真核基因组DNA提取

察到DNA片段在凝胶上的位置（荧光条带），
也可在经凝胶成像系统中直接拍照。
琼脂糖凝胶制备及电泳
凝胶制备 倒胶
点样 电泳 紫外灯下观察
1、凝胶准备（0.8%）:用1×TAE配制1％琼脂糖凝胶 。 ① 称0.8 g琼脂糖置三角瓶中，加100 mL 1×TAE ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖 ③ 熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃，加入荧光染 料 2μL，并轻轻混匀。 2、倒胶： ① 将冷却60℃的凝胶缓慢倒入制胶模具中，在胶一 端插上梳子。 ②室温下静置20 min，凝胶凝固。 ③拨出梳子，将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使 样品孔位于电场负极。
核酸酶的抑制和抑制剂
RNase抑制
①操作要带手套。 ②所有器皿要严格消毒， ③试剂处理 ④低温操作 ⑤在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。
核酸制备中常用的去垢剂
用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂， 去垢剂的作用： 1．溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2．溶解核糖体上面的蛋白质，使其解聚，将核酸释 放出来；
作用。
如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC
核酸提取的一般过程
1）破碎细胞（防止核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：捣碎器破碎、液氮研磨。
酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，
冰冻法：反复冻融或液氮冻后组织捣碎。
动物：液氮处理后用匀浆器破碎。
细胞器DNA：首先纯化细胞器。 以上处理时均要同时加入核酸酶抑制剂
2.
对 策
3.
4. 5.
6.
尽量取新鲜材料，低温保存材料避 免反复冻融 液氮研磨或匀浆组织后，应在解冻 前加入裂解缓冲液 在提取内源核酸酶含量丰富的材料 的DNA时，可增加裂解液中螯合剂 的含量 细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔 所有试剂用无菌水配制，耗材经高 温灭菌 将DNA分装保存于缓冲液中，避免 反复冻融
3、点样： ①向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，让液面 高于胶面1mm。 ② 样品准备：吸取5 μL已提取的基因组DNA点 在点样纸上，加入1 μL 6×上样缓冲液，用移液 器轻轻混匀。
I.材料准备
破碎细胞
II.破碎细胞或包膜－内容物释放
提取
III.核酸分离、纯化
IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质
纯化
V.核酸溶解在适量缓冲液或水中
核酸制备的一般方法和原理

核酸酶的抑制和抑制剂
降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶 活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有 利，当然，几个条件并用更好。
• •
TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase pH值为8.0，可防止DNA发生酸解
DNA提取常见问题
问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应。
原因
1.
A260/280<1.8
1.
DNA中含有蛋白、 多糖、多酚类杂质 DNA在溶解前，有 酒精残留，酒精抑 制后续酶解反应 DNA中残留有金属 离子
采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相 应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动 作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间
注意事项——核酸沉淀、溶解
当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更
充分 沉淀后应用70％的乙醇洗涤，以除去盐离子等 晾干DNA，让乙醇充分挥发 若长期储存建议使用TE缓冲液溶解
注意事项——细胞裂解
材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯 度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： • 植物材料－－液氮研磨 • 动物组织－－匀浆或液氮研磨 • 组培细胞－－蛋白酶K • 细菌－－溶菌酶破壁 • 酵母－－破壁酶或玻璃珠
高温温浴时，定时轻柔振荡
注意事项—核酸分离纯化
Wash buffer A（
含60%的乙醇）
Wash buffer B（
含80%的乙醇）
主要去除盐等杂 质
再次12,000 rpm离心2 min，将离心柱置于新的 离心管中，并打开离心柱盖，于室温或37 ℃恒 温箱放置5~10min，直至无明显乙醇味
3. 洗脱DNA
在硅基质膜中央加入50 μL Elution Buffer（EB）
纯度的检测
•DNA纯品的OD260/OD280 约为1.8。 OD260/OD280＞1.9说明含有RNA污染； OD260/OD280＜1.6 说明有残余的蛋白质、酚等 存在。
•OD230/OD260的比值应在0.4~0.5之间，若比值较高 说明有残余的盐存在。
•有些分光光度计则显示OD260/OD230，其比值应在 2~2.5之间，偏小则说明有残余盐剩余。
琼脂糖凝胶电泳法 —分离鉴定核酸的常规方法
• 用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。
• 琼脂糖（Agarose，AG）是琼脂中不带电荷的中 性组成成份（几乎不含硫酸根，主要成分为多 糖），其水溶液可以制成凝胶，具有多孔网状结 构。
•结果观察：
制备凝胶时先加入少量荧光染料，其分子 可插入DNA的碱基之间，可在紫外灯下直接观
实验原理
想要制备基因组DNA，必须破碎细胞膜， 去除蛋白质、脂类和糖类等生物大分子且避 免被细胞内核酸酶降解即保证DNA的完整性。
• 在EDTA（螯合二价阳离子以抑制DNase）存在的情况下， 将分散好的真核生物组织、细胞用蛋白酶K消化真核细胞
或组织并分解蛋白质，
• 用SDS溶解细胞质并使蛋白质变性从而与DNA分子分离， 使DNA分子以可溶形式存在于溶液中。
加入400 μL Lysis Buffer B ，剧烈震荡30 s
沉淀作用，内含有醋酸， 提供低pH环境
离心5 min，将上清转入离 心柱中，静置2 min
上清可能出现少量白色漂浮物， 此为未消化完全的细胞和蛋白质
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2. DNA吸附在硅基质膜上，清洗去除盐等杂质
12,000 rpm离心1 min，弃废液 加入700 μL Wash buffer A， 12,000 rpm离心 1min，弃废液 加入700 μL Wash buffer B， 12,000 rpm离心1min，弃废液 加入500 μL Wash buffer B， 12,000 rpm离心1 min，弃废液
真核基因组 DNA提取
教学内容
• 真核生物基因组的结构及特点、人类基因组计划 • 真核基因组提取的实验原理、操作说明、仪器使用及注 RNA提取方法简介 • 核酸（DNA和RNA）定量及定性方法的介绍
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②其它生物大分子的污染应降低到最低程度； ③排除其它核酸分子的污染。
核酸制备时应注意的事项:
①尽量简化操作步骤，缩短提取过程。 ②减少化学因素对核酸的降解（如过量酸碱） ③减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力（强烈震 荡、渗透压急剧改变、反复冻融）和高温 ④防止核酸的生物降解（核酸酶的预防） 。
核酸制备的步骤：
核酸提取的一般过程
4）核酸样品的保存
核酸保存的主要条件是温度和介质 温度：
4℃ 最佳和最简单
-70℃是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20℃保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用)
10mmol/L Tris-Cl pH8.0
1mmol/L EDTA pH8.0
注意事项——材料准备
最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反 复冻融 提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞 组培细胞培养时间不能过长，否则会造成DNA降解 含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集
对于RNA，因分子较小，不易被机械剪切力拉断 ，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法 抑制RNase更重要。
核酸酶的抑制和抑制剂
DNase抑制
①加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA
或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。
②去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使
DNase失活。
• DNA在高盐低pH的条件下，与硅基质膜特异性结合，在低 盐高pH值条件下，吸附的DNA被洗脱下来。
实验步骤
1. 裂解组织细胞，变性蛋白，沉淀生物大分子
处死小鼠，取肝脏20-50mg，剪碎 ，加入1.5mL离心管内 组织块尽量剪碎， 否则影响裂解及消化
加入600 μL Lysis Buffer A， 振荡混匀
核酸提取的一般过程
2）破碎抽提核酸除去杂质 1．首先使脱氧核糖核蛋白、核糖体、病毒的核蛋 白与其它成分分离 2．使核酸与蛋白质分离 3．除去脂类 4．多糖的除去
核酸提取的一般过程
3）核酸的纯化 根据所需核酸的性质和特点除去其它核 酸污染,并除去提取过程中的系列试剂(盐 、有机溶剂等）杂质，最后得到均一的核 酸样品。
实验目的
• 熟悉真核DNA提取的方法和原理
• 掌握真核生物基因组的结构及特点
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核酸制备的一般原则

分离纯化核酸总的原则：
①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染（蛋白质、脂类、糖、有机溶剂、金属离子、外
源DNA、RNA等）
。

核酸纯化应达到的要求：
①核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金 属离子；
(事先预热55～65 ℃)→置于室温2 min→12,000 rpm离心2 min→所得液体即为基因组DNA溶液。
• Elution Buffer（EB）：主要是TE buffer,提供 高pH值环境，使吸附的DNA被洗脱下来
注意事项
• 材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA 量少，纯度低。 • 由于真核生物基因组较大，操作时应注意 轻柔，最大限度地减少机械和化学作用对 DNA的剪切，从而获得相对完整的DNA。
3．对RNase、DNase有一定的抑制作用。