第三章植物组织与器官培养介绍
3第三章 植物组织培养简介
的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 的细胞在人工诱导条件下，恢复分生能力， 回复到分生组织状态的过程。 回复到分生组织状态的过程。
3.再分化 redifferentiation〕 3.再分化〔redifferentiation〕:
Folke Skoog(1908- )
1955年，Miller从DNA降解物中分离出6－呋喃 1955年 Miller从DNA降解物中分离出6 降解物中分离出 氨基嘌呤（激动素）， ），发现它诱导芽分化的效率比 氨基嘌呤（激动素），发现它诱导芽分化的效率比 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 腺嘌呤高3万倍。控制器官分化的激素模式变为激动 生长素的比例关系 促进组培的发展。 的比例关系。 素／生长素的比例关系。促进组培的发展。
Gottlieb Haberlandt(1854-1946). He was the first to formulate clearly the principles of plant cell culture.
细胞全能性学说： 细胞全能性学说： 植物体中任何生活细胞都具有该 物种的全部遗传信息， 物种的全部遗传信息，具有相同的形态结构和一定的生理 功能。只要条件合适， 功能。只要条件合适，由一个单细胞就可以发育成为一个 新的个体。 新的个体。 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验，由 该文还报道了几种植物的细胞和组织的培养实验， 于当时的条件所限，都没有成功. 于当时的条件所限，都没有成功
第三章 植物组织培养 (tissue culture) 概述
第一节
植物组织培养的意义
植物组织培养概念(重点 重点) 一、植物组织培养概念 重点 植物组织培养理论基础(难点 难点) 二、植物组织培养理论基础 难点 植物组织培养类型(难点 难点) 三、植物组织培养类型 难点 植物组织培养特点(重点 重点) 四、植物组织培养特点 重点
植物组织培养技术第三章第四章植物器官的培养
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
1、 取材 、
取1-2㎝顶梢 ①直接取材：在生长旺盛、枝 直接取材：在生长旺盛、 条健壮、 条健壮、无病的母株上选生 长不久、杂菌污染少的顶梢 长不久、 （1－2cm）（取前可喷杀菌 cm）（取前可喷杀菌 ）（ 药，可顶芽或侧芽）。 可顶芽或侧芽）。 ②从试管苗获取。 从试管苗获取。
第一节 一、离体根的培养 意义： （一） 意义： ①生理代谢研究的优良实验体系 ②研究器官分化形态建成的良好体系 ③建立快速生长的根无性系 ④进行诱变育种 营养器官的培养
营养器官的培养——根的培养 营养器官的培养——根的培养
（二） 培养方法 1. 培养基选择 White培养基；2/3或1/2 MS 和 B5培养基 培养基； 或 培养基 培养基 注：离体根生长要求 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好， 提供全部必需元素，蔗糖、硝态氮效果好，加入 B1、B6最重要 生长素对离体根影响不一致。 最重要， B1、B6最重要，生长素对离体根影响不一致。培养 温度25 27℃，暗光培养。 25－ 温度25－27℃，暗光培养。
离 体 根
脱分化培养基
愈 伤 组 织
再分化培养基
分 化 芽
再 生 植 株
植物器官的培养
二、茎尖的培养
•1.茎尖培养概念及类型 1.茎尖培养概念及类型 1. •2.茎尖培养方法及步骤 2.茎尖培养方法及步骤 2.
营养器官的培养——茎尖的培养 营养器官的培养——茎尖的培养
（一）茎尖培养概念及类型
茎尖培养： 茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行 无菌培养。 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 茎尖培养根据培养目的和取材大小可分为： 微茎尖培养: 微茎尖培养 带有1-2个叶原基的生长锥, 其长度不超过0.5mm 普通茎尖培养： 普通茎尖培养：较大的茎尖(如几mm到几十mm)、芽尖及侧芽 这里主要讲普通茎尖培养。这种培养技术简单，操作方便， 茎尖容易成活，成苗所需时间短
植物组织培养植物器官以及组织培养
（5）生根培养 刚形成的芽苗往往比较弱小，多数无根，此时可降
低或不加细胞分裂素浓度，提高生长素浓度，促进芽苗 生根，提高其健壮度。 （6）炼苗移栽
选择生长健壮，有3～5条根的生根苗进行炼苗，移 栽到疏松透气的基质中，注意保温、保湿、遮荫。当苗 完全成活后，再移向大田。
（四）果实和种子的灭菌
表皮有茸毛或蜡质，需在灭菌剂中加入几滴土温-80。 果实70%酒精浸泡数秒—0.1-0.2%氯化汞浸泡3-10min， （或1%次氯酸钠浸泡10-20min）—灭菌水冲洗3-5次—无 菌滤纸吸干—分割—接种。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
初代培养物的建立
（一）无菌环境
培养基、接种器械、超净工作台、接种室环境、抗 生素物质（去除侵入组织内部的病菌。见表）
器官发生 体细胞胚胎发生
植物组织培养植物器官以及组织培 养
形态发生和植株再生
器官发生：芽或芽原基起源于培养组织中比较表 层的细胞，即外起源。根原基发生在组织较深处，即 内起源。两者之间一般没有什么联系，呈现单向极性。
胚状体发生：极大多数体细胞胚起源于单细胞， 形成的胚状体具有双极性，在其发育的早期阶段，在 方向相反的两端分化出茎端和根端，其维管组织与母 体植物或外植体的维管组织通常没有联系。胚状体维 管组织呈独立的Y形。
植物组织培养植物器官以及组织培 养
拟定培养方案
外植体预处理
外植体无菌接 种
启动培养
分化出芽、胚 状体或原球茎
继代增殖培养
生根培养
炼苗移栽
成活供生产使 用
培养基配制灭菌
植物组织培养的一般程序
植物组织培养植物器官以及组织培 养
第一节 植物器官和组织培养的基本程序
植物的器官和组织培养
二、植物根段培养
植物根段培养是指以植物的根切段为外 植体进行离体培养，再生完整植株的过程 。是研究根系生理代谢、器官分化及形态 建成的良好实验体系。培养方法与叶片培 养相似。
培养过程包括愈伤组织诱导、不定芽分 化、无菌苗的增殖与生根等。
大蒜根尖培养及植株再生
三、植物茎段培养
植物茎段培养是指对植物的带有定芽或 不定芽的外植体进行离体培养，再生完 整植株的过程。
利用灭菌剂对 外植体灭菌
无菌水冲洗 3-5次
1、茎尖、茎段、叶片的灭菌 2、根、块茎、鳞茎的灭菌 3、花蕾的灭菌 4、果实、种子的灭菌
二、初代培养物的建立
（一）无菌环境 （二）规范操作 （三）条件合适
三、形态发生和植株再生
外植体 愈伤组织
体胚途径
植株
具根茎的两极器官
器官化途径
先茎后根
单极器官
先根后茎
对培养的要求：成熟种子萌发培养所用培养基成 分简单，不需生长调节剂；未成熟种子萌发培养 则需要添加一定的营养成分和生长调节剂。若需 要其形成愈伤组织，需要相应的生长调节剂及营 养物质。
第四节 植物组织培养和脱毒苗的生产
一、植物分生组织(meristem culture)培养：
定义：是指对植物的分生组织进行离体培养 的技术，包括植物根尖、茎尖等顶端分生组 织和形成层组织的培养。其中茎尖培养广泛 应用于植物再生和脱病毒研究。
植物茎尖培养过程
➢茎尖离体培养可能出现的培养反应：
生长太慢 生长过旺，愈伤增多 生长正常
三、利用茎尖培养生产脱毒苗
脱毒苗生产的意义 茎尖脱毒机理 基本技术规程 影响脱毒效果的因素
1、脱毒苗生产的意义：
目前受病毒危害严重影响生产的有：
3.植物细胞培养（植物组织培养）
3.植物细胞培养（植物组织培养）第三章植物细胞培养植物细胞培养：指对从植物器官或由愈伤组织上分离的单细胞（或⼩细胞团）进⾏培养，形成单细胞⽆性系或再⽣植株的技术。
Haberlandt（1902）⾸次尝试分离和培养植物叶⽚单细胞。
细胞培养的意义有利于进⾏细胞⽣理代谢以及各种不同物质对细胞代谢影响的研究。
进⾏细胞培养，通过单细胞的克隆化，即称为“细胞株”（cell line），可以把微⽣物遗传技术⽤于⾼等植物以进⾏农作物的改良。
细胞培养的增殖速度快，适合⼤规模悬浮培养，⽣产⼀些特有的产物，如许多种植物的次⽣代谢产物，包括各种药材的有效成分等，⽤于医药业、酶⼯业及天然⾊素⼯业，这是植物产品⼯业化⽣产的新途径。
由于植物组织培养中细胞之间在遗传和⽣理⽣化上会出现种种变异，这些细胞形成的植株也都表现出⼀定的差异。
这种差异反映在它们的植株的形态、产量、品质、抗病⾍和抗逆性等⽅⾯。
所以由单细胞培养获得的单细胞⽆性繁殖系，并对不同的细胞进⾏研究，在理论上和实践上都有很重要的意义。
细胞培养就是从⾼等植物的某个特定的器官或组织中取得单个细胞进⾏培养，并诱导其分裂增殖，由细胞分裂形成细胞团，再通过细胞分化形成芽根等器官或胚状体，长成完整植株。
第⼀节植物细胞培养⼀. 单细胞培养(⼀)单细胞分离1.机械法2.酶解法3.从愈伤组织中分离(⼆)单细胞的培养⽅法1、平板培养（细胞的⽣长周期）2、看护培养3、微室培养 4. 条件化培养⼆. 细胞悬浮培养（⼀）悬浮培养的⽅法1、分批培养（细胞的⽣长周期）2、半连续培养3、连续培养——封闭型、开放型（化学、浊度恒定式）4、固定化培养（⼆）培养细胞的同步化1. 化学⽅法(饥饿法、抑制法、有丝分裂抑制法）2. 物理⽅法（分选、低温）（三）培养基振荡⼀、单细胞培养（⼀）单细胞的分离1.机械法: Ball(1965)⾸次由花⽣成熟叶⽚利⽤机械的⽅法使叶⾁细胞得到分离的技术。
⑴⼑⽚刮: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠)→撕去下表⽪(露出叶⾁细胞) →⽤解剖⼑刮下细胞→单细胞悬浮培养⑵研磨离⼼法: 取下叶⽚→叶⽚消毒(75%酒精或7%次氯酸钠) →研磨匀浆(10g叶⽚+40ml研磨介质)→匀浆过滤(细纱布) →离⼼(先低速去碎屑) →游离细胞沉降到底部(净化细胞) →植株培养或悬浮培养研磨介质: 20µmol蔗糖+ 10µmol MgCl2 + 20µmol Tris-HCl (pH7.8)机械法的特点：⑴细胞不受酶的伤害；⑵不发⽣质壁分离。
细胞工程植物组织与细胞培养
B、植物细胞培养过程
3．3．5 植物细胞培养的应用
3．3．6 原生质体 培养
（技术线 路，以经 济海藻— —红篱为
例）
【习题】
1、名词解释，并简要说明它们间关系： 去分化与再分化
外植体与胚状体 无毒苗与快繁苗 2、简要分析愈伤组织和胚状体在植物细胞全
能性的实现途径中技术关键是什么？
Chapter3、植物组织与细胞培养
3．1 植物细胞工程概述 3．2 植物组织培养 3．3 植物细胞培养
3．1 植物细胞工程概述
3．1．1 植物细胞工程是细胞工程的一个重要分支学科。
3．1．2 植物细胞工程（plant cell engineering）
植物细胞工程（plant cell engineering）：是 在植物细胞全能性的基础上，以植物细胞为 基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖或 人为的精细操作，使细胞的某些生物学特性 按照人们的意愿发生改变，从而改良品种或 创制新种，或加速繁殖植物个体，或获得有 用产物的过程。
体细胞胚的培养：（自旋过滤式反应器）气升式剪 切力小。
3．2．9 存在问题：
一、理论问题：细胞全能性与激素作用机制； 二、技术问题：效率偏低、外植体诱导时间
长、培养基配方、继代培养植株变异、 新型反应器工艺设备改进； 三、应用范围：工厂化、成本高、资金多。
3．3 植物细胞培养 3．3．1 定义： 植物细胞培养：是指在离体条件下，将愈 伤组织或其他易分散的组织置于液体培养 基中进行振荡培养，得到悬浮细胞，再通 过继代培养使细胞增殖，从而获得大量细 胞群体的技术。它是在组培基础上发展起 来的。
七、植物组织器官的生物反应器培养
——是指那些用来生产植物次生代谢产物的组织 器官（生长快，生理、生化特征稳定）培养物的大规 模工厂化批量生产过程。
植物组织与细胞培养课件
第三十四页，共三十四页。
培养
第十九页，共三十四页。
幼胚培养
(péiyǎng)
影响幼胚培养成功的因素 培养基：无机盐、碳水化合物、激素等
环境(huánjìng)条件(温度：多数为25-30℃，因植物种类有所
差别。光照：一般认为黑暗或弱光条件较为合适。)
提高幼胚的成活率，可采用胚乳看护培养
第二十页，共三十四页。
胚龄与胚性发育(fāyù)的关系
胚乳培养过程 含胚乳的果实或种子→表面消毒(xiāo dú)→无菌 条件下胚乳的剥离→接种培养基培养。 培养室温度25-27℃，黑暗或弱光下进行。
第二十四页，共三十四页。
胚乳培养的器官发生(fāshēng)
愈伤组织形成、器官发生 （1）愈伤组织的诱导 （2）愈伤组织的再分化 （3）胚乳苗的生根培养
经过自身的代谢作用合成其生长必需的物质，在营养 上已可以完全独立。
第十四页，共三十四页。
依据所剥离胚的发育时期(shíqī)不同：
培养类型
幼胚培养 (immature embryo)
成熟胚培养 (mature embryo)
子叶形成(xíngchéng) 之前
子叶(zǐyè)形成之后
第十五页，共三十四页。
受精胚珠的培养
未受精胚珠的培养
植物胚珠(pēi zhū)结构图示
第二十九页，共三十四页。
胚珠 培养 (pēi zhū)
胚珠培养的方法 培养受精胚珠，摘取授粉时间合适的子房(zǐfáng)，如培养 未受精胚珠，则在授粉前摘取子房(zǐfáng)→表面灭菌→剖 开子房壁，取出胚珠或带胚珠的胎座接种培养。
胚培养：指在无菌条件(tiáojiàn)下将胚从胚珠或种子中
植物组织培养技术
植物组织培养技术第一章绪论第二章植物组织培养实验室组成、仪器设备及无菌操作技术第三章植物组织培养基本原理第四章器官培养技术第五章植物胚胎培养第六章花粉及花药培养第七章细胞及原生质体培养第八章组培培养技术在中药学上的应用第一章绪论一、植物组织培养的概念1. 概念植物组织培养（Plant tissue culture）广义上是指无菌条件下，在特定的培养基上对离体的植物器官、组织、细胞和原生质体甚至包括完整植株进行培养的技术。
2.主要特征（1）在培养容器中进行；（2）无菌培养环境，排除了微生物如真菌、细菌以及害虫等的侵入；（3）各种环境因子如营养因子、激素因子以及光照、温度等物理因子处于人工控制之下，并可达到最适条件。
（4）通常打破了正常的植物发育过程和格局；（5）随着单细胞和原生质体培养技术的发展，对植物显微结构进行操作成为可能。
二、植物组织培养类型：根据不同分类的依据可以分为不同类型。
1、根据培养材料不同分为：（1）完整植株培养（Plant Culture）：对幼苗和较大植株等的培养。
（2）胚胎培养（Embryo Culture）：包括成熟胚、幼胚、子房、胚珠等的培养。
（3）器官培养（Organ Culture）：包括离体根、茎、叶、果实、种子、花器官的培养。
（4）组织培养（Tissue Culture）：如分生组织、薄壁组织、输导组织培养。
（5）细胞培养（Cell Culture）：指对单细胞或较小的细胞团进行培养。
（6）原生质体培养（Protoplast Culture）：指对去掉细胞壁后所获得的原生质体进行培养。
2、根据再生途径分为：（1）器官发生途径（Organogenesis）：直接器官发生途径：植物器官可以直接由外植体上诱导。
如茎尖培养。
间接器官发生途径：成熟细胞经过脱分化（dedifferentiation）及再分化（redifferentiation）过程而形成新的组织和器官的过程。
植物器官和组织培养的基本程序
植物器官和组织培养的基本程序离体的植物器官和组织在人工培养条件下，通过不同的器官发生途径，形成体细胞胚或茎芽，进一步再生成完整植株。
因此，植物器官和组织培养的基本程序包括：无菌外植体的获得、初代培养物的建立、形态发生、植株再生以及培养产物的观察记载。
一、无菌外植体的获得从自然界和室内采集的植物器官和组织材料携带有各种微生物，这些污染源一旦进入培养容器中，造成培养基和培养材料污染，实验无法进行。
所以，污染是组织培养的一大障碍。
利用各种灭菌剂可以进行外植体的灭菌，但不同植物或同一植物不同器官和组织的带菌程度不同，所用灭菌剂的种类、浓度及灭菌方法也不尽相同。
(一)茎尖、茎段、叶片的灭菌灭菌前外植体用清水冲洗，茸毛较多的外植体用皂液洗涤后再用清水冲洗、用吸水纸吸干表面水分；将外植体浸泡在0.1%～0.2%的氯化汞溶液中2～10min，或先在70%～75%酒精中浸数秒，然后在10%次氯酸钙溶液中浸泡10～20min。
或先在70%～75%酒精中浸泡数秒，再在2%次氯酸钠溶液中浸泡15～30min进行灭菌；灭菌后倒掉灭菌液，无菌水冲洗外植体3～5次，置外植体于无菌滤纸上吸干表面水分，适当分割后接种。
(二)根、块茎、鳞茎的灭菌这类材料生长在土中，灭菌较困难，且挖取时易受损伤。
所以灭菌前应仔细清洗，对凹凸不平及鳞片缝隙处，需用软刷清洗，并切除损伤部位。
灭菌时应增加灭菌时间或增大灭菌剂浓度，如将外植体浸泡在0.1%～0.2%氯化汞溶液中5～12min，或在70%～75%酒精中浸数秒，然后用6%～10%次氯酸钠溶液浸5～20min进行灭菌。
灭菌后的操作步骤同上。
(三)花蕾的灭菌未开放花蕾中的花药为花被包裹，处于无菌状态，所以采摘后可直接灭菌。
灭菌时先在70%～75%酒精中浸蘸10～30s，然后在0.1%氯化汞溶液中浸泡3～10min或在1%次氯酸钠溶液中浸泡10～20min。
灭菌后的处理同上。
(四)果实、种子的灭菌这类材料有的表皮具有茸毛或蜡质。
植物组织培养(全)
胚培养是器官培养的一种。选用的外植体是成熟或未成熟的胚进行离体无菌培养。其具体方法是将取出放在液体或固体培养基上培养，由于胚包含在胚珠和子房里，因而进行胚胎培养时，常常是将胚珠和子房放在培养基上培养。
胚培养用途：1.拯救胚2.研究胚的发育营养研究3.一些特殊的领域的研究。
(4)细胞和原生质体培养
二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。
全能性体现的两个过程
一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历两个过程，即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。
再分化的过程有两种方式：
一是器官发生方式 二是胚胎发生方式
2.激素（植物生长调节剂）调控
后来证明，激素可调控器官发生的概念对于多数物种都可适用，只是由于在不同组织中这些激素的内生水平不同，因而对于某一具体的形态发生过程来说，它们所要求的外源激素的水平也会有所不同。
⑤1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的情况下处于休眠状态的腋芽的生长。
当把茎尖接种在含有细胞分裂素的培养基上以后，将可使侧芽解除休眠状态，而且，能够从顶端优势下解脱出来的不只是那些既存于原来茎尖上的腋芽，此外，还有由原来的茎尖在培养中长成的侧枝上的腋芽，结果就会形成一个郁郁葱葱的结构，里面包含了数目很多的小枝条，其中每个小枝条又可取出来重复上述过程，于是在相当短的时间内，就可以得到成千上万的小枝条。当把这些小枝条转够到另外一种培养基上诱导生根以后，即可移植于土壤中。
奠基阶段（从20世纪30年代中至20世纪50年代末）
30年代中期，植物组织培养领域两个重要的发现，其一是认识了B族维生素对植物生长的重要意义；二是发现了生长素--一种天然的生长调节物质。
第三章 植物组织培养的培养条件
第三章植物组织培养的培养条件第一节植物组织培养的条件一、环境条件（一）温度培养温度对植物细胞生长及二次代谢产物生成有重要影响。
通常，植物细胞培养采用25℃。
1．离体培养条件下的温度控制原则温度控制主要依据植物种的起源和生态类型来确定。
将植物分为喜温性植物和冷凉性植物两大类。
喜温性植物培养温度一般控制在26~28℃比较适宜。
冷凉性植物通常培养温度控制在18~22℃或＜25℃较为适宜。
一般温度低于15℃，高于35℃对植物细胞的分裂、分化不利。
在细胞脱分化阶段（诱导期）和愈伤组织增殖期（分裂期），温度要求高一些，而在器官发生阶段（分化期）要求低些。
2．培养周期中的昼夜温差培养过程中采用恒温培养好，还是变温培养好呢？目前多数植物种，从器官到细胞培养均采用恒温培养。
国内有关小麦、水稻花药培养温度试验报道认为：在诱导花药形成愈伤组织时，昼夜恒温较好，在器官分化时，昼夜具有一定温差比较好，分化出的小植株也健壮。
3．低温预处理有报道，花药离体培养前，实行低温预处理，可以促进植物细胞脱分化和再分化，已成为一项有效的诱导措施。
特别在花药和花粉培养方面的研究报道相当多。
（二）光照光对植物有着特殊的作用。
光照射条件不仅通过光照周期、光的质量(即种类、波长)而且通过光照量(光强度)的调节来影响植物细胞的生理特性和培养特性。
研究表明，光调节着细胞中的关键酶的活性，有时光能大大促进代谢产物的生成，有时却起着阻害作用。
1．光照强度：离体培养条件下一般为1000~4000lx（勒克斯），离体培养中通常难以达到4000lx，一般光量在2000~3000 lx。
2．光质：不同的光质对植物的光合作用、色素形成、向光性、形态建成的诱导等影响是不同。
橙红光和蓝紫光是生理有效辐射，绿光很少被叶绿素吸收，属于生理无效辐射。
据报道，芽分化的有效光谱成分为蓝紫光，波长为419~540nm，波长为660nm的红光对芽分化无效。
根分化则和芽分化相反，根分化受红光600~680nm所刺激，而蓝光则无效。
植物组织培养的基本原理
脱分化（Dedifferentiation）：已分化的植物细胞 要表达全能性,必需先脱分化,使细胞恢复到胚性阶段。 生长素尤其是2,4-Ｄ对脱分化具有重要作用。
2,4-Ｄ浓度高时,诱发不均等分裂；而浓度低时,只 诱发均等分裂。一旦发生不均等分裂,细胞就对生长素 失去敏感性,在无生长素的条件下能自发形成体细胞胚。
全能相对性的启发在离体培养的选材上，尽可能
选取分生组织的部位。
将实验目的与外植体生长发育状态(“决定”状态)
相结合，创造良好的离体条件。
合理使用生长调节物质。
二 、细胞分化（Cell differentiation）
1、概念
（1） 分化：是指植物体各个部分出现异质性的现象，
包括细胞分化、组织分化和器官分化。 （2）细胞分化：指导致细胞形成不同结构，引起功能 改变或潜在的发育方式改变的过程。 细胞分化是组织分化和器官分化的基础，是植株离 体再生的基础。
（3）器官水平再分化 ： 依起源不同，分器官型（Organ ）和器官发生型 （Organogenesis ）。
– 器官型：直接由外植体细胞形成器官原基，继而发育成
器官；
– 器官发生型：外植体先形成愈伤组织，再由愈伤组织产
生不同的器官原基。
（4） 植株再生：根和茎（包括其变态器官）或芽器官 的发生可使植株重建。
器官发生再生植株的方式大致有：
A 先形成芽，芽的基部后产生根； B 先形成根，根上再出芽；
C 愈伤组织的不同部位形成芽和根，然后形成微管束 组织把两者结合起来.
一些变态茎、叶器官，离体培养易于形成相应的变
态器官。
2、影响细胞再分化因素：
从理论上讲，在离体培养条件下经过再分化可获 得各种类型的细胞、组织、器官以及再生植株。但是 目前，还不能使所有植物的活细胞都再生植株。主要 原因是： （1）不同植物种类再分化的能力差异较大；
植物组织培养与器官培养
2019/10/6
29
2019/10/6
30
培养基分类
• 根据培养基无机盐含量的差异将其分为以 下4类：
①高无机盐含量培养基（植物器官、花药、 细胞及原生质体培养）；-MS
②较高硝酸盐含量培养基（木本、十字花科 和单子叶植物的组织和花药培养）；-B5
材料灭菌 培养基筛选
器
官 发
增殖、分化
培养基中激素配比
生
型
激素种类及浓度
基 本
植株再生及鉴定 基本培养基组成
程
渗透压
序
炼苗和移植
逐步过渡
2019/10/6
7
胚状体发生型(embryogenesis type)：
• 指植物器官、组织和细胞外植体经培养脱 分化形成胚状体再成苗的方式。
• 技术关键：提高不同外植体胚状体发生及 萌发率和提高胚状体同步化率。
FLash
• 技术关键：打破顶端优势， 促使腋芽增殖并促其生根。
• 特点：繁殖率高、保持物种 的遗传稳定性，多用于林木
的繁殖。
器官型(organ type)
• 指直接从茎、叶、鳞片等外植体上诱导不 定芽或带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球 茎、小块茎）产生再生成植株的方式。
• 技术关键：对培养基要求高，控制好激素 浓度，避免愈伤组织发生。
来自茎尖或茎段
培养物的不定芽。
• 通常玻璃化苗
恢复正常的比例很低，
在继代培养中仍然
形成玻201璃9/10化/6 苗。
32
玻璃化的解决方法
1. 增加培养基中的溶质水平，以降低培养基的 水势；
植物组织培养资料
一、名词解释。
1、植物组织培养：植物的离体器官、组织或细胞在人工制备的培养基上进行无菌培养，并在人工控制的环境条件下，使其发育成完整植株的科学技术。
2、脱分化：指失去分裂能力的细胞回复到分生性状态并进行分裂，形成无分化的细胞即愈伤组织的现象。
3、再分化：愈伤组织形成不定芽或不定根或胚状体。
4、外植体：植物组织培养过程中从活体植株上切去下来的用于离体培养的一切材料。
5、愈伤组织：原本指植物在受伤后于其伤口表面形成的一团薄壁细胞。
在组培中，则指人工培养基上由外植体形成的一团无序生长的薄壁细胞。
6、器官发生：胚胎时期由胚层器官原基发育成器官的过程。
包括细胞分化和器官形成。
7、胚状体发生：在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成的与合子胚相类似的结构。
可进一步发育成植株。
8、细胞全能性：指植物的每一个细胞都携带有一完整的基因组，并具有发育成完整植株的潜在能力。
9、细胞分化：一个尚未特化的细胞发育出特征性结构和功能的过程。
10、极性：细胞内的一端与另一端在形态结构和生理生化上的差异。
11、试管苗：通过组织培养产生的植株。
12、看护培养：是指用一块活跃生长的愈伤组织来看护单个细胞，使其持续分裂和增殖的一种培养方法。
这块愈伤组织被称为看护组织。
13、固相化培养：将细胞或原生质体固着在琼脂糖、藻（月元）酸盐或多聚赖氨酸中，然后将他们放入液体培养基中震荡培养。
这种培养方法既利用了振荡培养室营养物质和气体易于交换的优点，有利用了固相化使细胞免受振荡时剪切力的作用。
14、悬浮细胞培养：将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增值的技术。
适用于大规模的培养，使细胞工程的基本平台。
15、离体授粉：将未授粉的胚珠或子房从母体上分离下来,进行无菌培养,并以一定的方式授以无菌花粉,使之在试管内实现受精的技术,又称为离体受精或试管受精。
16、器官培养：指植物的根、茎、叶、花器和幼小果实的无菌培养。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
（3）赤霉素
细胞工程
（1）生长素类
概念：指能引起完整组织中的细胞扩展的化合物，主 要生理作用是促进细胞的纵向伸长，生长素包括内源
的（存在于植物体内的）和人工合成的。
组培中的作用：主要被用于诱导愈伤组织形成，促进
细胞伸长生长和促进生根。
用量：mg/L，mg/L=ppm
细胞工程
8. 水
作用：是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过 程的介质和溶媒。 注意：用蒸馏水，最好是重蒸馏水；以保持培养基成 分的精确性。 配制培养基母液时要用蒸馏水，大规模生产时可 用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分 的变化引起不良果。
细胞工程
二、配制培养基母液
1. 母液的定义 将所用培养基配方的化学成分按一定的比例配成浓缩液。 2. 母液的种类 （1）大量元素母液
分化。
用量：mg/L级 用法：易溶于水、乙醇，多用95％乙醇溶解储存。
细胞工程
5.另外：
脱落酸（ABA）→因物种不同，能促进或抑制愈伤组织
生长；
乙烯→有催熟作用，大量积累易影响生长、分化，导致
培养物早衰、落叶和玻璃化苗，应尽量排除之；
细胞工程
6. 抗生物质
种类：青霉素、链霉素、利福平、卡那霉素、庆大霉 素等。 浓度：5-20mg/L。
作用：可防止菌类污染，主要抑制内生菌。 多数需过滤灭菌
细胞工程
7. 活性炭
目的：利用其吸附能力，减少一些有毒物质的影响。
如：用于防止酚类物质污染引起组织褐化死亡。也能使培养
基变黑，有利于某些植物生根。
使用浓度：1- 5g/L。 它的颗粒大小决定着吸附能力：粒度越小，吸附能力越大； 温度低吸附力强，温度高吸附力减弱，甚至不吸附。
细胞工程
• 1952年：Morel和Miller通过茎尖培养获得脱毒大丽花植株 • 1953年：Muir使单细胞培养获得成功 • 1956年：Miller等人发现了细胞分裂素-激动素 • 1957年：Skoog和Miller提出植物生长调节剂控制器官形成的 概念。
• 1958年：Steward等将胡萝卜根韧皮部的一些细胞进行培养，
细胞工程
2. 奠基阶段
• 1934年：White进行番茄根培养建立了第一个活跃生长的无性
繁殖系
• 1937年：White建立了第一个由已知化合物组成的综合培养基 • 1943年：White出版了《植物组织培养手册》 • 1948年：Skoog和崔徵（zhēng）发现腺嘌呤或腺苷可以解除 IAA对芽形成的抑制
细胞分化而最终发育成完整的新植株，证实了Haberlandt的细 胞全能性。
细胞工程
3. 迅速发展阶段
• 1960年：Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得
成功。
• 1960年：Morel利用茎尖培养获得脱毒兰花,形成了”兰花产业 ” • 1962年：Murashibe和Skoog发表了MS培养基 • 1964年：Guha等在叶曼陀罗上由花粉诱导得到单倍体植株。 • 1971年：Takebe等在烟草上首次由原生质体获得了再生植株。
细胞工程
细 胞 工 程
大理大学农生学院细胞与分子生物学教研室
E-mail:zhangwu413023@
2016.10.25
细胞工程
第三章 植物组织和器官培养
一、 植物组织培养
二、 植物胚胎培养
三、 毛状根培养
细胞工程
第一节 植物组织培养
植物组织培养指对植物组织（分生组织、表皮组织、
织所需的含量不一致，单独使用易导致培养基酸碱性
漂移，两者要保持适当比例。
细胞工程
（2）微量元素：指小于0.5mmol／L的元素。
铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、锰（Mn）、钼（Mo）、 硼（B）、碘（I）、钴（Co）、氯（Cl）、钠（Na）等 Fe：易形成絮状沉淀，常以Fe·EDTA 的形式提供。 FeSO4·7H2O＋Na2·EDTA 两类元素虽然在培养基中含量差距很大， 但都是不可少的营养成份。含量不足就造成缺素症。
细胞工程
用量：mg/L级 用法：溶于0.5mol/L 稀HCl或稀NaOH，通常多用NaOH 助溶。 细胞分裂素常用种类： 6-BA(6-苄基腺嘌呤)
Kt (kinetin 激动素)
Zt (zeatin 玉米素)
细胞工程
பைடு நூலகம்
细胞分裂素作用强弱顺序
Zt (玉米素) Kt ( 激动素)
6-BA(6-苄基腺嘌呤)
（2）微量元素母液
（3）有机物母液
（4）铁盐母液
（5）激素母液
细胞工程
3. 母液的配制
（1）大量元素 原则上可以混在一起，但硫酸镁与氯化钙要单独配制，因
为高浓度的Ca2+与Mg2+与磷酸盐混合，会产生不溶性沉淀。
配制方法：用天平称取药品， 分别加入600-700ml蒸馏水中，再用 磁力搅拌器搅拌，待第一种药品溶
细胞工程
植物组培发展简史
• 植物组织培养技术的整个历史可以追溯到19世纪末和20世纪
初。它的发展过程大致可以分为三个阶段： 1. 探索阶段 • 1839年：Schleidon和Schwann提出细胞学说 • 1902年：Haberlandt提出植物细胞全能学说 • 1904年：Hanning进行胚离体培养获得成功 • 1922年：Kotte和Robbins进行根尖和茎尖培养形成了缺绿的叶 和根
弱
（2）细胞分裂素类
细胞工程
概念：是一类具有促进细胞分裂和其他生理功能的物 质总称。都为腺嘌呤的衍生物。在高等植物中普遍存 在，特别是茎尖、根尖、未成熟的种子和生长着的果 实等进行着细胞分裂的器官。 细胞分裂素作用：
①促进细胞分裂与扩大。
②诱导芽分化，促进侧芽萌发，使茎增粗，抑制茎伸
长。
③抑制根的分化。
用法：溶于95％乙醇或0.1mol/L NaOH
细胞工程
生长素种类：
吲哚乙酸：IAA 萘乙酸：NAA 吲哚丁酸：IBA 2,4-二氯苯氧乙酸：2,4—D 另外：吲哚丙酸(IPA)、萘氧乙酸(NOA)等
• NAA、IBA→生根培养
• 2,4-D →愈伤组织诱导与增殖
细胞工程
生长素作用强弱顺序：
2,4—D(2,4—二氯苯氧乙酸) NAA(萘乙酸) IBA(吲哚丁酸) IAA(吲哚乙酸) 强
细胞工程
Three ways of organogenesis
细胞工程
②体细胞胚发生途径 离体培养条件下没有经过受精过 程，但经过了胚胎发育过程中所形成胚的类似物，统 称为体细胞胚或胚状体。
细胞工程
体细胞胚的发生途径 1.从器官外植体直接发生 2.悬浮培养细胞发生（成簇成团的体积小而细胞质致 密的细胞，这类细胞具有成胚能力，因而，把这类 细胞团又称为胚性细胞团） 3.经胚性愈伤组织发生 4.单细胞发生途径 5.原生质体发生途径
细胞工程
（2）维生素(vitamin)
在细胞里主要是以各种辅酶的形式参与多种代谢活动对离体 组织的生长具有明显的促进作用，主要为B族维生素 。 种类： VBl(盐酸硫胺素)、VB3(泛酸)、VB6(盐酸吡哆醇)、 Vpp(烟酸)、Vc(抗坏血酸）、 VH(生物素)、 VB11(叶酸)、 VB12(钴胺素)等。
细胞工程
植物组织的培养基及其配制
一 培养基的成分
二
三 四
配制培养基母液
配制培养基并灭菌 常用培养基的种类及其特点
一、培养基成分
大量元素 1. 无机营养： 微量元素 铁盐
氨基酸 有机附加物 维生素 2. 有机营养成分： 肌醇 糖类 生长素 3. 植物生长调节物质： 细胞分裂素 赤霉素等
细胞工程
细胞工程
植物组织培养再生植株的两大途径：
①器官发生途径；②体细胞胚发生途径
细胞工程
①器官发生途径：离体培养条件下的组织或细胞团（愈 伤组织）分化形成不定根、不定芽等器官的过程。在自 然界中，许多植物的无性繁殖（如插条，嫁接等）都属 于器官发生途径。
细胞工程
• 愈伤组织：脱分化后的细胞经过细胞分裂产生无特
强
弱
细胞工程
（3）赤霉素
GA3（赤霉素）：最初从赤霉菌中提取到，能够引起水稻等 植株徒长。在组织培养中有时使用，如用于匍匐茎的诱导。 作用：通过调节生长素的含量实现促进细胞伸长的。促进幼 芽伸长生长，促进不定胚发育成小植株打破休眠。多用GA3。 赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响：当生长 素/赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部
4. 植物生长调节物质
植物生长调节物质是一些对植物生长发育及生理活动有 特殊作用的生理活性物质。 这类物质极少量存在就对植物生命活动起到调节作用， 有些可以刺激植物生长，而有些抑制植物生长。 在组织培养中，植物生长调节物质对愈伤组织的诱导、
器官分化的植株再生具有重要的作用。
细胞工程
植物生长调节物质主要包括：
细胞工程
（4）氨基酸
作用：蛋白质的组成部分，也是一种有机氮化合物，是很 好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。
种类：最常用的是甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷
酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等半胱氨酸及多种氨基 酸的混合物（水解酪蛋白、水解乳蛋白）等。 使用浓度：为10-200mg／L。
细胞工程
使用浓度：
一般用量为0.1-1.0mg／L。Vc具有很强的还原能力，常用于防
止组织褐变。
细胞工程
（3）肌醇
又叫环己六醇，在糖类的相互转化中起 重要作用。 使用浓度：一般为lOOmg／L。
作用：适当使用肌醇，能促进愈伤组织
的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和
细胞的繁殖、分化有促进作用，对细胞壁
的形成也有作用。