄糖
发酵糖产酸 酶
无酶
pH减小 颜色变化
TEST (+)
TEST (-)
32
细菌鉴定—生化反应
生化反应： 糖的氧化或发酵
葡萄糖，乳糖，蔗糖， 阿拉伯糖 蛋白质代谢
凝胶，乳类，血 蛋白酶，脲酶，脱羧酶 糖类代谢 脂代谢： 脂肪酶，卵磷脂酵素
病毒 • M4培养基（制成） • M4 RT培养基（制成）
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镜检
1 - 直接检查 把一滴放在玻片与盖片之间 : 镜片 x 40, dry
• 细菌的存在和数目 • 形态和分类特点 • 动力 • 细胞学：观察细胞
如：白细胞（感染的指使）
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镜检
2 – 革兰氏染色 细菌学最常用的染色方法 用来给细菌分类
拭子 拭子或注射器
阴道炎, 宫颈炎, 前列腺 炎, 尿道炎, 性病…
脓肿, 腹腔液, 皮肤感染
3
标本运送
马上把标本接种或使用运送培养基
为什么? -细菌是生物 ! - 有必要 : • 保持它们生存 • 防止它们增长
为什么 ? -实验室与采标本的地点距离很远 : 标本是在家里采， 或在病人床边采
4
包被抗体乳胶 细菌
黏附
- 用已分纯的细菌
- 或直接用标本 优势 : 快速 (立即反应)
35
细菌鉴定—显色培养基
• 通过颜色来鉴定 ：
直接在平板上鉴定细菌 : 菌落颜色
用于常见标本 用于常见细菌
重要性 : 节约时间和成本
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克柔念珠菌 光滑念珠菌 白色念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌
细菌鉴定—分子生物学方法
.25
0.5
1
2
4
MIC = 8µg/ml
8
16
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肉汤微量稀释法
42
琼脂稀释法
• 逐渐增加培养基中的抗生素浓度
12 34
Control
43
12 34
1g/ml
11 34
2g/ml
12
34
4g/ml
琼脂稀释法
12
12
12
12
34
34
34
Control
Strain 1 2 3 4
1g/ml
2g/ml
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培养－ Oxoid制成培养基
医院常用品项： • 滋养性：营养琼脂、血平板、巧克力平板 • 肠道菌：麦康凯、中国蓝玫红酸、
伊红美蓝、 SS平板 • 分隔平板：血琼脂/麦康凯琼脂、
血琼脂/中国蓝玫红酸琼脂等 • 真菌：沙保氏葡萄糖 • 显色：念珠菌显色培养基、
尿路感染显色培养基
16
培养
• 在液体培养基的生长 : 细菌在营养肉汤里会增生, 令培养基变得浑浊
鉴别纸片：杆菌肽、奥普托欣纸片
33
诊断纸片和诊断条
诊断与鉴定－RAPID生化鉴定 • 快速鉴别多种微生物 • 简单的一步接种 • 4小时有氧孵育 • 独特的颜色反应和明确的结果 • 大容量数据库
34
细菌鉴定—乳胶凝集
• 抗原特性研究 免疫反应 : 抗原-抗体反应 抗体固定于乳胶颗粒 相应抗原出现时抗体主动黏附
25
细菌鉴定
需用条件 : 取得一个纯培养 (如果是多种细菌标本)
第一步 : 分离
把标本接种在营养
1 细菌
1 菌落
26
细菌鉴定
分纯
1
2
2
4
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3 4
细菌鉴定—细菌分类根据
•族
•属
• 种类
Micrococcaceae微球菌族
Staphylococcus葡萄球菌属
aureus金黄色葡萄球菌
example :
例 ： 弯曲菌， 支原体
5 - 嗜二氧化碳的细菌 有些细菌较喜欢多二氧化碳的环境生长
例 ： 淋病氏菌
22
分离培养—培养条件
• 选择适当的空气环境 :
- 需氧菌 - 兼性需氧菌 - 微需氧菌 - 厌氧菌
- 嗜二氧化碳的细菌
无需产生器
微需氧菌产生器 厌氧产生器 CO2 产生器
23
分离培养—培养时间
• 细菌生长过程
GC
1 g/ml 2g/ml 4 g/ml MIC
+
-
-
- <1
+
+
-
- =2
+
+
+
- =4
+
+
+
+ >4
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4g/ml
E-test
45
药敏试验
临床结果报告分类:
S
Susceptible敏感
R
Resistant耐药
I
Intermediate中介
46
鉴定药敏自动化仪器的使用
对实验室的帮助
1. 加快实验报告的速度 2. 减少人为误差，提高检验结果的准确性 3. 降低患者的治疗费用 4. 提高实验室的经济效益
47
临床微生物实验室的任务
帮助临床医生对感染性疾病作出及时诊断和制定正确治疗方案 评估抗菌治疗的疗效 对感染菌进行流行病学调查和跟踪
48
微生物实验室特点
检测的对象：微小生物 检测的时限：需一定时间的培养 检测结果的临床意义：指导临床用药 国内微生物实验室的现状：
1.检测手段（贫富差异明显） 2.实验室地位较低 3.国内临床医生的诊断治疗习惯 4.实验工作人员素质 5.与临床严重脱节
49
Q&A
50
Together, Everyone Achieves More
51
临床微生物检验流程
微生物实验室工作流程
•1.标本采集 •2.镜检 •3.分离培养 •4.细菌鉴定 •5.药敏试验
涂片染色 血清学检测 DNA 探针 单克隆抗体
待检样本 接种培养
阴性
报告
阳性
涂片染色
ID
AST
报告
2
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ本采集
标本
尿/痰 大便 生殖道标本 脓
标本收集
病理
尿道感染/呼吸道感染
肠食物中毒，腹泻
11
分离培养—培养基
- 选择正确的培养基: • 视乎要检测的细菌 • 视乎标本
?
基础培养基 ?
显色培养基 ?
增菌培养基 ?
12
选择性培养基 ?
分离培养—培养基
• 不同种类的培养基
• 基础培养基 : 含最少的营养元素 • 增菌培养基: 基础培养基+ 血, 生长因子... • 选择性培养基 : 加有抗生素或其他 • 显色培养基 : 加有导致产生有颜色菌落的显色底物
培养基可以同时是选择性和增菌, 或选择性和显色...
13
培养
• 在固体培养基的生长 : 把细菌放在营养基上会使细菌增长和形成肉眼可见的组:
菌落 = 1 百万细菌 = 20 代
用来分离
14
培养－ Oxoid干粉培养基
• CM：基础干粉，含有丰富的碳源、氮源、生长因子、选择性抑制因子， 显色剂
• SR：添加剂，通常包装10小瓶/盒，每瓶通常可配制500ml或225ml添加 的培养基，成分通常是抗生素和热敏感的营养成分
• 测抑菌圈直径 • 直径大小对应MIC值 • 根据直径报告S，I，R。
39
纸片扩散法
40
肉汤稀释法
MINIMUM INHIBITORY CONCENTRATION(MIC)最低抑菌浓度 抗生素能抑制细菌可见生长的最低浓度。
不生长 = 抗生素抑制细菌生长 生长 = 抗生素无法抑制细菌生长
Increasing Antibiotic Conc.
标本运送
如果不能马上接种培养基, 在运送过程中把标本储存 :
运送培养基能避免标本干燥
4℃
37℃和/或 运送培养基
尿，大便
?
不需要细菌增生
生殖道标本, CSF, 血, 脓 可能是脆弱的细菌 可能是厌氧菌
5
样本运送－运送培养基
细菌 • Amies培养基 • Stuart’s培养基 • Cary－Blair培养基 • 运送拭子：Amies琼脂凝胶、液体运送拭子
S. Aureus金黄色葡萄球菌
Enterobacteriaceae肠杆菌族
Escherichia埃希氏菌属
coli大肠（杆）菌
E. Coli大肠埃希菌
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细菌鉴定—倾向性实验
结果能帮助判断细菌的族或属 • 形态学: 球菌或杆菌（形态） 分布情况 染色情况
• 观察平板上的菌落特征：
大小，颜色，外型，气味，在血平板上是否溶血
• 触酶，氧化酶
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细菌鉴定—酶类检测
– 触酶实验: 还原过氧化氢
2 H2O2 2 H2O + O2
触酶
–氧化酶 : TMPD 氧化的 TMPD
阳性呈现紫红色 (TMPD = N Tetra methyl - para - phenylene - diamine)
30
举例
–球菌，革兰阳性，触酶阳性 葡萄球菌 –球菌，革兰阳性，触酶阴性 链球菌
例 ： 假单胞菌，分支杆菌
2 - 兼性厌氧菌 可在有空气或没有空气下生长， 但是主要的能量是靠发酵产生
例 ： 肠道杆菌
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分离培养—培养条件
3 - 绝对厌氧菌
只会在没有空气的情况生长。氧气对这些细菌是有 毒的。
所有的能量是从发酵而来 （发酵代谢）
例:
梭菌属细菌
4 - 微需氧细菌 较喜欢在少氧气的环境下生长
革兰氏+ 革兰氏 -
8
紫蓝色 粉红色
其他染色的方法
Coloration with methylene blue亚甲基蓝染色 用于白细胞内的细菌染色
eg : 淋病双球菌
Giemsa吉母萨染色 用于血液或细胞内的细菌染色
Ziehl - Neelsen 齐-奈染色 用于分支杆菌染色
Acridine orange吖啶橙染色 荧光染色用于细菌感染量少的标本
• 分子生物学鉴定： 通过检测特定的DNA片段来鉴定细菌
用细菌或直接用标本进行DNA检测
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药物敏感实验 (AST)
目的：指导临床合理使用抗生素，控制感染，细菌耐 药性监测
方法： 纸片扩散法(K-B法) E-Test 琼脂稀释法(平板) 肉汤稀释法: 试管 微孔板
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纸片扩散法
A
B
C G
H
F
D
E