第5章 PCR技术的基本原理及应用(研究生课程)模板
PCR的基本原理和应用 PPT课件
聚合酶链式反应（PCR Polymerase Chain Reaction）
一种人工在体外进行快速DNA片断扩增的方法。
PCR技术基本原理
PCR技术的基本原理 类似于DNA的 天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两 端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成： 模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或 经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮 反应作准备； 模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃ 左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； 引物的延伸：DNA模板--引物结合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反 应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多 的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循 环需 2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期 (Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。
分子克隆(clone,cloned,cloning) 在生物体外用重组技术将特定基因插入载体分子中.将DNA片段(或基因)与载体 DNA分子共价连接，然后引入寄主细胞，再筛选获得重组的克隆，按克隆的目 的可分为DNA和cDNA克隆两类。
Cloning vectors (克隆载体):在基因工程重组DNA技
育，形成DNA-蛋白质复合物，电泳后用放射性自显影技 术可以确定DNA条带的位置，从而确定它与蛋白质是否 结合。
A DNA bound with more than one protein to form a larger complex.
PCR技术的原理与应用ppt课件
1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热的DNA聚合酶。此 酶耐高温，并提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了 扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而 其灵敏性也大大提高。此酶的发现使PCR技术被广泛的应用。
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锚定PCR ： 锚定PCR（Anchored PCR, A-PCR）主要用于分析具有可
变末端的DNA序列，Loh等用锚定PCR对人外周血淋巴细胞T 细胞受体α-链的mRNA的多变性进行了分析。先合成cDNA， 并用末端脱氧核苷酸转移酶在其3’-可变区末端加上一个 PolyG尾巴。Loh等在恒定区与可变区连接部位设一个引物， 另一个引物是一个具5’-polyG尾巴的引物。带有PolyG尾巴的 引物是一个固定点，它可以并与PolyG尾巴结合，无论其余部 分序列如何，只识别片段末端，利用此法可从前述mRNA中检 出至少20种不同序列，每一种都是独特的，表明锚定PCR不对 任何特殊序列有倾向性结果，可用于T细胞、肿瘤及其它部位 抗体基因的研究。
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Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著 的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为 200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物 减少。
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2.PCR技术的主要类型及其应用
14
锚定PCR原理示意图
15
标记PCR和彩色PCR：
标记PCR(Labelled Primers，LP-PCR)，LP-PCR是利 用同位素或荧光素对PCR引物的5‘端进行标记，用来检测 靶基因是否存在。彩色PCR(Color Complementation assay PCR，CCAPCR)，是LP-PCR的一种。它用不同颜色的荧 光染料标记引物的5’端，因而扩增后的靶基因序列分别带 有引物5‘的染料，通过电泳或离心沉淀，肉眼就可根据不 同荧光的颜色判定靶序列是否存在及其扩增状况，此法可 用来检测基因的突变，染色体重排或转位，基因缺失及微 生物的型别鉴定等。
第5章 PCR技术的基本原理及应用(研究生课程)
LDH-A基因变异类型
_________________________________________________
变异位置
DNA
氨基酸置换
影响
—————————————————————————
A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变
A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变
未知序列
已知序列
未知序列
限制酶 未知序列
已知序列
限制酶 未知序列
连接酶
3、多重PCR
在同一PCR体系中加入若干对PCR引 物，如果这些引物的退火温度相近，并且 所覆盖的区域不重叠，这样的反应体系可 同时扩增多个DNA片段。
多重PCR常用来检测同一基因的多个 外显子的缺失，或检测缺失设置内对照。
用于检测特定基因序列的存在或缺失。
DMD基因外显子缺失的检测
4、LP-PCR（Labelled primers)
利用同位素、荧光素等对ＰＣＲ引物 进行标记, 用以直观地检测目的基因。
特别适合大量临床标本的基因诊断。 可同时检测多种基因成分。
病毒1 病毒2
病毒 3
病毒4
PCR产物
ＰＣＲ
标记引物
观察
5、锚定PCR（anchored PCR, A-PCR）
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
第一节 PCR的原理
Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize
各种型号的PCR仪
PCR技术的原理及其应用
3
生物制药质量控制
PCR技术可用于生物制药过程中的质量控制，如 检测产品中特定基因序列的存在和表达情况。
06
PCR技术挑战与发展 趋势
灵敏度、特异性及通量提升
灵敏度提升
通过优化反应体系、提高引物设计和使用高效的DNA聚合 酶等手段，可以降低PCR检测的限度，提高灵敏度。
特异性增强
采用更严格的引物设计、使用热启动PCR、增加退火温度 等方法可以减少非特异性扩增，提高PCR的特异性。
应用
实时荧光定量PCR广泛应用于基因表达分析、病原体检测、SNP分型等领域，具有灵敏度高、特异性 强、可定量等优点。
逆转录PCR
原理
逆转录PCR（RT-PCR）是一种将RNA逆转录成cDNA，再进行PCR扩增的方法。该技术结合了RNA提取、逆转 录和PCR扩增三个步骤，可用于检测细胞中特定基因的表达情况。
DNA复制特点
DNA复制具有半保留复制、边解旋边复制以及需要引物等特 点。
引物设计与合成
引物设计原则
引物是PCR扩增的关键因素之一 ，设计时需要遵循一定的原则， 如长度适中、GC含量合理、避免 引物二聚体形成等。
引物合成方法
引物可以通过化学合成或生物合 成的方法获得，其中化学合成方 法更为常用，包括固相亚磷酰胺 法和液相合成法。
应用
逆转录PCR广泛应用于基因表达分析、病毒检测、RNA编辑等领域。通过比较不同样本或不同处理条件下的基因 表达差异，可以揭示生物学过程中的调控机制。
其他PCR变种技术
要点一
原理
除了上述常规PCR技术外，还有许多其他PCR变种技术， 如多重PCR、不对称PCR、热启动PCR等。这些技术通过 改进PCR反应条件或引入新的策略，提高了PCR的特异性 、灵敏度和通用性。
PCR技术的原理与方法
PCR技术的原理与方法PCR（聚合酶链式反应）是一种体外的DNA复制方法，它通过模拟细胞内的DNA复制过程，在离体条件下扩增DNA片段。
PCR技术的原理主要包括反应组分、温度循环和反应酶的作用三个方面。
1.反应组分PCR反应液的主要组成部分包括DNA模板、引物、dNTPs（四个脱氧核苷酸单元）、聚合酶和缓冲液。
DNA模板是PCR反应的起始物，可以是任何含有待扩增片段的DNA。
引物是DNA片段的两侧序列，它们是PCR反应酶（如Taq聚合酶）的起始点，引物序列应与目标DNA片段的两端互补。
2.温度循环PCR反应需要在不同的温度下进行循环，包括变性、退火和延伸步骤。
温度周期的设定是PCR反应中最关键的一步，它根据DNA的退火温度来决定。
-变性：将PCR反应液加热至94-98℃，使DNA双链解离成两条单链的DNA模板。
在变性步骤中，双链结构会解开，导致DNA模板的两条链分离。
-退火：将反应液温度降低至50-60℃，使引物与DNA模板的特定序列互补结合。
退火温度应低于目标DNA的退火温度，以保证引物的特异性结合。
-延伸：将反应液温度升至72℃，使聚合酶在这一温度下所具有的酶活性可以引导dNTPs与引物结合，从而在DNA模板上合成新的DNA链。
此步骤通常需要较长的时间，以确保完全延伸。
3.反应酶的作用PCR反应中使用的酶主要包括DNA聚合酶、外切酶和反转录酶。
其中DNA聚合酶是PCR反应的关键酶，最常用的DNA聚合酶是Taq聚合酶，因为它具有耐热性，能够在高温下保持酶活性。
- DNA聚合酶：在延伸步骤中，DNA聚合酶通过与引物结合以及dNTPs的加入，完成新DNA链的合成。
Taq聚合酶在延伸过程中能够保持酶活性，因此它是PCR反应中常用的酶。
-外切酶：在PCR反应中，外切酶用于切断PCR产物，以免产生错误的扩增产物。
-反转录酶：PCR反应也可用于合成DNA的互补RNA（cDNA），此时需要使用反转录酶将RNA转录为cDNA。
PCR基本原理及注意事项教材教学课件
本课程将深入介绍PCR技术的基本原理、注意事项以及在各个领域中的广泛 应用。希望通过这份教材教学课件，向大家分享我的专业知识和对PCR技术 的热爱。
PCR的定义和概述
PCR (聚合酶链式反应) 是一种体外扩增特定DNA片段的方法。它通过反复复制目标DNA，从而在短时 间内产生大量DNA。PCR已经成为现代生物学和医学领域中不可或缺的技术。
PCR中的不同温度环境和条件， 如变性温度、退火温度和延伸 温度，对PCR反应起着重要的 作用。
什么是PCR引物
PCR引物是一段能够与目标DNA序列互补配对的短链寡核苷酸。引物的选择和设计对PCR的成功至关 重要。
设计PCR引物的注意事项
引物长度
通常选择15-30个碱基的引物长度，以保证特 异性和效率。
由于引物的设计，PCR 可以选择性地扩增目标 序列，消除其他干扰。
PCR反应只需数分钟至 数小时即可产生大量 DNA，快速得到可靠的 结果。
PCR反应涉及的原理和基础
DNA结构
PCR利用了DNA的双螺旋结构 和DNA聚合酶的酶活性，实现 DNA的复制和扩增。
引物设计
温度控制
合适的引物设计对PCR结果至 关重要，需要考虑引物长度、 碱基组合和引物之间的互补性。
PCR反应的三个步骤
1
变性
将DNA变性为两条单链，使其可以作为模板。
2
退火
引物结合到目标序列，并使DNA聚合酶开始复制。
3
延伸
在适当的温度下，DNA聚合酶会从引物的3'端开始合成新的DNA链。
重复性PCR的技术优势
1 高灵敏度
2 高特异性
3 高速度
PCR可以检测极低浓度 的DNA，使其在病原体 检测和基因分析中得到 广泛应用。
PCR-技术及应用PPT课件
dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR 扩增效率有密切关系，一般将其PH调节到7.0～7.5， 小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L， 尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏 低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物 的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓 度降低。
PCR反应的特点
②灵敏度高：过去酶联免疫吸附试验（ELISA）和放射 免疫分析（RIA）其灵敏度分别为ng和pg级，而PCR检 测灵敏度可达fg级，理论上可检出一个细菌或一个真 核细胞的单拷贝基因的存在；
PCR反应的特点
③简便快速：操作试剂盒时只需将样品简单处理和加 样后即可进行扩增，许多PCR检查项目在两小时左右即 可出报告；④对样品要求低：几乎所有的临床标本都 可用于PCR扩增。
PCR条件的选择
引物：PCR反应成功扩增的一个关键条件在于正确设计寡核苷酸引物，所 选择的引物序列决定了PCR产物的大小、位置、扩增区域的Tm值等。
引物设计的长度一般为15-30个碱基，引物长点，反应的特异性相对好， 引物太长，扩增退火时被引发的模板数相对越少，影响反应效率。引 物短点，它退火结合到靶DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板 的速率越大，引物太短，则反应的特异性受到影响。
PCR技术的用途
科研使用 临床医学 法医学 农业 考古学 人类学 环境保护
个体识别与亲子鉴定 GMO
PCR应用类型
一、不对称PCR(asymmetric PCR)
不 对 称 PCR 的 目 的 是 扩 增 产 生 特 异 长 度 的 单 链 DNA。PCR反应中采用二种不同浓度的引物，PCR结 果产生大量单链DNA。因PCR反应中使用的二种引物 浓度不同一步法，因此称不对称PCR，此法产生的单 链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。
PCR技术的原理及其应用 ppt课件
2021/3/26
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模板：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键 环节之一。传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本。SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的 脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离 细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀； 蛋白 酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再 用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用
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酶浓度：催化PCR反应约需酶量1ul(总反应体系为100ul时)， 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。
dNTP的质量与浓度：注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配 制)。如其中任何一种浓度不同于其它几种时，就会引起错 配；浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结 合，使游离的Mg2+浓度降低。
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反向PCR的不足：
①需要从许多酶中选择限制酶，或者说必须选择一种 合适的酶进行酶切才能得到合理大小的DNA片段。这 种选择不能在非酶切位点切断靶DNA；
②大多数有核基因组含有大量中度和高度重复序列， 而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有时也会有这 些序列，这样，通过反向PCR得到的探针就有可能与多 个基因序列杂交。
pcr技术课件
pcr技术课件PCR技术课件PCR（Polymerase Chain Reaction）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因检测、疾病诊断、遗传学研究等领域。
本文将介绍PCR技术的原理、应用以及未来发展前景。
一、PCR技术的原理PCR技术基于DNA的复制原理，通过反复进行DNA的扩增，使得微量的DNA 样本在短时间内得到大量复制。
PCR反应一般包括三个步骤：变性、退火和延伸。
首先是变性步骤，将DNA样本加热至95°C，使DNA双链解开成两条单链。
接下来是退火步骤，将反应温度降至50-65°C，引入两个特异性引物（primers），它们能够与待扩增的DNA序列的两端互补结合。
引物的选择非常重要，它们决定了扩增的目标序列。
然后是延伸步骤，将反应温度升至72°C，引入DNA聚合酶（DNA polymerase），它能够将引物延伸，合成新的DNA链。
这个过程会重复多次，每次延伸会在目标序列的两侧合成新的DNA链，形成两个新的DNA分子。
通过不断重复这三个步骤，可以在短时间内扩增出大量的目标DNA序列。
PCR 技术的核心是DNA聚合酶，它具有耐高温的特性，可以在变性和延伸步骤中持续工作。
二、PCR技术的应用1. 基因检测：PCR技术可以用于检测基因突变、基因表达水平等。
例如，在肿瘤诊断中，可以通过PCR扩增出肿瘤相关基因的突变序列，从而帮助医生确定病情和治疗方案。
2. 疾病诊断：PCR技术在疾病诊断中起到了重要作用。
例如，通过PCR扩增出病原体的DNA序列，可以快速准确地诊断出感染病原体的种类和数量，从而指导治疗。
3. 遗传学研究：PCR技术可以用于分析个体的遗传信息，揭示遗传变异与疾病的关系。
例如，通过PCR扩增出人类基因组中的特定区域，可以研究基因多态性与疾病易感性之间的关联。
4. 法医学应用：PCR技术在法医学领域也有广泛应用。
通过PCR扩增出DNA样本中的特定序列，可以用于犯罪嫌疑人的DNA鉴定、亲子关系的确认等。
PCR技术的原理及应用ppt课件
PCR的基本原理
• •
PPCCRR反过应程条件72℃
• PCR的特点
第2轮结束
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模板DNA
第1轮扩增 第2轮扩增
• PCR反应条件
• 第PC3R轮过程扩增
• PCR的特点
PCR的基本原理
第4轮扩增 第5轮扩增
第6轮扩增
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提纲
实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR在医学和科研中的应用
PCR技术的原理及应用
1
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
DNA 解旋解链
5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC 合成引物 TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG
3’
子链延长
3’ 解旋酶解链酶
5’
2
PCR技术简史
• DNA的复制 • 核酸体外扩增的设想 • 聚合酶链反应的发明
（℃）
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DNA 2
形 成
子链延伸 DNA加倍
与引物复性
DNA双螺旋
重复1~3步 25~30轮
目的DNA片段 扩增100万倍以上
1
2
3
4
5
时间（min）
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PCR的基本原理
DNA引物
• •
PPCCRR反过应程条件9550℃
• PCR的特点
引物1
引物2
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PCR的基本原理
• •
DNA 5’ ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC
3’
解旋解链
GGAUC引G 物酶5‘
PCR技术的原理及其应用ppt课件
PCR反应五要素：
即参加PCR反应的五种主要物质：引物、酶、dNTP、模 板和Mg2+。
多重PCR的用途主要有两方面：
1.多种病原微生物的同时检测或鉴定，它是在同一PCR反应 管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩 增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体 感染。
2.病原微生物，某些遗传病及癌基因的分型鉴定:某些病原 微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失 存在多个突变部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其 型别及突变等。
合位点，一个与抗原抗体复合物中的抗体结合，一个与质粒 DNA结合，其基本原理与ELISA和免疫酶染色相似，不同之 处在于其中的标记物不是酶而是质粒DNA，在操作反应中 形成抗原抗体-连接分子-DNA复合物，通过PCR扩增DNA来 判断是否存在特异性抗原。
免疫PCR优点为：
①特异性较强，因为它建立在抗原抗体特异性反应的基础 上；
2.PCR技术的主要类型及其应用
原位PCR技术:
原位PCR就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了 具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术 的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜 力的新技术。
原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出 靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾病的 发病机理和临床过程及病理的转移有重大的实用价值。其 特异性和敏感性高于一般的PCR 。
5 PCR的技术原理PPT资料51页
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
变性(denaturation)：在某些理化因素作用下，DNA 分子互补碱基对之间的氢键断裂，使DNA双螺旋结构松散， 变成单链。
变性因素：加热、酸、碱、紫外线等。
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
Tm (melting temperature)：50%DNA分子变性时温 度称为熔解温度/解链温度。
一、PCR的基本原理
2、 PCR扩增步骤：
③引物的延伸（新链DNA的合成）70~75℃，30~60s （<2kb) 首次循环：引物从3’端开始延伸，延伸片段的5’端为
人工合成引物是特定的， 3’端没有固定的终止点，长短不
一。
5’
3’
3’
5
第二个循环：引物与新链结合’，由于后者5’端序列是
固定的末端，意味着5’端的序列就成为此次延伸片段3’端
DNA的序列：简单的—复性快；
DNA的浓度：高—复性快（分子多、碰撞机会多）；
DNA片段的大小：大—复性慢（分子大、运动慢）；
溶液的离子强度：高—复性快（中和DNA分子上的负电 荷，减少两条单链的同性相斥性）；
DNA部分复性，复性的速度非常快。
一、PCR的基本原理
2、 PCR扩增步骤：
①DNA模板的解链（变性） 90 ℃~95 ℃，30s
Tm = 69.3+0.41(G+C) % Tm = 4(G+C) +2(A+T) （<20bp）
一、PCR的基本原理
1、 PCR的基本原理
复性(renaturation)：变性的两条DNA单链在合适的条 件下，又可按原来的碱基配对，再结合在一起形成双螺旋 构象，又称退火。
试述pcr的原理和应用
试述PCR的原理和应用1. PCR的简介聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一种基因分析技术，通过反复复制特定DNA片段来放大目标基因序列。
PCR的原理基于DNA的复制过程，是一种非常重要的分子生物学技术，被广泛应用于医学、生物学、法医学等领域。
2. PCR的原理PCR基本上包括三个主要步骤：变性（Denaturation）、引物结合（Annealing）和延伸（Extension）。
2.1 变性（Denaturation）在这一步骤中，将PCR反应管中的DNA加热到较高的温度（通常为94-98°C），使DNA的双链结构解开，形成两条单链的DNA模板。
2.2 引物结合（Annealing）在引物结合步骤中，PCR反应管中加入缩温，使引物与单链DNA模板结合。
引物是两个互补的小片段DNA，它可以特异性地结合到目标DNA序列的两端。
2.3 延伸（Extension）在延伸步骤中，加入DNA聚合酶酶和四种核苷酸（dNTPs），在适当的温度下，引物结合的位置上的DNA聚合酶将在引物的两端开始合成新的DNA链。
这一步骤的结果是形成了两条与原始DNA序列相同的双链DNA。
3. PCR的应用PCR在许多科学领域中都有广泛的应用，以下列举了几个常见的应用场景：3.1 基因分型PCR可以用来检测特定基因的单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs），从而进行基因分型。
SNPs是不同个体之间存在的DNA序列差异，可以用于疾病的遗传风险评估、个体间的亲缘关系鉴定等。
3.2 病原体检测PCR可以通过寻找特定病原体的DNA或RNA来进行病原体检测。
对于未知的感染疾病，通过PCR扩增并检测特定的病原体DNA，可以快速准确地诊断出感染病原体。
3.3 DNA克隆和基因工程PCR是进行DNA克隆和基因工程的基础技术。
通过PCR可以扩增特定的DNA 片段，然后将其连接到质粒或其他载体上，从而实现DNA的克隆和基因的工程。
PCR技术原理与应用
PCR技术原理与应用一、实验目的：1、理解PCR的技术原理；2、了解PCR的应用领域二、实验原理：1 概念PCR（Polymerase chain reaction，聚合酶链式反应）是模拟体内DNA复制过程，对特定DNA序列进行大量扩增的一种技术。
PCR反应是以4种dNTP为底物，引物引导，DNA聚合酶催化作用下，在单链DNA模板3’末端开始进行互补链的延伸，多次反复的扩增使特定DNA序列以指数增加。
2、PCR反应体系参与PCR反应的物质主要为包括：引物、酶、dNTP、Buffer、模板和Mg2+。
2.1 引物引物是两段与待扩增靶DNA序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩增产物的两个5’末端位置。
PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。
引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应. 引物设计一般考虑以下几个方面：2.1.1 引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。
引物的长度一般为15-30bp，常用的是18～27bp，最佳为20～24bp。
引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。
2.1. 2 引物碱基构成引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在，3′端不应超过3个连续的G或C，因为这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。
两个引物中（g+c）%含量应尽量相似，在已知扩增片段（g+c）%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%～60%为佳，过高或过低都不利于引发反应。
Tm值是一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸互补双链解链的温度。
Tm=4（G+C）+2（A+T）。
两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸片段，否则两条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增目标DNA 或样品DNA的其它序列也不能存在6个以上碱基的同源序列。
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一、PCR基本工作原理
Template DNA
5 5
5 Cycle 1
5
Primer 1 5 Primer 2
5 5
5
Cycle 2
5
5 5 5
5 5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5 5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的 含量可以扩大100万倍以上。
（109拷贝）。
2、高度的特异性
引物 引物 引物的序列及其与模板结合的特异性是决定 PCR反应结果的关键。 引物设计的最大原则是最大限度地提高扩增效
率和特异性；同时尽可能减少非特异性扩增。
所谓特异性：只扩增引 物之间的DNA！
引物设计原则 （1）在高度保守区,与非扩增区无同源性。 （2）引物长度以15-40 bp为宜。 （3）碱基尽可能随机分布,G+C占40-60%。 （4）引物内部避免形成二级结构。 （5）两引物间避免有互补序列。
端polyA尾与之互补。
以人工合成的随机序列六核苷酸混
合物作为引物，进行扩增。
reverse transcription
mRNA 逆转录酶 杂化双链
ＤＮＡ聚合酶
cDNA
PCR扩增
RT-PCR
cDNA
9、荧光定量 PCR（real-time PCR)
通过荧光染料或荧光标记的特异性 的探针，对PCR产物进行标记跟踪,实 时在线监控反应过程，结合相应的软件 可以对结果进行分析，计算待测样品的
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ Poly(A) RNA
逆转录
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ M N TTTTTTTTTTTT 变性 5’
启动cDNA 第一链合成
M’N’AAAAAAAAAAAA(A)n 3’ 3‘ 5‘ T12MN 3’锚定引物 退火 寡核苷酸随机引物
.
原 理
DNA
解链 构像
4
5
1.为正常 2、4、5纯合患者 3.为杂合子
用PCR-SSCP技术发现我
第一例
LDH遗传变异病例
病例
21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L) 其余指标均正常 在三年的调查期间，LDH活力始终 处于较低水平，在 48-85 U/L之间
经排除其它原因，如血中的抑制剂 的存在、药物的影响等可能因素外，我 们怀疑可能有遗传性的 LDH 变异。根据 计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断 定为 H 亚基变异，采用合成的 7 对引物， 分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后 用 SSCP电泳法与正常人对照，发现变异 发生在外显子 4上，由此证明该病人的长 期低酶活力是有基因变异引起的。
5’
3’GG…GG CC…CC
5’
3’GG…GG CC…CC
6、PCR固相分析法
亲和固 相介质 模 板
PCR 扩增
探 针
检测探 针信号
生物素 化引物
可用于基因芯片的制作
7、原位PCR 原位聚合酶链式反应（In Still PCR，Is－
PCR）是利用完整的细胞作为一个微小的反应
体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的
（6）3’端为关键碱基；5’端无严格限制。
引物的快速设计
5’端照抄，3’端互补。
引物设计举例
GCAATATGGCGATCGAT· · · · · · · · CATACGTTACGGCATAATCCGACTA?
如何快速设计1对引物，将红色区域的 DNA片段扩增出来？
3、适用样品的广泛性
既可是DNA，也可是RNA；既可是 纯化的，又可是粗制的；既可是新鲜组织， 也可是陈旧样品；既可是细胞(刮片细胞、 培养细胞、血细胞），又可是体液（大小 便、血清、淋巴液等）；既可是完整的大 分子，也可是部分降解的DNA。
各种型号的PCR仪
聚合酶链式反应
（PCR：Polymerase Chain Reaction)
PCR是由美国科学家穆 利斯提出的一种体外DNA快 速扩增的方法，此技术获得 1993年诺贝尔化学奖。
Kary B. Mullis
PCR技术基础：体内DNA的复制
5’3’
拓扑异构酶 解旋酶类 SSB
DNA聚合酶（I II III） 引物 dNTP Mg2+
研究生课程
第五章 PCR技术及原理（4学时）
第一节
PCR的原理
Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize
锚定PCR首先合成第一链cDNA,然 后再添加一同聚物尾（polydG),与同聚 物尾配对的3’锚定引物（带有限制性内 切位点polydC)一起作PCR扩增。
PCR的局限：需了解靶基因片段两测的序列
对于未知序列和具有不同末端序列怎么办？
cDNA 末端核酸转移酶 3’GG…GG CC…CC 锚定引物
12、巢式PCR（nest PCR）
此时也是进行二步PCR，与上面不同的是，第二级
PCR需另行设置反应体系，并应用另外的PCR引物，此
时引物的位置位于初级PCR引物的内侧，用初级PCR产 物做模板，进行第二步PCR，这样只有初级PCR中特异 的扩增片段才能被二级引物扩增。 除了达到增效PCR同样的目的外，还提高了最终产 物的特异性。
PCR-SSCP分析原理示意
PCR-SSCP过程
过 程
--------------------------primer --------------------------↓ 32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 ↓ 变性 ↓ 单链DNA ↓ 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 ↓ 1 2 3 自显影 ↓ 结果分析
在肿瘤发生血道转移时，外周血 中有少量肿瘤细胞残留。用灵敏、特异 的技术检测到这些肿瘤细胞中CEA基
因的转录本，是发现肿瘤早期转移的关
键。
10、基因的体外诱变
11、增效PCR（booster PCR）
当扩增少于1000拷贝的模板DNA时会遇到 两个问题：一是形成引物二聚体，一是非特异扩 增。消耗了引物和酶，而特异扩增产量降低。 对于这种情况，可设置二步PCR，先用较低 浓度的引物进行初级PCR，此时由于引物少，形 成产物二聚体的可能减少，但它并不影响靶序列 的扩增，只是由于引物少产量不高。约经15~20 个循环后补充引物量，以初级PCR产物为模板进 行扩增，靶序列的产量将相应增加。
13、差异显示PCR（differential display ）
一种以逆转录PCR为基础的研究基 因表达差异的技术。
DD-PCR主要用于肿瘤和多种疾病
的分子遗传学研究，是目前筛选基因表
达差异最有效的方法。
差异显示RT-PCR(Differential display RT-PCR)
5’ T12MN(M为A、G、C， 5’ T12MN 3’ N为A、T、G、C) 锚定引物 5’ 3‘ 5’
延伸
72˚C
退火 Tm-5˚C
根据PCR反应，能否 设计一个简易PCR仪？
简易的PCR反应
94℃ 变性
55℃ 退火 PCR循环
72℃ 延伸
四、PCR技术的特点
1、高度灵敏性； 2、高度特异性； 3、样品广泛的适应性； 4、操作简单。
1、高度的灵敏性
PCR产物每轮循环增加一倍； 30
轮循环后，扩增量达100万个拷贝
A.阳性对照
B.阴性对照
C.原位检测mRNA表达
8、逆转录PCR（RT-PCR）
以细胞内总RNA或mRNA为材料 进行体外扩增的技术。
主要用于克隆 cDNA、合成cDNA
探针，检测RNA病毒、分析基因表达
等。
逆转录生成cDNA方式： 以随机进行的PCR扩增所需的下游 引物作为逆转录反应的引物。 以oligo(dT)作为引物， mRNA3`末
PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n
(n 为循环次数)
PCR扩增的平台效应（plateau effect）
PCR扩增的 平台效应
是不是cycles 越多越好？
二、PCR体系基本组分
模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
三、PCR的反应步骤
变性 95˚C
4、操作简便易行
PCR扩增，只需数小时，就可以扩 增出大量的DNA片段，可用于检测基因 组中仅含数个拷贝的模板序列。 扩增产物一般用电泳分析，不一定 要用同位素，无放射性污染、易推广。
五、几种重要的PCR衍生技术
1、不对称PCR技术； 2、反向PCR技术； 3、多重PCR技术； 4、引物标记PCR技术； 5、实时PCR技术。 …………………………..
前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内
的扩增产物。
直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单
个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位
和检测病理切片中含量较少的靶序列。
操作步骤
1. 细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适 于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）进入
2. PCR扩增细胞内目的片段 3. 原位杂交检测扩增产物
引物 1 2
3
4 43 2 1
电 泳
DMD：人类肌营养不良基因
A：无外显子8,12,17,19对应 条带,说明病人外显子8～19 缺失 B：病人A中未扩增外显子 带的强度为C的一半,提示为 区域缺失携带者
C：正常人DMD基因外显子 的一般扩增形式
多重PCR检测DMD基因缺失
在同一反应体系中加入多对引物，同时扩增一份 DNA样本中多个不同序列的靶片段。