实验六++植物抗氧化酶活性的测定

抗氧化酶测定实验方法

植物组织中丙二醛（MDA）含量的测定一、原理植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(MDA)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

MDA从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

因此，MDA的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮)，其最大吸收波长在532nm。

但是测定植物组织中MDA时受多种物质的干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在450nm，但532nm处也有吸收。

植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性糖增加，因此测定植物组织中MDA—TBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖的干扰。

低浓度的铁离子能够显著增加TBA与蔗糖或MDA显色反应物在532、450nm处的吸光度值，所以在蔗糖、MDA与TBA显色反应中需一定量的铁离子，通常植物组织中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，加入Fe3+的终浓度为0．5umol·L-1。

二、方法直线回归法MDA与TBA显色反应产物在450nm波长下的吸光度值为零。

不同浓度的蔗糖(0—25mmol·L-1)与TBA显色反应产物在450nm的吸光度值与532nm和600nm处的吸光度值之差成正相关，配制一系列浓度的蔗糖与TBA显色反应后，测定上述三个波长的吸光度值，求其直线方程，可求算糖分在532nm处的吸光度值。

UV-120型紫外可见分光光度计的直线方程为：Y532＝-0．00198十0．088D450 (44—1)D450、D532、D600分别代表450、532和600nm波长下的吸光度值。

研究生植物生理学实验教案

研究生植物生理学实验教案教师：***农学院生物技术系实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD ）、过氧化氢酶（CAT ）、过氧化物酶（POD ）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD ）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（•2O ）的酶，它催化下列反应：2反应产物H 2O 2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD 有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT ）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生•2O ，•2O 可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm 处有最大吸收，而SOD 可清除•2O 从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT 的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx ）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L 甲硫氨酸（Met ）溶液：称取1.939 9g Met 用磷酸缓冲液定容至100ml 。

4．750μmol/L 氮蓝四唑（NBT ）溶液：称取61.33mg NBT 用磷酸缓冲液定容至100ml ，现配先用，避光保存。

植物组织SOD活性测定

植物组织SOD 活性测定一、实验目的1、了解还原法测定抗氧化酶活性的原理与方法。

2、熟悉植物叶片ROS 清除机制。

二、实验原理植物在受到光、温度、干旱、盐、碱等胁迫时会产生活性氧和自由基，而活性氧和自由基会抑制植物生长、损伤细胞结构和功能、使膜脂过氧化、破坏生物大分子的结构功能等。

植物本身也会抵抗这种逆境，其自身的酶系统和非酶系统会产生相应的物质以清除活性氧和自由基，酶系统：超氧化物歧化酶（SOD ），超氧化物酶（POD ），过氧化氢酶（CAT ），抗坏血酸过氧化物酶（APX ）；非酶系统：维生素系列（Vce ），谷胱甘肽（GSH ）。

核黄素在照光条件下会将氧气还原为超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基与NBT 作用会产生蓝色的甲䐶，而SOD 会抑制超氧阴离子自由基与NBT 的反应。

三、材料未处理的小麦叶片；0℃处理小麦叶片3-5min 。

四、试验步骤1、酶液提取：称量小麦叶片（ck 、0℃）各0.5g ，预冷研钵，加2ml 预冷提取介质（磷酸缓冲液），冰态研匀浆，介质冲洗研钵2-3次，定容10ml 。

取5ml ，两管平衡（0.01g ），对角线放置，4℃离心10min ，取上清液（粗酶液）。

2、显色反应取4支专用试管，按下表加入试剂 1（As1） 2（As2） 3（照光） 4（不照光，调零）buffer1.51.51.51.5OH O H O O H O H O H OH O H O O POD CAT SOD222222222222−−→←+−−→−→→→•−−−→−•-met 0.3 0.3 0.3 0.3 NBT 0.3 0.3 0.3 0.3 EDTA-Na 2 0.3 0.3 0.3 0.3 20uml 核黄素 0.3 0.3 0.3 0.3 粗酶液 0.1 0.1 0 0 ddH 2O0.50.50.60.6混匀后4号罩黑布，其它各管在4000lux 光下反应20min （25-30℃）根据酶活调整反应时间，反应结束后遮黑布终止反应，4号作空白调零，560nm 测吸光值。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶活性测定方法抗氧化酶是一类能够帮助生物体减轻或消除自由基对细胞和组织的损伤的酶。

其中三个主要的抗氧化酶分别是超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)。

测定这些抗氧化酶的活性可以帮助我们了解细胞和组织内抗氧化能力的变化，从而评估对抗氧化应激的能力。

以下是常用的测定这些抗氧化酶活性的方法。

1.NBT法：超氧化物歧化酶能够催化过氧化脱氢麦角酮（NBT）被还原成紫色水溶性产物，通过测定产物的吸光度来确定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的NBT缓冲液。

（2）开始反应：置于适当的温度和时间下。

（3）停止反应：加入硝酸，停止NBT的还原反应。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.氰化硝酸法：该方法是通过抑制SOD对自由基的清除作用，使过氧化物离子被产生，进而通过测定过氧化物离子的吸光度来间接测定SOD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的氰化钾和亚硝酸钠。

（2）开始反应：加入适量的氧化剂，使之和SOD反应生成过氧化物。

（3）测定吸光度：使用分光光度计测量过氧化物离子产生的相对吸光度。

1.亚硫酸盐法：过氧化物酶能够催化亚硫酸盐氧化成差二价铁离子，通过差二价铁离子与硫酸铵生成蓝色络合物来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的亚硫酸铵和硫酸。

（2）开始反应：加入适量的H2O2，使之和POD反应生成差二价铁离子。

（3）停止反应：加入硫酸铵，停止POD对H2O2的催化作用。

（4）测定吸光度：使用分光光度计测量产生的相对吸光度。

2.过氧化氢法：过氧化物酶能够催化过氧化氢分解成氧气和水，通过测定生成的O2的相对浓度来测定POD的活性。

具体步骤如下：（1）准备反应体系：称取适量的细胞提取液，加入适量的过氧化氢。

（2）开始反应：加入过氧化物酶，使之和过氧化氢反应。

抗氧化酶测定实验方法

抗氧化酶测定实验方法抗氧化酶是一类能够抵御细胞对氧自由基的毒性的酶。

抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）等。

这些酶在细胞内能够将有害的氧自由基转化为无害的化合物，从而起到保护细胞免受氧自由基反应的毒性作用。

因此，测定抗氧化酶的活性能够反映细胞对氧自由基的抵御能力，对研究氧化应激、疾病发生机制等具有重要意义。

以下是一种常用的抗氧化酶测定方法的详细步骤：实验材料和试剂：1.组织样本或细胞培养物2.生理盐水（PBS）3. 超氧化物歧化酶(Abfrontier, LF-MA0011, 200U/mg, 冻干粉)4. 过氧化氢酶(Sigma, P2927, ≥2,000,000 units/mg protein, 溶于水)5. 谷胱甘肽过氧化物酶(Sigma, G5911, ≥300 units/mg protein,冻干粉)6. 过硫酸铵（Sigma, A9294）7.磷酸盐缓冲液(pH7.4，0.1M)8.丙酮9. 硫酸(Sigma, 1.84 M)10. 精氨酸(Sigma, A8094)11. 苯胂(Sigma, A8731)12. 硝基蓝色素(Sigma, N-5511)14. 高锰酸钾(Sigma, S2547)16. 硝基咪唑(NBT，Solarbio, S8190)17. EDTA二钠(Sigma, E6635)18. BSA(Sigma, A7906)19. 氯化三联氨(Sigma, A2251)20. Tris缓冲液(pH 8.0，0.1M)21. 高吉人(ABClonal, HRP-6002，5,000 IU/mg, 冻干粉)23.氯仿24.醋酸乙酯26.乙酸钠28. 脑磷脂(纯度≥98%，Shenggong, 1003J)30.SDS-试剂盒步骤：1.制备样本：将组织样本或细胞培养物均匀取样，使用PBS洗涤并平均分配到多个离心管中。

抗氧化酶活性等测定方法

抗氧化酶活性等测定方法叶绿体得提取一、试剂配置1、PBS提取液:每L水依次加入MES(195、2×0、05=9、76g)、山梨糖醇(0、33×182、2=60、126g)、NaCl(0、010×58、5=0、585g)、MgCl(0、002×95=0、19g)、EDTA(292、25×0、002=0、5845g)、KH2PO4(200×0、0005=0、1g);使用时加入ASA-Na(198、1×0、002=0、3962g);2、悬浮液:将PBS提取液中得MES换为238、3×0、05=11、915g得HEPES(238、3×0、05=11、915g);3、80%Percol:80ml原液+20ml水;40%Percol:40ml原液+60ml 水;实际配制:PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml(3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml);80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml、(3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml)二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS(50mM MES PH6、1,含0、33M 山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、 5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)2、快速研磨,使叶片碎成绿豆粒大小,4层纱布过滤,去除残渣(注意过滤时不可用力挤压,以免叶绿体膜破碎)3、滤液2000g 3min,小心倒出上清液,将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预定值(水平转头,加速度调到9),约经30s后很快使其下降停止,整个离心持续大约2-3min左右完成;4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物;5、用1ml悬浮液(50mM HEPES pH 7、6,含0、33 mM山梨糖醇,10mM NaCl,2mM MgCl2,2mM EDTA,0、5 mMKH2PO4,2mM ASA-Na,ASA-Na使用前现配现加)将沉淀悬浮,在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷,或者用手握住离心管在冰块之间搅动,使叶绿体由于震动分散开来,不要用棉球吸滤,以防被膜压破。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

抗氧化酶活性等测定方法

叶绿体的提取一、试剂配置1、PBS提取液：每L水依次加入MES(195.2×0.05=9.76g)、山梨糖醇(0.33×182.2=60.126g)、NaCl （0.010×58.5=0.585g）、MgCl（0.002×95=0.19g）、EDTA（292.25×0.002=0.5845g）、KH2PO4（200×0.0005=0.1g）；使用时加入ASA-Na（198.1×0.002=0.3962g）;2、悬浮液：将PBS提取液中的MES换为238.3×0.05=11.915g的HEPES（238.3×0.05=11.915g）；3、80%Percol：80ml原液+20ml水；40%Percol：40ml原液+60ml水；实际配制：PBS提取液2000ml(3个处理*2个品种*3个重复*20ml*3次=1080ml),悬浮液100ml（3个处理*2个品种*3个重复*1ml*3次=54ml）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200ml.（3个处理*2个品种*3个重复*3ml*3次=162ml）二、提取步骤1、10g鲜样加20ml提取PBS（50mM MES PH6.1，含0.33M山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）2、快速研磨，使叶片碎成绿豆粒大小，4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎）3、滤液2000g 3min，小心倒出上清液，将离心管放入离心机后，使离心机的加速很快上升到预定值(水平转头，加速度调到9)，约经30s后很快使其下降停止，整个离心持续大约2-3min左右完成；4、沉淀用1ml提取液漂洗表面悬浮物；5、用1ml悬浮液（50mM HEPES pH 7.6，含0.33 mM山梨糖醇，10mM NaCl，2mM MgCl2，2mM EDTA，0.5 mMKH2PO4，2mM ASA-Na，ASA-Na使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，使叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

抗氧化酶活性等测定方法

抗氧化酶活性等测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定方法超氧化物歧化酶是一种重要的抗氧化酶，能够将超氧自由基（O2.-）转化为过氧化氢（H2O2），进而被谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）或过氧化物酶（CAT）降解。

测定SOD活性的方法有多种，其中最常用的方法包括：1.基于阻断亚硝酸胆红素还原的方法：该方法通过加氨基钠阻断细胞色素c还原作用，使亚硝酸胆红素还原成胆红素，从而测定SOD活性。

2.基于X射线辐照条件下还原亚硝酸胆红素的方法：这种方法利用X射线辐照生成O2.-，进而被SOD转化为H2O2、H2O2与亚硝酸胆红素反应生成亚硝酸盐，其紫红色可被光度计测定。

3.基于化学发光的方法：这种方法通过硝酸亚铁与亚硝酸盐反应生成亚铁络合物，发出化学发光信号。

该方法简单、灵敏度高，并可以自动化操作。

二、过氧化物酶（CAT）活性测定方法过氧化物酶是参与H2O2代谢的重要抗氧化酶。

常用的测定CAT活性的方法有：1.重铬酸钾（K2Cr2O7）比色法：该方法利用过氧化氢氧化重铬酸钾，从橙色转变为无色，通过比色计测定过量K2Cr2O7的消耗量计算CAT活性。

2.亚甲蓝法：这种方法利用过氧化氢氧化亚甲蓝生成显色产物，通过光度计测定产物的吸光度来评估CAT活性。

3.氨蓝法：这种方法是通过氨蓝还原过氧化氢产生的游离基离子，再与其他物质（如溴酚蓝）反应生成显色产物，通过比色计测定产物的吸光度来测定CAT活性。

三、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性测定方法谷胱甘肽过氧化物酶是参与氧化还原反应的重要酶。

目前常用的测定GSH-Px活性的方法有几种，包括：1.基于还原硒酸铁的方法：该方法利用GSH-Px催化还原硒酸铁成为亚硒酸铁，反应产物与硫代巴比妥酸钠反应生成巴比特酸，通过光度计测定巴比特酸的吸光度来评估GSH-Px活性。

2.比色法：这种方法通过巴比妥酸与反应产物反应生成巴比妥酸-丙二醛复合物，通过光度计测定复合物的吸光度来评估GSH-Px活性。

抗氧化物活性测定方法总结

抗氧化物活性测定方法总结引言：一、化学法1.DPPH自由基清除法该方法利用DPPH（1,1-二苯基-2-三硝基苦基）自由基的特性，通过测定样品对DPPH自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法简便、快速，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

2.ABTS自由基清除法该方法利用ABTS（2,2'-联氨基双(3-乙酸苯并咪唑-6-磺酸)）自由基的特性，通过测定样品对ABTS自由基的清除能力来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果稳定，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法在高浓度下可能存在偏差。

二、生物学法1.超氧化物歧化酶（SOD）活性测定法该方法通过测定样品对超氧自由基的抑制能力来评估其SOD活性。

该方法可以反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性，适用于抗氧化物活性的研究。

但该方法操作复杂、耗时较长，且受到其他物质的干扰。

2.过氧化氢酶（CAT）活性测定法该方法通过测定样品对过氧化氢的分解能力来评估其CAT活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法无法反映样品在生理条件下的真实抗氧化活性。

三、电化学法1.循环伏安法该方法通过测定样品在电极上的氧化还原行为，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备，且对于非水溶性样品不适用。

2.差示脉冲伏安法该方法通过测定样品在电极上的差示脉冲伏安曲线，来评估其抗氧化活性。

该方法操作简单、结果准确，适用于各种样品的抗氧化活性测定。

但该方法需要特殊的电化学设备。

结论：目前，抗氧化物活性测定方法多种多样，各有优缺点。

选择合适的测定方法应根据具体实验目的、样品性质、设备条件等综合考虑。

为了准确评估样品的抗氧化活性，可采用多种方法进行综合分析。

未来，随着科技的不断发展，抗氧化物活性测定方法将会更加精确、快速、简便，为抗氧化物活性的研究提供更多便利和准确的手段。

抗氧化酶活性等测定方法

一、试剂配置 1、PBS 提取液:每 L 水依次加入 MES(195、2x0. 05=9、76g)、山梨糖醇(0、33x182. 2=60、126g). NaCl(0、010x58、5=0. 585g)、MgCI(0、002x95=0、19g)、EDTA(292. 25x0. 002=0. 5845g). KH2PO4(200x0. 0005=0. Ig)；使用时加入 ASA-Na(!98. 1x0. 002=0. 3962g);2、悬浮液:将 PBS 提取液中得 MES 换为 238、3x0、05=11、915g 得 HEPES(238、3x0、05=1 k 915g);3、80%PercoI;80ml 原液+20ml 水：40%Percol:40ml 原液+60ml 水;实际配制:PBS 提取液20001111（3个处理*2个品种*3个靈复*20m!*3次=1080ml ）.悬浮液1001111（3个处理*2个品种*3个重复次=54n 】l ）;80%Percol 200ml; 40%Percol 200nik (3 个处理*2 个品种*3 个重复*3ml*3 次=162ml)二、提取步骤 1、lOg 鮮样加 20ml 提取 PBS(50mM MES PH6、1,含O 、33M 山梨糖醇JOmM NaCL2mM MgCkfmM EDTA.O 、5 mMKH2POj ・2mM ASA ・Na ・ASA ・Na 使用前现配现加) 2、快速研曆，使叶片碎成绿豆粒大小4层纱布过滤，去除残渣（注意过滤时不可用力挤压，以免叶绿体膜破碎） 3、滤液2000g 3min •小心倒出上淸液，将离心管放入离心机后,使离心机得加速很快上升到预崔值（水平转头.加速度调到9）,约经30s 后很快使加下降停止，整个离心持续大约2・3min 左右完成;4、沉淀用1ml 提取液漂洗表面悬浮物;5、用 1ml 悬浮液（50mMHEPES pH7. 6•含0. 33 mM 山梨糖醇」0NaCl ・2mM MgCb2mM EDTA.O 、5 niMKH2PO4-2mM ASA-Na.ASA-Na 使用前现配现加）将沉淀悬浮，在分散叶绿体时宜用毛笔轻轻刷，或者用手握住离心管在冰块之间搅动，便叶绿体由于震动分散开来，不要用棉球吸滤，以防被膜压破。

酶活性测定

实验一植物抗氧化酶活性的测定植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。

它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。

所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。

一、超氧化物岐化酶活性测定超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：2反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。

已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。

【原理】本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲。

后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。

于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。

一个酶活性单位定义为将NBT的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。

【仪器与用具】高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑色硬纸套。

【试剂】1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。

2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。

3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。

4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33m g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。

5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21m g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml。

6．20μmol/L核黄素溶液：取7.53m g核黄素定容至1000ml避光保存。

实验六过氧化物酶活性测定

实验六过氧化物酶活性测定一、实验目的过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。

通过本实验了解过氧化物酶的作用，掌握愈创木酚法测定过氧化物酶。

二、实验原理在过氧化物酶（POD）催化下，H2O2将愈创木酚氧化成茶褐色产物。

此产物在470nm处有最大光吸收值，故可通过测470nm下的吸光度变化测定过氧化物酶的活性。

四、设备与试剂分光光度计，TDL-5000B型低速冷冻多管离心机(R=18cm)，研钵，容量瓶，量筒，试管，吸管。

0.05mol·L-1的磷酸缓冲液（pH5.5），0.05mol·L-1愈创木酚溶液，2％H2O2。

五、实验步骤（一）酶液的制备取1.0～5.0g洗净去皮的马铃薯块茎，切碎，放入研钵中，加适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆。

将匀浆液全部转入离心管中，于3000×g离心10min，上清液转入25mL容量瓶中。

沉淀用5mL磷酸缓冲液再提取两次，上清液并入容量瓶中，定容至刻度，低温下保存备用。

（二）过氧化物酶活性测定酶活性测定的反应体系：依次加入 2.9mL0.05mol·L-1磷酸缓冲液；1.0mL2％H2O2；1.0mL0.05mol·L-1愈创木酚和0.1mL 酶液。

用加热煮沸5min 的酶液为对照，反应体系加入酶液后，立即于34℃水浴中保温3min，然后迅速稀释1倍，470nm 波长下比色，每隔1min记录1次吸光度A470，共记录5次，然后以每分钟内A470变化0.01为1个酶活性单位（U）。

六、实验结果以每分钟内A470变化0.01为1个过氧化物酶活性单位（U）。

W——马铃薯鲜重（g）；t——反应时间（min）；VT——提取酶液总体积（mL）；VS——测定时取用酶液体积（mL）。

抗氧化活性测定方法

抗氧化活性测定方法抗氧化活性测定方法是一种用于评估物质对自由基活性的抑制能力的方法。

自由基是一种高活性化合物，容易引发氧化反应，并对生物体内的细胞和分子产生损伤。

抗氧化活性的测定方法可以用于评估食品、药物、化妆品和保健品等物质的抗氧化能力，有助于指导其应用和开发。

目前常用的抗氧化活性测定方法包括化学方法、生物方法和细胞方法等。

化学方法主要是通过测定物质对自由基引起的化学反应的抑制能力来评估其抗氧化活性。

其中最常用的方法是自由基清除能力测定，常见的实验方法包括DPPH自由基清除法、ABTS自由基清除法和Folin-Ciocalteu法等。

这些方法都是通过测定物质与自由基之间的反应，并通过测定产生的颜色变化或吸光度的变化来评估其抗氧化活性。

生物方法主要是利用生物体内的抗氧化酶（如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）作为指标来评估物质的抗氧化活性。

这些方法通常涉及到营养生理学、生物化学和分子生物学等多个领域的知识，需要进行较为复杂的实验操作和数据分析。

细胞方法主要是通过评估物质对细胞的保护作用来评估其抗氧化活性。

常用的方法包括细胞存活率测定、细胞色素c释放测定和DNA损伤测定等。

这些方法通常使用细胞培养技术来培养和处理细胞，在培养期间引入氧化应激物质，然后通过测定细胞的生存状况、重要蛋白的释放和DNA的损伤程度来评估物质的抗氧化活性。

抗氧化活性测定方法的选择取决于所研究物质的性质和应用场景。

不同的方法有其各自的优势和局限性，需要根据具体情况进行选择。

此外，在进行抗氧化活性测定时需要注意实验条件的控制，如温度、pH值、实验时间和浓度等，以确保实验结果的准确性和可重复性。

综上所述，抗氧化活性测定方法是评估物质抗氧化能力的重要手段，对于指导物质的使用和开发具有重要意义。

随着科学技术的不断进步，抗氧化活性测定方法也在不断演变和发展，更多新的方法和技术将会被引入到这一领域，并为相关领域的研究和应用提供更加准确和全面的信息。

抗氧化酶活力测定方法sun20200516

植物组织抗氧化酶活的测定方法（修订版2020年5月7日）一、待测样品预处理称取鲜样0.5g于预冷的研钵（提前放冰箱）中，加1mL预冷的磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8），冰浴研磨后再加1mL缓冲液，倒入离心管中，再用2mL缓冲液清洗研钵，倒入离心管中，平衡，低温（0-4℃）离心20min（10500rpm），收集上清液，冷藏保存。

磷酸缓冲液配制：A液（0.2mol/L磷酸氢二钠溶液）的配制：称取Na2HPO4·2H2O 35.61g 或Na2HPO4·7H2O 53.65g 或Na2HPO4·12H2O 71.64g 用蒸馏水定容至1000mL。

B液（0.2mol/L磷酸二氢钠溶液）的配制：称取NaH2PO4·H2O 27.6g 或NaH2PO4·2H2O 31.21g 用蒸馏水定容至1000mL。

磷酸缓冲液（0.05mol/L，pH=7.8）配制：45.75mL A+ 4.25mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（0.1mol/L，pH=7.0）配制：61mL A+39mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（100 mmol/L、pH 7.5）配制：84mL A+16mL B定容至200mL。

磷酸缓冲液（50 mmol/L、pH7.5 ）配制：42mL A+8mL B定容至200mL。

二、SOD（超氧化物歧化酶）活力测定——氮蓝四唑（NBT）法1.1原理超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)普遍存在于动､植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它催化下列反应：。

本反应产物H2O2可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。

本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑(NBT)在光下的还原作用来确定酶活性大小。

在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。

实验六++植物抗氧化酶活性的测定

二、实验方法
1、提取：分别取0.5 g实验材料→加入少许石英砂和3 ml 提取液（50mmol/L PBS, pH5.8,内含0.１mmol/ LEDTA, 1%PVP） → 充分研磨 →转入离心管中→用2 ml提取液洗研钵→ 5000 rpm离心10 min →上清液定容至5 ml →用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。
分别取05g实验材料加入少许石英砂和3ml提取液50mmollpbsph58内含01mmolledta1pvp充分研磨转入离心管中用2ml提取液洗研钵5000rpm离心10min上清液定容至5ml用于测定pod和ppo酶活性或分装后转至20或80保存
实验六植物抗氧化酶活性的测定
背景
“控制与被控制”理论
2、POD测定：取POD反应混合液（10 mmol/L愈创木酚，
5 mmol/L H2O2,用PBS溶解）2.90 ml，25 ℃水浴5 min，加入酶液100 l（空白调零用提取液取代），立即记时，
摇匀，读出反应30 s和3 min时的A470。用ε计算POD活性。 3、PPO测定：取PPO反应混合液（ 20 mmol/L邻苯二酚，
用PBS溶解）2.8 ml， 25 ℃水浴5 min，加入酶液0.2 ml （空白调零用提取液取代），立即记时，摇匀，读出反应 30 s和2 min时的A410。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：
4、计算
POD activities = A470 VT V 1 (mol.g-1FWmin-1)
0.7
A
0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 00.0
400 420 440 460 480 500 520 540 560

植物抗氧化酶的活性测定

植物抗氧化酶的活性测定1植物预处理将植物根和shoots（特指陆生植物所有地上的部分。

少数在地下生长；包括茎、叶、花、果、种子等等）分别在液氮中冷冻，用预冷的研钵和液氮使样本在不含1,4－二硫苏糖醇的QB bufer中形成均质[用于SOD、CAT和GST测定]。

对于GR检测，每克组织添加50mg聚乙烯基吡咯烷酮。

粗匀浆在4℃下15000 g离心15min，将上清液置于−20℃下冷冻。

2活性测定以牛血清白蛋白为标准，采用布拉德福德Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白浓度。

考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：该方法不适用于小分子碱性多肽的定量测定，如核糖核酸酶或溶菌酶。

去污剂的浓度超过0.2%影响测定结果。

如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至200ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定；2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。

如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。

通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线；3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同（最好用PBS）；4．按1：4用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去；5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。

染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。

注意，显色反应不得超过30min；6．根据标准曲线计算待测样本的浓度（缺点，线性拟合效果不好）。

注：考马斯亮蓝和皮肤中蛋白质通过范德华力结合，反应快速，并且稳定，无法用普通试剂洗掉。

待一两周左右，皮屑细胞自然衰老即可脱落。

2.1SOD（超氧歧化酶，具有抗氧化和抗衰老的作用，其作用机理主要是清除对机体有害的超氧阴离子自由基(O2-)）活性的测定参照Roth和Gilbert的方法。

抗氧化酶活性测定方法

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四瞠光化还原法）1、试剂得配制（1）0、05mol/L 磷酸缓冲液（PBS,pH7、8）:A 母液:0、2mol/L 磷酸氢二钠溶液：取 Na2HPO4- 12H2O（分子量 358、14）71.7g;B母液:0、2mol/L磷酸二氢钠溶液:取NaH^POQHO分子量156、01）31.2g。

分别用蒸馅水左容到1000ml。

0、05mol/L PBS（pH7、8）得配制:分别取 A 母液（Na2HPO4） 228,75ml,B 母液（NaH2PO4）21、 25ml,用蒸餾水左容至lOOOmL 1\ 1佟PVP（宗W毗.；「.丨参考文献:李合生主编:植物生理生化实验原理与技术、髙等教育出版社,2000:267〜268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液:取1、39典Met用磷酸缓冲液（pH7、8）定容至lOOmL网h 说定容到100ML我也不懂。

拜托（3）100 11 mol/L EDTA-Na：冷m（）3721g EDTA—Nw . 000ml；（4）100H M核黄素溶液:取0、0075g核黄素用:定容至100ml,避光保存，门汀汁.丨稀释10倍（5）750 i* mol/L気伽喙NBT）溶液霹取O.O6133g NBT川缓冲液定容至UJOml避光保存；酶液制备:収定沈叶Mi物叶川视禹耍从丿；门脉）（）巡J厲冷彳抑：.2ml磷內冲液在冰浴卜研磨成浆，加缓冲液使终体枳为10ml.取5ml于10000r/min I、•离心lOmin. hin 液即为SOD粗提液。

提取酶液时如何保存;如果没有测完得需要放在4匸得冰卷叽2、酶活性测定2.显色反应取试管（要求透明度好）5支,3支为样品测左管,1支为对照管，另外1支作为空白，按表39-1加入各溶液。

混匀后将空白管置暗处，其它各管于40001X H光灯下反应20min（要求各管受光情况一致, 反应室得温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长）。

抗氧化酶测定实验方法

抗氧化酶测定实验方法植物组织中丙二醛（mda）含量的测定植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(mda)是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

mda从膜上产生的位置释放出后，可以与蛋白质、核酸反应，从而丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰，或抑制蛋白质的合成。

因此，mda的积累可能对膜和细胞造成一定的伤害。

丙二醛(mda)就是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和低温度条件下，可以与硫代巴比那韦(tba)反应分解成红棕色的三甲川(3，5，5—三甲基恶唑-2，4。

二酮)，其最小稀释波长在532nm。

但是测量植物非政府中mda时受到多种物质的阻碍，其中最主要的就是可溶性糖，糖与tba呈色反应产物的最小稀释波长在450nm，但532nm处也存有稀释。

植物遭遇旱情、高温、低温等逆境威逼时可溶性糖减少，因此测量植物非政府中mda—tba反应物质含量时一定必须确定可溶性糖的阻碍。

低浓度的铁离子能明显减少tba与蔗糖或mda呈色反应物在532、450nm处的喷光度值，所以在蔗糖、mda与tba呈色反应中须要一定量的铁离子，通常植物非政府中铁离子的含量为每克千重100—300ug·g-1，根据植物样品量和提取液的体积，重新加入fe3+的终浓度为0．5umol·l-1。

二、方法直线回归法mda与tba显色反应产物在450nm波长下的吸光度值零。

相同浓度的蔗糖(0—25mmol·l-1)与tba呈色反应产物在450nm的喷光度值与532nm和600nm处的喷光度值之高变成正有关，酿制一系列浓度的蔗糖与tba呈色反应后，测量上述三个波长的喷光度值，谋其直线方程，纡算是糖分在532nm处的喷光度值。

uv-120型紫外可知分光光度计的直线方程为：y532＝-0．00198十0．088d450(44—1)d450、d532、d600分别代表450、532和600nm波长下的喷光度值。

实验六++植物抗氧化酶活性的测定

抗氧化酶测定实验方法

研究生植物生理学实验教案

植物组织SOD活性测定

抗氧化酶活性等测定方法

抗氧化酶活性测定方法

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抗氧化酶活性等测定方法

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抗氧化物活性测定方法总结

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植物抗氧化酶的活性测定

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