生化实验课

碘价的测定：
在适当条件下，不饱和脂肪酸的不饱和间能与 碘、溴或氯起加成反应。但碘与脂肪的加成作用缓 慢，故于Hanus试剂中加入适量溴，是产生溴化碘， 在与脂肪作用。将一定量的溴化碘与脂肪作用后， 测定溴化碘的剩余量，即可求得脂肪的碘价，100g 脂肪所能吸收碘的克数称为碘价。
器材与试剂：

菜油、Hanus试剂、15% 碘化钾、标准硫代硫酸 钠溶液、淀粉液、KOH 标准液、中性醇醚混合 液、1% 酚酞、 碘瓶、 滴定管、电子分析天平、 称量瓶、
点样:
用毛细管分别吸取各种样液，分别在各原点点上 一种氨基酸。注意每一管要分次点完。样点直径 小于0.3cm。
展层：
在层析缸上口处中央，平行的贴上透明胶纸，胶 纸要绷紧。在点了样品的滤纸上端中点处垂直贴 上透明胶，将滤纸上的透明胶贴在缸口的透明胶 上。 注意：滤纸点样端朝下，刚好接触缸底，垂直悬 于缸中。当溶剂前沿展到距滤纸上端约1.0cm时 取出滤纸，用吹风机吹干。
管号 1 2 3
1%葡萄糖
1D
1%半乳糖 1%阿拉伯糖
杜氏 试剂
1ml
现象（沸水浴加 热）并解释
2D 3D
1ml 1ml
注意：观察颜色变化及变化时间。
思考题


莫氏反应中莫氏试剂为什么要直接加入溶 液中，不能滴在试管壁上? 加浓硫酸时，试管倾斜，硫酸缓缓加入， 为什么不能振动溶液？
实验二 氨基酸的纸层析
重点与难点：氨基酸纸层析的基本原理的 理解是本实验的难点。重点是掌握氨基酸 纸层析的操作方法和运用。 实验安排：4课时，每人独立实验，4人一 个层析缸。
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实验原理
纸作支持物，特点是-OH多，亲水性强。 溶剂系统分成两相：固定相（水）特点是易与OH结合移动慢。移动相（水饱和的有机溶剂）特 点是移动速度快。 不同的氨基酸在不同的相中溶解度不同，不同的 氨基酸在不同的相中移动速度不同，不同的氨基 酸在相同的相中移动速度也不同。 基于以上三点原因，经过层析后，不同的氨基酸 移动的距离不同，从而得到分离。分离度用Rf值 表示如下： Rf=原点到层析点中心的距离/ 原点到溶剂前沿 的距离

DNA的凝胶电泳： 胶的制备：取0.2克琼脂糖凝胶，加入20毫升的TBE，
加热溶解后，冷却到50-60摄氏度，加入Goldview 1ul， 混匀后倒入插有16孔梳子的10×10的凝胶槽中。待 凝胶凝固后小心取出梳子，置于电泳槽中，加入TEB 的缓冲液，使液面略高于凝胶面。


加样：用移液器取10ul的DNA样液，小心的注入凝
生物化学实验
海南大学海洋学院水产学系
实验室规则(一)
１、自觉遵守学习纪律，保持实验室肃静， 不得喧哗吵闹、迟到早退，更不得缺席。 ２、爱护仪器，厉行节约。试剂、药品、蒸 馏水等应节约使用，不得浪费。如不慎损坏仪器， 应及时报告老师，说明原因，经老师同意后，方 可换领。并应按规定赔偿或处理。贵重、精密仪 器，应先熟悉使用方法，在老师的指导下，严格 按操作规程操作，发现故障，应立即报告老师， 不得擅自处理。
试剂与器材：
氨基酸液（5种）、正丁醇、冰醋酸、水、茚三酮、 层析滤纸、层析缸、吹风机、喷瓶、铅笔、直尺、 分液漏斗
•
各 式 各 样 的 喷 瓶
层析缸
实验步骤
实验准备 点样 展层 显色 记录 计算Rf 值 结论
实验准备


层析液配制: 正丁醇:冰醋酸:水= 5:3:2 (体积 比)置分液漏斗中静置分层，取上清液约 60ml 倒于层析缸中静置到液面不动为止。 滤纸准备：取层析滤纸，裁成10×15cm的 长方形，在距纸一端1.5cm处用铅笔画一直 线。在线的两端距边沿1cm处各划一点。在 这两点之间均匀的画上四点。在这六点处 标上序号1、2、3、4、5、6。
实验六 过氧化物酶和过氧化氢酶的作用
重点与难点：

掌握过氧化氢酶和过氧化物酶的作用，同时了解 酶的一些特性。
课堂安排：2课时，1人1组单独实验 主要试剂：2%过氧化氢、1%焦性没食子酸、白
菜、猪肝、研钵、试管、吸管、纱布、漏斗、天 平、剪刀、水浴锅
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实验原理：
过氧化氢酶能催化过氧化氢分解，产生水及 分子氧。过氧化物酶催化过氧化氢释放出新生氧 以氧化某些酚类和胺类物质。例如氧化溶于水中 的焦性没食子酸生成不溶于水的橙黄色的焦性没 食子橙。同时产生二氧化碳。
• 塞氏反应(按下表加试剂)
管号 1%果糖 1%蔗糖 1%葡萄糖 1 2 3 0.5ml 0.5ml 0.5ml
塞氏 试剂
2.5ml 2.5ml 2.5ml
现象(沸水浴 加热)并解释
注意：加热时间要长，观察颜色变化及变化的顺序。颜色 变化顺序用1、2、3标记，深浅用+、++、+++等表示。
• 杜氏反应(按下表加入试剂)
实验原理：


DNA要溶于酸性乙醇和10%的氯化钠，用 丙酮使其沉淀而分离出来。从花椰菜中提 取DNA要注意花椰菜要研磨充分。 琼脂糖凝胶电泳的原理：电荷效应和分子 筛效应。
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实验步骤 DNA的提取：




取花椰菜的花冠5克剪碎置于研钵中，加8毫升的 酸性乙醇，再加少量的石英砂研磨成匀浆，在 4000r/min的条件下离心20分钟，得上清液，弃沉 淀。 在上清液中加入等体积的丙酮，混匀，观察现象。 提示：有沉淀生成。 在4000r/min的条件下离心20分钟离心上述浑浊液， 得沉淀，即为DNA的粗制品。 将DNA的粗制品溶解于0.5毫升的TBE缓冲液和0.1 毫升的溴酚蓝指示剂。
实验一
实验安排 实验原理
糖的颜色反应
实验试剂
实验步骤
思考题
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实验安排： 2课时，单人单组 实验原理：



莫氏反应：糖经无机酸脱水产生糠醛或糠醛衍生 物，后者在浓无机酸作用下，能与1-萘酚生成紫 色的缩合物，可用于鉴定糖的存在。 塞氏反应：酮糖在浓酸的作用下，脱水生成5-羟 基糠醛，后者与间苯二酚作用，呈红色，可用于 鉴定酮糖的存在。 杜氏反应：戊糖在浓酸溶液中脱水生成糠醛，后 者与间苯三酚作用生成桃红色物质，可用于鉴定 戊糖的存在。
实验试剂：
Molish（莫氏）试剂：取5g α-萘酚用95%乙醇 溶解至100mL，临用前配制，棕色瓶保存； Sediwanoff（塞氏）试剂：0.5g 间苯二酚溶于1 升盐酸（H2O∶HCl=2∶1）(V/V)中，临用前 配制； 杜氏试剂：称取2g间苯三酚，溶于250mL95% 乙醇中。临用时取此液3mL，缓缓加入15mL浓 盐酸及9mL蒸馏水，临用时配制。
实验室规则（二）
３、取用试剂时，应仔细辨明标签，以免 取错。取完试剂后，应及时将瓶盖盖好， 放回原处，切忌乱拿乱放，“张冠李戴”。 ４、注意安全，用吸量管吸取试剂时应使 用吸球，严禁用嘴吸取。对于有毒、腐蚀 的试剂更应注意，应避免其直接接触人体 及衣物。乙醚、丙酮等易燃试剂应远离火 源，以免发生意外。


准确称取0.2g的油脂置于碘瓶中，加10ml氯仿作溶剂， 加入Hnaus试剂20ml，塞好瓶塞，轻轻摇动，混匀后置 暗处30分钟，于另一瓶中加同样试剂，不加脂肪，作 空白对照。 30min后，先注15%碘化钾溶液少许于碘瓶口边上，使 碘化钾溶液流入瓶内，继续由瓶口边沿加入碘化钾溶 液，共20毫升，再加水100毫升混匀。随即用标准硫代 硫酸钠溶液滴定。等瓶内液体呈淡黄色时，加1% 淀粉 液数滴，继续滴定，近终点时，可加塞振荡，使之于 氯仿之碘完全作用，继续滴定至蓝色消失为止。记录 标准硫代硫酸钠的用量。同法滴定空白管。
胶孔中。
电泳：接通电泳仪的电源，在电压不超过5V/cm的
条件下电泳50分钟。待溴酚蓝指示剂移动到凝胶前 沿1-2cm处，停止电泳。

观察现象：在紫外灯254nm下观察有没有DNA显出
的黄色的色带，并纪录结果 。
注意事项


待胶完全凝固后，方可取出梳子，且不能破坏 胶面； 加样时不能捅破胶孔； 紫外灯照射时间尽量短。
显色：

喷瓶将茚三酮溶液均匀的喷在滤纸上。在约105℃的 条件下烘烤至各层析斑点显色为止。
记录：
• 将滤纸适当缩小后，将结果画于报告上。
计算Rf值：
• 在计算Rf 值时，用下标表示氨基酸的名称，最好 用每种氨基酸的第一个字标记。例如甘氨酸得Rf 值用Rf甘= 表示。
结论： 提示通过主要比较Rf值的差异，讨论在该 条件下各种氨基酸分离度的大小。 思考题与习题 有哪些因素影响氨基酸的Rf值？
• FA系列电子天平
•
高型称量瓶
实验步骤：
酸价的测定： 准确称取1-2g油脂于 100ml三角瓶中； 加入醇醚混合液 50ml ,振瑶溶解至透 明，溶液由红色变为 无色； 继续用标准KOH溶液 滴定至淡红色，1min 不退色为终点。记录 KOH的用量V。
(1)
(2)
(3)
碘价的测定：
录
•氨基酸的纸层析 •血清蛋白的醋酸薄膜电泳 •脂肪酸酸价和碘价的测定 •DNA的提取与定性实验 •过氧化氢酶和过氧化物酶的作用
实验参考书


生物化学实验，陶均辉等编，科学出版社，第三版； 基础生物化学实验，王秀奇等编，高等教育出版社， 第二版； 动物生物化学实验指导，周顺伍主编，中国农业出版 社，第二版。
计算：
脂肪的酸价= cv×56.1/m 脂肪的碘价=c(B-S)/M×0.1269×100 说明：
B：空白所耗硫代硫酸钠的体积（ml） S: 样品所耗硫代硫酸钠的体积（ml） M ：脂肪的质量 C: 硫代硫酸钠的当量浓度
实验五
DNA的提取与凝胶电泳
重点与难点：难点是提取DNA的原理和方
法，重点是琼脂糖凝胶电泳的操作方法。


电泳：接通电源，电泳条件：电压90－110ｖ，电流
0.4-0.6 Ma/cm ,通电时间约６０分钟。

染色：电泳完后，将薄膜浸于染色液中３－５分
钟，取出用漂洗液漂洗至背景无色。

漂洗：将漂洗后的薄膜放在透明液中浸泡至透明。


纪录：记下色带的条数及宽度和颜色深浅
结论：带数可知至少有多少中蛋白质，宽度 和深浅说明该处蛋白质的浓度 思考题与习题 影响电泳的因素有哪些？
实验步骤： • 莫氏反应（按下表加试剂）
管号
1 1%葡萄糖 /ml 1 1%蔗糖 /ml 1%淀粉 /ml 纤维素 莫氏试剂 2D 浓硫酸 /ml 2 现象
2
3 4
1
1 少许
2D
2D 2D
2
2 2
注意: (1) 莫氏试剂直接加入溶液中，不能滴在试管壁上！
(2) 加浓硫酸时，试管倾斜，硫酸缓缓加入，不要振动溶液！
实验三
血清蛋白的醋酸纤维薄膜电泳
重点与难点：
电泳的基本原理，醋酸薄膜电泳的操作。
实验安排：2课时，6-8人一个电泳槽，每人独立
实验。
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实验原理：

带电颗粒在电场的作用下，移动速度计算如下：

据此公式，在同一电场强度和缓冲液条件下，带电的 各种蛋白质成分，移动的速度决定于各蛋白质的带电 量和自身分子的大小。
实验四
脂肪酸酸价和碘价的测定
课堂安排：共2课时，2人一组。 课前提问：

什么叫脂肪酸的酸败？ 人体必需的不饱和脂肪酸有哪些？
日常生活中油或含脂高的食品变“哈”，为什么？
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实验原理:
酸价的测定：
油脂中的游离脂肪酸与KOH发生中和反应，从 KOH标准溶液消耗量可计算出游离脂肪酸的量 。
器材：
• 鸡血清蛋白、PH8.6巴比妥-巴比妥钠缓冲液、染 •
色液、漂洗液、透明液、培养皿、 镊子、点样器、剪刀、卧式电泳槽、电泳仪。
主要仪器
水平电泳仪
培养皿
实验步骤：

准备和点样
取一条大小为2cm×8cm的醋酸纤维薄膜（可 根据需要选择薄膜的大小），浸入缓冲液中， 完全浸透后，用镊子轻轻取出，将薄膜无光 泽的一面向上，平放在干净滤纸上，薄膜再 放一张干净滤纸，吸取多余的缓冲液。 用玻棒蘸去少量血清，将此血清均匀地涂在 载玻片的一端截面上（玻片宽度应小于薄 膜），然后轻轻与距纤维薄膜一端1.5cm处接 触，样品即呈一条状涂于纤维膜上。待血清 透入膜内，移去载玻片，将薄膜平贴于已放 在电泳槽上、并已浸透缓冲液的滤纸上，点 样端阴极。
实验室规则（三）
５、注意实验室卫生、整洁。废弃液体 应倒入水槽，放水冲走，实验用过的和棉 花、废纸、沉淀废渣及其他废弃物品等均 应放入指定容器，不得随意乱扔或丢进水 槽。实验结束后应将实验台整理好。并清 扫、整理实验室。关好水、电、门、窗， 经老师检查同意后，方可离开实验室。
实
•糖的颜色反应
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