酶的作用机理

（四）酶的活性中心的一级结构 应用化学修饰法对多种酶的活性中心进行研究 发现，在酶的活性中心处存在频率最高的氨基酸 残基是：丝氨酸、组氨酸、天冬氨酸、酪氨酸、 赖氨酸和半胱氨酸。如果用同位素标记酶的活性 中心后，将酶水解，分离带标记水解片段，对其 进行一级结构测定，就可了解酶的活性中心的一 级结构。
教学内容及目的
一* 酶的活性部位 掌握确定酶活性部位的方法 二 酶催化反应的独特性质 三* 影响酶催化的有关因素 酶催化高效的机理 四 酶催化反应机理的实例 五* 酶活性的调节 别构调节，可逆共价调节和酶原的激活 六 同工酶
一 酶的活性中心及必需基团 酶是生物大分子，相对分子质量很大， 而与酶反应的底物一般是相对分子质量较 小的分子，有时即使是大分子底物时，反 应也是逐步进行的，酶仅与大分子底物中 的一小部分作用。与底物接触并且发生反 应的部位就称为酶的活性中心(active center)。酶的活性中心往往是若干个在 一级结构上相距很远，但在空间结构上彼 此靠近的氨基酸残基集中在一起形成具有 一定空间结构的区域，该区域与底物相结 合并将底物转化为产物，对于结合酶来说， 辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。
五 别构调控
别构酶，又称变构酶，指酶分子的非催化部位 与某些化合物可逆地非共价结合后，引起酶的构象 的改变，进而改变酶的活性状态，酶的这种调节作 用称为别构调节(allosteric regulation)，具有变 构调节的酶称别构酶(allosteric enzyme)。凡能使 酶分子发生别构作用的物质称为别构剂(effector)。 别构酶多为寡聚酶，含的亚基数一般为偶数；且 分子中有催化部位（结合底物）与调节部位（结合 变构剂），这两部位可以在不同的亚基上，或者在 同一亚基的两个不同部位。
二、共价调节酶来自百度文库
1、概念： 也称共价修饰酶，指一类可在其它酶的作用下其结构 通过共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共 价修饰调节(covalent modification regulation)，这 类酶称为共价修饰酶(prosessing enzyme)。 一些酶的巯基发生可逆的氧化还原修饰，一些酶以共 价键与磷酸、腺苷等基团的可逆结合，都会引起酶结构 的变化而呈现不同的活性。酶的共价修饰是体内代谢调 节的另一重要的方式。
（二）别构酶作用特点 1、一般别构酶分子上有二个以上的底物结合位点。当底物 与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变， 使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变，或出现 正协同效应(positivecooperative effect)，或出现负协同 效应（negative cooperative effect）。
活力中心判断方法：某一基团被修饰后，酶的活性显著 下降或无活性，可初步判断该基团与酶的活性有关；反之， 与酶的活性无关。 缺点： 也有可能酶活性部位外的某个氨基酸残基侧链的 修饰而影响酶分子的正常空间结构，而导致酶活性的丧失。 为排除这种可能，常在底物保护下用同一试剂对酶作用，若 不能被修饰，说明该基团确实处于活性部位；反之，底物存 在下，该基团可被同一试剂修饰，且使酶失活，在则该基团 不是活性部位的基团，而是结构基团。
高效、专一、易 失活、可调节
特点 酶促反应动力学 酶 概念、组成 和分类 结构、化学 组成、反应 类型
高级结构 氨基酸 侧链
化学本质
蛋白质 提取分离 酶工程
三 、同工酶
同工酶(isoenzyme)是指催化的化学反应相同，酶蛋白的 分子组成形式、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。 这类酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织、甚 至同一组织或细胞中。如乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase,LDH），具有多种分子组成形式：LDH5 （M4）、LDH4（M3H）、LDH3（M2H2）、LDH2 （MH3）、LDH1（H4）。
对各种蛋白水解酶进行类似的分析，功能类似的 酶在一级结构上有惊人的相似性。见下表：
酶
氨基酸顺序
牛胰蛋白酶 …Ser.Cys.Gly.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.V al…
牛胰凝乳蛋 …Ser.Cys.Met.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.L eu… 白酶 猪弹性蛋白 …Gly.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pro.L eu… 酶
酶的必需基团(essential group)
酶的分子中存在着许多功能基团，例如，-NH2、-COOH、 -SH、-OH等，但并不是这些基团都与酶活性有关。一般 将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团。
必需基团可分为四种： 接触残基（contact residue） 辅助残基(auxiliary residue) 结构残基（structure residue）
5、由于别构酶动力学不符合米-曼氏酶的动力学，所以当 反应速度达到最大速度一半时的底物的浓度，不能用Km表示， 而代之以K0.5S表示。
协同指数与饱和比值
（三）生理意义 1、在正协同效应的别构酶的S形曲线中段，底物浓度稍 有降低，酶的活性明显下降，多酶体系催化的代谢通路 可因此而被关闭；反之，底物浓度稍有升高，则酶活性 迅速上升，代谢通路又被打开，因此可以通过细胞内底 物浓度的变化来灵敏地控制代谢速度。 2、别构抑制剂常是代谢通路的终产物，变构酶常处于 代谢通路的入口，通过反馈抑制，可以及早地调节整个 代谢通路，减少不必要的底物消耗。
的底物浓度如何变化，酶始终能以一个较恒定的速度进行
以满足细胞的基本需要。
4、别构酶除活性中心外，还存在着能与变构剂作用的亚 基或部位，称调节亚基(或部位)。别构剂与调节亚基以非 共价键特异结合，可以改变调节亚基的构象，进而改变催 化亚基的构象，从而改变酶活性。凡使酶活性增强的变构 剂称别构激活剂，它能使上述S型曲线左移，饱和量的变 构激活剂可将S形曲线转变为矩形双曲线。凡使酶活性减 弱的变构剂称别构抑制剂，能使S形曲线右移。例如，ATP 是磷酸果糖激酶的变构抑制剂，而ADP、AMP为其变构激活 剂。
猪凝血酶 ..Asp.Ala.Cys.Gln.Gly.Asp.Ser.Gly.Gly.Pr o.…
从上表可知，一些丝氨酸蛋白酶在活性丝氨酸附近的氨基 酸几乎完全一样，而且这个活性丝氨酸最邻近的5-6氨基酸 顺序，从微生物到哺乳动物都一样，说明蛋白质活性中心 在种系进化上有严格的保守性。
酶的活性不仅与一级结构有关，而且与其 高级结构密切相关。就某种程度而言，在酶 的活性表现上，高级结构甚至比一级结构更 为重要。高级结构是形成酶特定空间结构的 保证，高级结构破坏，酶失去活性。
LDH同工酶有组织特异性，LDH1在心肌含量高，而 LDH5在肝、骨骼肌含量高。因此，LDH同工酶的相对含 量的改变在一定程度上反映了某器官的功能状态，临床 上利用这些同工酶在血清中的相对含量的改变作为某脏 器病变鉴别诊断的依据。
同工酶也是研究代谢调节、分子遗传、生物进化、个 体发育、细胞分化和癌变的有力工具，在酶学、生物学、 和医学中均占有重要地位。
非贡献残基（noncontribution residue）
酶活性中心证明方法 1、切除法 对小分子且结构已知的酶多用此法。用专一性的酶切 除一段肽链后剩余的肽链仍有活性，说明切除的肽链与活性 无关，反之，切除的肽链与活性有关。 2、化学修饰法 选用适当的化学试剂与酶蛋白中的氨基酸残基的侧链 基团发生反应引起共价结合、氧化或还原等修饰，称之为化 学修饰。酶分子中可以修饰的基团有：-SH、-OH、咪唑基、 氨基、羧基、胍基等，用作修饰的试剂很多，目前已有七十 多种，但专一性的修饰剂不多。
根据修饰剂是否专一性结合酶的活性中心的特定基团，化学 修饰可分为： (1)非特异性共价共接修饰： 修饰试剂既可与酶的活性部位的某特异基团结合，又可与 酶的非活性部位的同一基团结合，称之为非特异性共价共价 修饰。 此法适用于所修饰的基团只存在与活性部位，在非 活性部位不存在或极少存在。判断标准是：① 酶活力的丧 失程度与修饰剂的浓度成正比；② 底物或竞争性抑制剂保 护下可防止修饰剂的抑制作用。 (2) 特异性的共价修饰 修饰剂专一性地结合于酶的活性部位的特定基团，使酶 失活。如：DIFP（二异丙基氟磷酸，结构见P118）可专一性 地结合丝氨酸蛋白酶活性部位的丝氨酸—OH而使酶失活。 DIFP一般不与蛋白质反应，也不与含丝氨酸的蛋白酶原或变 性的酶反应，只与活性的酶且活性部位含丝氨酸的酶结合。
三、影响酶催化效率的有关因素 酶高效催化的机理
1、底物与酶的邻近效应和定向效应
2、底物分子的形变和扭曲 3、共价催化 4、酸碱催化 5、金属离子的作用 6、活性部位的微环境的影响
酶 与 底 物 相 互 诱 导， 发 生 形 变 断 裂
常见酶的催化机理
通过基因突变，从同一个祖先取得不同的专一性， 称为趋异进化，有些酶来源各异，但是催化三联体组 成相同，有相似的催化机制，这种情况称为丝氨酸蛋 白族异源的趋同进化。
3、亲和标记法： 根据酶与底物能特异性的结合的性质，设计合成一种 含反应基团的底物类似物，作为活性部位的标记试剂，它能 象底物一样进入酶的活性部位，并以其活泼的化学基团与酶 的活性基团的某些特定基团共价结合，使酶失去活性。如胰 凝乳蛋白酶最适底物为：N-对甲苯磺酰-L-苯丙氨酰乙酯或 甲酯，根据此结构设计的亲和标记试剂为：N-对甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲基酮（TPCK），其分子中的氯甲基酮部分可使 酶的His57烷基化形成酶－TPCK衍生物而使酶失活。 4、X—射线衍射法： 把一纯酶的X—射线晶体衍射图谱和酶与底物反应后的 X-射线图谱相比较，即可确定酶的活性中心。
例如葡萄糖的氧化分解可提供能量使AMP、ADP转变成ATP，当ATP过多 时，通过变构抑制剂ATP抑制磷酸果糖激酶的活性，可限制葡萄糖的分解， 而ADP、AMP增多时，则可通过变构激活剂AMP、ADP激活磷酸果糖激酶的 活性促进糖的分解。随时调节ATP/ADP的水平，可维持细胞内能量的正常
供应。
酶原的激活 胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰糜蛋白酶、羧肽酶、 弹性蛋白酶在它们初分泌时都是以无活性的酶原形 式存在，在一定条件下才转化成相应的酶。
除消化道的蛋白酶外，血液中有关凝血和纤维蛋白 溶解的酶类，也都以酶原的形式存在。 酶原激活的生理意义在于避免细胞内产生的蛋白酶 对细胞进行自身消化，并可使酶在特定的部位和环 境中发挥作用，保证体内代谢的正常进行。
2、特点： 共价修饰酶通常有活性与非活性两种形式，两种形式之 间转换的正、逆反应是由不同的酶催化产生。如骨骼肌中 的糖原磷酸化酶有高活性的磷酸化形式与低活性的脱磷酸 化形式两种，从脱磷酸化形式转化成磷酸化形式是由磷酸 化酶b激酶催化，反之，则是有由磷酸化酶磷酸酶催化。 目前已发现有几百种酶被翻译后都需要进行共价修饰， 其中一部分处于分支途径，对其代谢流量起调节作用的关 键酶，属于这种酶促共价修饰系统。由于这种调节的生理 意义广泛，反应灵敏，节约能源，机制多样，在体内显得 十分灵活，加之它们常受激素甚至神经的指令，导致级联 放大反应，所以日益引人注目。
2、正协同效应的别构酶其速度-底物浓度曲线呈S形，即底 物浓度较低时，酶活性的增加缓慢，底物浓度高到一定程度 后，酶活性显著加强，最终达到最大值Vmax。如大肠杆菌的 天冬氨酸转甲酰基酶（ATCase）对底物天冬氨酸的结合表现 为正协同效应。
3、负协同效应的别构酶其速度-底物浓度曲线为类似双曲 线。底物浓度较低时，酶表现出较大活性，但底物浓度明 显增加时，其反应速度无明显变化。如3-磷酸甘油醛脱氢 酶对NAD+的结合为负协同效应，其意义在于无论细胞内酶