M TT 比色法测定细胞生长曲线 - 资料中心 - 生物在线

M TT比色法测定细胞生长曲线

郝新保　张利朝　殷　缨　韩秀珍　陶秦渝　郝晓柯　张盈华(第四军医大学唐都医院中心实验室　西安710038)

关键词　细胞生长曲线　M T T比色法

中图号　Q28

在有关肿瘤细胞生物学的研究中,我们常常要测定细胞的生长状态,制作细胞生长曲线,以往的方法是取少量细胞在镜下或计数仪中计数,然后标注在坐标纸上,制作出细胞生长曲线.这种方法对同一样品要求计数几次取平均值,不但操作繁琐、费时,更主要的是误差较大,可达到20%～30%[1],包括取样误差、计数误差等.为了能简便、准确地测定细胞数,我们建立了基于M T T比色法的细胞生长曲线制作方法.

1　材料和方法

1.1　试剂　R P M I1640培养基为G I BCO公司产品,小牛血清为杭州四季青产品,M T T为SERV E产品,其它试剂均为国产.

1.2　仪器　HL22029P型酶标自动分析仪为国营二六二厂产品,P rofile ,E lite型流式细胞仪为美国COUL T ER 公司产品.

1.3　细胞培养　选用人乳腺癌细胞系SK2BR23.细胞培养在含10%小牛血清的R P M I1640培养基中,37℃,5% CO

2.

1.4　镜下计数测定细胞数　细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,用计数板按常规方法在倒置显微镜下计数,每个样品测三次,取平均值.

1.5　流式细胞仪计数　细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,取0.2m l细胞过滤后用流式细胞仪自动计数.

1.6　M T T比色法计数　M T T比色法计数为间接计数,先要做出细胞的标准曲线,然后根据欲测样品的A值计算出相应的细胞数.

1.6.1　制作标准曲线　准备细胞悬液,从1×107细胞 200Λl 孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞 孔,每个稀释度三孔细胞,培养板置37℃培养4h后细胞贴壁,每孔中加入20Λg M T T继续培养4h,然后吸出150Λl培养液,加入等量DM SO,37℃20m in,570nm处测定吸光度[2],用二六二厂酶标自动分析仪程序绘出细胞标准浓度曲线.

1.6.2　制作生长曲线　调整细胞的浓度,按2×103 孔接种在96孔板中,置37℃培养,每天用M T T比色法测定3孔细胞的A值,在标准曲线上计算出相应的细胞数,即可绘出细胞的生长曲线.

郝新保,男,32岁,讲师,主治医师2　结果

2.1　细胞数与A值的标准曲线　根据各稀释度的A值制作细胞浓度的标准曲线,

如图1.

图1　SK2BR23细胞浓度的标准曲线

2.2　肿瘤细胞的M T T比色法生长曲线　根据每天测定的三孔细胞的A值在标准曲线上求得其对应的细胞数,7～10d

后即可绘制细胞生长曲线,如图2.

图2　SK2BR23细胞的生长曲线

2×;--0.2×;…20×.

2.3　细胞接种密度对生长曲线的影响　当细胞接种密度较低(2×102 孔)和较高(2×104 孔)时,对细胞生长曲线的形状有一定的影响,如图2.

2.4　M T T比色法与镜下计数法及流式细胞仪计数法的比较　为了比较M T T比色法和镜下计数法制作的细胞生长曲线,用流式细胞仪的计数结果作为参照,结果表明M T T 比色法与流式细胞仪计数结果更接近,明显优于镜下计数法的结果.

3　讨论　从结果可以看出,用M T T比色法制作细胞生长

曲线完全可行.因其减少了取样和计数误差,免除了贴壁细胞的消化等,使其具有简便、快速的特点.对几种不同方法制作的生长曲线进行比较发现,M T T 比色法在客观性上也比镜下计数法有了很大的提高.要掌握好这个方法首要的一点是标准曲线的制作,稀释一定要准确,在保证标准曲线如实反映细胞数的基础上,才能制作出好的生长曲线.

在测定时,接种细胞的密度对生长曲线的影响较大.从图2可以看出,接种密度过高或过低都不利于生长曲线的制作,这与细胞的生长能力有关,可进行简单的预实验确定,一般在(1～5)×103细胞 孔为好.

尽管M T T 比色法测定细胞生长曲线具有很多优点,

但因其需要使用自动酶标仪而受到了一定的限制,如果能开发出细胞生长曲线专用软件,就能摆脱自动酶标仪的限制,利用普通酶标仪就可以开展工作了.参考文献

1鄂　征.组织培养技术.第2版.北京:人民卫生出版社,1993:154

2候　健,孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志,1993;16(4):208～210

(收稿1996-09-17　修回1997-02-04)

编辑　王小仲

化云宁滴眼液的质控标准

王　颖　雷其云　蒋永培　樊亚萱 (第四军医大学西京医院药局　西安710033)

关键词　化云宁　钾离子　耐缺氧　质量控制　刺激性中图号　R 289

我院研制的新药化云宁滴眼液为一复方中药制剂,具有活血化瘀、退翳明目的功效,是治疗角膜瘢痕(角膜云翳,角膜斑翳)的理想药物.在化云宁研制和生产的质量控制上,我们采用了钾离子(K +)含量测定、刺激性实验及生物检定方法作为质控标准,保证了化云宁滴眼液在临床上安全和有效地使用.

1　材料和方法

1.1　药物与试剂　化云宁滴眼液由丹参、黄芩和金银花

等生药的提取液按眼药常规要求制备而成;心得安注射液

(1m g m l ,批号830706,北京制药厂);丹参素注射液(10m g m l ,批号820401,上海医科大学附属中山医院制);生

理盐水(2m l 支,批号8303023,自制).

1.2　实验动物　BALB c 小鼠,雄性,6

～8周龄,体重18～21g ;新西兰白兔2只,雄性,编号分别为543,554,体重分别为2.05kg 和2.45kg (以上动物均由本校实验动物研究中心提供).

1.3　K +含量测定[1]　用System E 4A 型火焰光度计(美国BECK M AN 公司制造)分别测定化云宁滴眼液成品及其组

方中各味药的提取液(丹参,黄芩,金银花等)中K +浓度.样品在测定前均用N aOH 调pH 值至6.8～7.0.

1.4　刺激性实验　采用家兔滴眼法.选取健康新西兰白

兔2只,编号分别为543,554,用药前,检察兔眼结膜血管、角膜透明度等均属正常,如①结膜无血丝及发红;②

王　颖,女,42岁,主管药师

角膜不浑浊,呈透明状;③眼角无分泌物.左眼点化云宁滴眼液2滴(批号850619),右眼点生理盐水2滴作为对照,用药后开始记录时间,并观察眼部反应情况.结果判定以上述用药前检察的①～③项指标无异常为无刺激症状表现

(-),否则为被检眼药有刺激性(+).

1.5　常压耐缺氧实验　按表2中的剂量,小鼠腹腔(注射)

给药(批号830509,自制)后30m in ,放入容量为250m l 的磨口玻璃瓶中,瓶内放钠石灰5g ,每瓶放小鼠一只,放入后用凡士林密封盖紧,并开始记录其存活时间[2].以生理盐水组为对照,比较各组间统计学上的差异,统计学处理采用t 检验.

2　结果

2.1　药液中K +浓度的测定　在中药滴眼液与中药注射液

中常含有来源于植物药材本身的K +,其浓度过高可引起局部疼痛.我们采用中草药注射液的K +浓度限定范围[40%～60%(m g m l )以下][3]做为化云宁滴眼液的质控标准之一.六个批号的化云宁滴眼液中K +浓度测定的结果见表1,均符合限定标准.此外,对化云宁滴眼液中丹参,黄芩和金银花三种主药提取液的K +浓度也分别进行了检测,结果(三次测定的平均值)分别为47.6%,0.8%和

1.2%(m g m l ),由此可见,该滴眼液中的K +主要来源于

丹参.

2.2　刺激性实验　经2只新西兰白兔左、右眼对照实验观

察,除1只兔左眼在用药液后15m in 时观察有轻度流泪外,其余均无任何刺激性反应.因此,该眼药符合有关规定.