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细胞增殖实验(MTT assay)

MTT实验一．实验原理检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm(可参比630nm)波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）二．溶液配制将MTT粉末用PBS配制成5mg/ml的储液，0.22μm的小滤头过滤除菌后，分装到灭菌的EP管中1ml/管，-20℃避光保存；使用时，将其用DMEM+10%FBS的培养基稀释10倍至终浓度0.5mg/ml进行细胞活性试验测定。

三．实验步骤1.细胞的准备：选择接近对数期生长的细胞，胰酶消化终止后，离心沉淀细胞去上清，正常培养基重新悬浮细胞；细胞计数板计数，对MDA-MB-231细胞，利用培养基将细胞浓度调整至20000个/ml，然后利用八连排移液器，依次取100μL细胞悬液加入96孔板中，此时每孔的细胞数约为2000个，根据实验的组数及需要测定的天数接种适当的孔数和板数，通常每个实验组设置3-6个重复。

2.细胞的培养与处理：当进行加药处理时，通常选择接种12h后，进行首次细胞活性测定，作为本底值；同时将相应的实验组加入对应的处理，根据药物作用时间选择合适的点进行选择时间进行细胞的活性测定。

（在进行TGF-beta对细胞增殖的抑制试验时，选择5ng/ml的TGF-beta持续处理4d，并每天选择一块板进行测量，来绘制细胞的增值曲线；实验中注意根据细胞的生长状况选择两天换液一次。

）3.MTT的反应与结晶的生成：测定时，先将MTT原液用DMEM+10%FBS的培养基稀释至工作浓度0.5mg/ml，然后用移液器吸出原来的培养基，每孔加入含0.5mg/ml MTT的培养基；37℃，5%CO2条件下，继续对细胞培养3-5h，待结晶的生成。

细胞生长曲线的测定

细胞生长曲线的测定细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部分。

以存活细胞数(万／mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

测定细胞生长曲线有三种常用的方法，计数法、MTT法和CCK-8法，下面就这几种常用方法做详细说明。

计数法1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。

根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养3．24 h后开始计数细胞，以后每隔24 h计数一次，计算平均值，连续计数7 d4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT法1．取对数生长期细胞，用胰酶消化收集，调整单细胞悬液密度为104~105/mL视细胞贴壁后的大小，倍增时间等因素确定接种密度。

根据需要接种到96或24孔板中，每天每组三复孔，切记各孔的接种密度一致2．置37℃、5％CO2气相和饱和湿度的CO2培养箱中培养3．24 h后开始检测细胞生长情况，制备1 mL细胞悬液。

空白对照以1 mL培养基代替细胞悬液。

加入0．1 mL MTT于37℃孵育4 h，使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶4．加1 mL DTW脱色液，37℃至少静置30 min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解5．吸取200 μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570 nm，参考波长630 nm。

MTT分解比色法测定细胞生存和增殖

MTT reduction - a tetrazolium-based colorimetric assay for cell survival and proliferationContributed byJoan M. ChapdelainePharmakon Research International, Inc.Waverly, PA, 18471INTRODUCTIONIn 1983, a quantitative colorimetric assay for mammalian cell survival and cell prolifera-tion was proposed by Mosmann.1 The assay is dependent on the reduction of the tetrazo-lium salt MTT (3-(4,5-dimethylthazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) by the mitochondrial dehydrogenase of viable cells to form a blue formazan product. The assay measures cell respiration and the amount of formazan produced is proportional to the number of living cells present in culture. The assay has been shown to be a simple, rapid alternative to counting cells by dye inclusion/exclusion, monitoring the release of 51Cr from lysed cells, or the incorporation of [3H]-thymidine into cellular DNA. The MTT assay has been used with a growing number of cell types including primary cultured cells as well as established cell lines. This colorimetric microplate assay is cost effectivebecause of the number of tests which can be performed at one time without the problem of radio-isotope and contaminated materials disposal.Applications of the MTT assayThe use of the colorimetric assay for cell growth and cell survival offers major advantages in speed, simplicity, cost, and safety over conventional cell counting assays. Figure 1 shows in a block diagram form how the MTT assay can be substituted for the thymidine uptake assay. The MTT assay has fewer steps, uses fewer materials, and does not carry the added burden of radioactive waste disposal.Application Note5The sensitivity of the MTT assay is dependent on the cell type, their average metabolic status, and the technique selected for solubilizing the formazan crystals. For example, the MTT assay was shown to detect as few as 200 EL4.3 cells per well and was linear to 50,000 cells per well.1 Whereas the sensitivity for T-cell blasts, which produce less forma-2The MTT assay, like the dye exclusion assay, must be optimized for seeding conditions and assay duration to obtain satisfactory results. A standard curve for formazan production as a function of the cell number and the growth rate should be determined for each cell type. Once optimized the MTT assay has proven to be adaptable to the needs of the exper-imental design and has been shown to be a practical method in a variety of applications: 1Mosmann1 reported using the MTT assay to measure proliferative lymphokines, mito-gen stimulations, and complement-mediated lysis.2Cell activation levels have been quantified independent of proliferation.33Cell viability assays could be run more rapidly using MTT rather than counting cells using trypan blue exclusion.44This colorimetric assay had been used with anti-proliferative monoclonal antibodies,5 growth factors,2,6 and chemotherapeutic screening.7, 85Tada et.al.6 showed the quantitative assay for interleukin 2 using the MTT assay to be equivalent to the [3H]-thymidine incorporation assay. The mean of the standard errors for the MTT assay was 3.9% as compared to 3.5% observed in the [3H]-thymidine incorporation assay and the results from the two assays were shown to agree.METHODS AND MODIFICATIONS Table 1 is a summary of various MTT colorimetric assay methods. The MTT assay as developed by Mosmann1 uses the same standard 96 well flat bottom tissue culture plate for the initial incubation of the cells and assaying for the cell number. At the end of the ini-tial incubation, a small volume of an MTT solution was added to each well of the culture plate. The plate was incubated to allow the formazan crystals to accumulate. The crystals were solubilized by the addition of an acidic alcohol solution before making an optical density measurement.To obtain complete mixing of the acidic alcohol solution with the media, the liquid in each wells had to be manually agitated with a pipet. The alcohol solubilized the formazan crys-tals and the acid lowered the pH of the medium to minimize interference due to the phenol red indicator which would interfere with the formazan reading. The yellow, acidic form ofthe dye does not interfere. The plates were read at 570 nm with a 630 nm reference to negate the effect of cell debris and precipitated proteins which may be produced by the acidic alcohol addition.Table 1: Summary table of MTT colorimetric assay methods.Denizot and Lang 2 found the tetrazolium dye assay as described by Mosmann to be less sensitive than the [3H]-thymidine uptake assay for their application. They modified the MTT method to improve sensitivity and performance. They used a microplate with a smaller well volume, doubled the MTT concentration, and dissolved it in a serum free media without the phenol red indicator. The unreacted MTT was removed from the centri-fuged plate before solubilizing the formazan crystals with isopropanol. Removing the serum proteins and the phenol red indicator reduced the background optical density and the need for an acidic solvent, respectively. Finally, a different reference wavelength, 690 nm, was selected which increased the signal by about 25%. The authors report that these modifications improved the sensitivity of the MTT assay 2- to 4-fold over the Mosmann procedure.T. Mosmann 1F. Denizot & R. Lang 2 H. Tada et.al. 6JChapdelaine Unpublished M.B. Hansen,et al. 9 J. Carmichael, et al. 7Sample V olume 0.1 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.2 mL 0.1 mL 0.2 mL Intermediate Steps None Remove medium None None None ul None MTT V olume 10 µL 10 µL 20 µL 20 µL 25 µL 50 µL Concentratio n 5 mg/mL 5 mg/mL 5 mg/mL 10 mg/mL 5 mg/mL 2 mg/mL MTT Incubation4 Hours3 Hours4.5 Hours4 Hours2 Hours4 HoursAdherent CellsNonadherent Cells Intermediate StepsNoneCentrifuge microplates, remove unreacted MTTNoneRemove 180 µL mediumNoneRemove all mediumCentrifuge microplates, remove 170 µL mediumSolubilize Formazan V olume 150 µL 50 µL 100 µL 180 µL 100 µL 100 µL 100 µL SolventIsopropanol/HCl Isopropanol10% SDS in 0.01 M HCl10% SDS20% SDS in 50% DMF, pH 4.7Mineral oilDMSOIncubation 5 Minutes 1 Minute with shaking Overnight at 37°C Overnight at37°C Overnight at 37°C Overnight at 40°C 5 Minutes Read 570 - 630 nm 560 - 690 nm590 nm570 - 650 nm 570 nm 565 nm540 nmComments:•Serum proteins precipitate with acid/alcohol 1,2,6 •Mechanical mixing required to solubilize formazan 1,6 •Plates read with in 1 hour 1•Use half-area microplates 2 •Use serum free mediumto eliminateproteinprecipitation 2 •No phenol red 2•Use a detergent todissolveformazan 6 •Good mixing without added agitation 6 •Stable color 6 •Less protein precipitation 6•Higher detergent concentration •No acid to precipitate proteins•Phenol red in medium is not a problem since medium is removed•Improved solubilization of formazan crystals 9•More signal relative to acid/alcoholor acid/SDS solubilization 9 •Improved signal relative to alcoholsolubilization 7 •Stable color 7 •Lessreproducible 7 •Signalintensitydepends onresidual medium volume 7•Unstable color7Tada et. al.6 re-examined the MTT assay in detail and modified the assay to make it possi-ble to measure a larger number of samples at one time with less labor and with greateraccuracy. The MTT concentration was doubled and the incubation time was increased bya half an hour. The most significant modification was in how the formazan crystals weredissolved. In place of the acidic alcohol solution, an acidic detergent solution was substi-tuted. This modification resolved two drawbacks with the previously described MTTassay. First, the acidic detergent solution mixed well with the growth medium thus elimi-nating the need to mix each well and, second, the removal of the alcohol reduced the like-lihood of serum protein precipitation. Variations of this method have since beendeveloped. Chapdelaine (unpublished) removes the medium from the well of the tissueculture plate before adding the detergent solution, thus eliminating the need to acidify themedium. Hansen et. al.9 used a buffered detergent and added dimethyl formamide (DMF)to improve the solubilization of the formazan crystals.Carmichael et. al.7,8 modified the MTT assay and developed two protocols: one for adher-ent and the other for nonadherent cell lines. For adherent cells, the media was aspiratedfrom the wells and mineral oil was used to dissolve the formazan crystals because it is rel-atively nontoxic. The plates were read at 570 nm. Plates with nonadherent cells were cen-trifuged after the incubation with the MTT. The medium was aspirated from the wellsleaving about 30 µL behind. The formazan crystals were solubilized with dimethyl sulfox-ide (DMSO) which rapidly solubilized the formazan crystals but produced an unstablecolor. The absorbance plate was read using a 540 nm filter within minutes. CONCLUSION A problem with the MTT assay, the difficulty of solubilizing the formazan crystals with-out precipitation of serum proteins, may be mitigated by using more effective solubilizingagents and alternate procedures. Precipitated protein and cellular debris present in the cul-ture plate wells are a potential source of experimental error because they interfere with theoptical readings. Dual wavelength photometry, reading the plates at a principle and a ref-erence wavelength, is used to cancel out the effect of the debris. If the interfering materialshifts position between readings, the benefit of dual wavelength photometry is lost. TheMAXline microplate readers do not move the microplate during the read thus reducing thechance of debris shifting. The result is better precision and an assurance that the micro-plate reader is not a source of experimental variation.REFERENCES1Mosmann, T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application toproliferation and cytotoxicity assays. J. Immunol. Methods 65: 55-63 (1983).2Denizot, F. and Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modi-fication to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.J. Immunol. Methods 89:271-277 (1986).3Gerlier, D. and Thomasset, T. Use of MTT colorimetric assay to measure cell activa-tion. J. Immunol. Methods 94:57-63 (1986).4Penit, C. and Papiernik, M. Regulation of thymocyte proliferation and survival bydeoxynucleosides. Deoxycytidine produced by thymic accessory cells protect thy-mocytes from deoxyguanosine toxicity and stimulates their spontaneous proliferation.Eur. J. Immunol. 16:257-263 (1986).5Vaickus, L. and Levy, R. Antiproliferative monoclonal antibodies: Detection and ini-tial characterization. J. Immunol. 135:1987-1997 (1985).6Tada, H., Shiho, O., Kuroshima, K., Koyama, M., and Tsukamato, K. An improvedcolorimetric assay for interleukin 2. J. Immunol. Methods 93:157-165 (1986).7Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J.D., and Mitchell, J. B. Evalua-tion of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay. Assessment ofchemosensitivity testing. Cancer Res. 47:936-942 (1987).8Carmichael, J., DeGraff, W.G., Gazdar, A.F., Minna, J.D., and Mitchell, J. B. Evalua-tion of a tetrazolium-based semiautomated colorimetric assay. Assessment of radiosen-sitivity. Cancer Res. 47: 943-946 (1987).9Hansen, M.B., Nielsen, S.E., and Berg, K. Re-examination and further development ofa precise and rapid dye method for measuring cell growth/cell kill. J. Immunol. Meth-ods 119:203-210 (1989).0120-0114A TRADEMARKS: SPECTRAmax, SPECTRAplate, and MAXline are trademarks of Molecular Devices Corporation. SOFTmax is a registered trademark of Molecular Devices Corporation..。

细胞生长曲线实验

细胞生长曲线实验细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。

以存活细胞数(万/mL)对培养时间(h或d)作图，即得生长曲线。

实验方法原理细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是判定细胞活力的重要指标。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，典型的生长曲线可分为生长缓慢的潜伏期，斜率较大的指数生长期，呈平台状的平顶期及退化衰亡4个部细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，是判定细胞活力的重要指标。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期。

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。

分。

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验材料细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板细胞试剂、试剂盒D-Hanks液牛血清 RPMI1640 双抗 0.08%胰酶仪器、耗材净化工作台离心机恒温水浴箱冰箱倒置相差显微镜培养箱吸管培养瓶吸头枪头 24培养板胶塞微量加样枪红血球计数板实验步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液。

MTT检测法

MTT法检测细胞存活和生长MTT全称为3—（4,5-Dimethylthiazol—2—yl)-2，5—diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为3—(4，5—二甲基噻唑-2)-2，5—二苯基四氮唑溴盐,商品名:噻唑蓝.是一种黄颜色的染料。

又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值,可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水,需被溶解后才能检测.这不仅使工作量增加,也会对实验结果的准确性产生影响,而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常,此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0。

5克,溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS)或无酚红的培养基中,用0。

22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

在配制和保存的过程中,容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是,MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0。

7 范围内.MTT一般最好现用现配,过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在—20度长期保存,避免反复冻融，最好小剂量分装,用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配,直接往培养板中加，没必要一下子配那么多，尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT法原理步骤

MTT法原理步骤细胞的增殖检测（MTT法）MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法，该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济，但由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

一、检测原理MTT全称为3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐（商品名：噻唑蓝），是一种黄颜色的染料。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值（也有用570nm波长)，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

二、试剂材料准备与实验仪器1、对数生长期细胞2、受试因素（药物）3、5mg.mL-1MTT溶液：称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中（60℃水浴助溶），用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可，在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（PBS配方：NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4 1.44g，KH2PO4 0.24g，调pH 7.4 ，定容1L）4、DMSO（二甲基亚砜）5、96孔板6、酶联免疫检测仪7、细胞培养箱三、MTT法实验步骤（一）普通MTT法实验步骤1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

细胞生长曲线的测定

细胞生长曲线的测定细胞生长曲线的测定一：背景与原理生长曲线是测定细胞生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。

一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后渡过长短不同的潜伏期，即进入快速生长的指数生长期。

在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入平台期，然后退化衰亡。

为了准确描述整个过程中细胞数目的动态变化，需连续对细胞进行计数。

通常计数6天。

为精确起见，一般每次实验设3个平行重复。

【晶莱生物】二：材料、试剂与仪器1. 实验材料Hela细胞系。

2. 实验试剂DMEM培养基（青霉素，链霉素，10%血清），0.25%胰蛋白酶溶液，台酚蓝染液。

3. 实验仪器超净工作台，CO2培养箱，倒置显微镜，微量移液器，血细胞计数板，培养瓶，离心管，移液管，废液缸，盖玻片，24孔板。

三：方法与步骤1.取生长良好的细胞，用培养基制成细胞悬液后计数。

根据细胞计数结果按5×104/mL作传代培养接种于24孔板中，共接种21孔细胞。

1 ml/孔。

余下三孔可设传代培养的对照。

2.24h后每天记录细胞数目，每次取3孔细胞，分别进行计数。

计算平均值。

连续计数7d。

细胞用胰酶消化后加入一定量的培养基，混匀制成细胞悬液。

取少量悬液与台酚蓝1:1混合。

取一干净的血细胞计数板，盖上盖片，从盖片两边滴入细胞悬液使之充满计数板和盖片之间。

注意滴液勿有气泡，也不能太多，否则会使盖片浮起而使细胞计数不准。

3.低倍镜下观察，活细胞不着色，台盼蓝着色的细胞呈深蓝色，是不健康或已死亡的细胞，不能计数。

找出计数板上的方格，计算四角大格内总细胞数，压大格线者只计左侧和上方，不计右侧和下方细胞悬液中细胞密度计算公式为：细胞数/mL=（四角大格内细胞数/4）×104×24.根据细胞计数结果，以单位细胞数（细胞数/mL）为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。

MTT比色法测定细胞生长曲线_郝新保

MTT比色法测定细胞生长曲线郝新保　张利朝　殷　缨　韩秀珍　陶秦渝　郝晓柯　张盈华(第四军医大学唐都医院中心实验室　西安710038)关键词　细胞生长曲线　M T T比色法中图号　Q28 在有关肿瘤细胞生物学的研究中,我们常常要测定细胞的生长状态,制作细胞生长曲线,以往的方法是取少量细胞在镜下或计数仪中计数,然后标注在坐标纸上,制作出细胞生长曲线.这种方法对同一样品要求计数几次取平均值,不但操作繁琐、费时,更主要的是误差较大,可达到20%～30%[1],包括取样误差、计数误差等.为了能简便、准确地测定细胞数,我们建立了基于M T T比色法的细胞生长曲线制作方法.1　材料和方法1.1　试剂　R PM I1640培养基为GIBCO公司产品,小牛血清为杭州四季青产品,M T T为SERV E产品,其它试剂均为国产.1.2　仪器　HL-2029P型酶标自动分析仪为国营二六二厂产品,Pr ofileⅡ,Elite型流式细胞仪为美国CO U L T ER 公司产品.1.3　细胞培养　选用人乳腺癌细胞系SK-BR-3.细胞培养在含10%小牛血清的RPM I1640培养基中,37℃,5% CO2.1.4　镜下计数测定细胞数　细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,用计数板按常规方法在倒置显微镜下计数,每个样品测三次,取平均值.1.5　流式细胞仪计数　细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,取0.2ml细胞过滤后用流式细胞仪自动计数.1.6　M T T比色法计数　M T T比色法计数为间接计数,先要做出细胞的标准曲线,然后根据欲测样品的A值计算出相应的细胞数.1.6.1　制作标准曲线　准备细胞悬液,从1×107细胞/200μl/孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞/孔,每个稀释度三孔细胞,培养板置37℃培养4h后细胞贴壁,每孔中加入20μg M T T继续培养4h,然后吸出150μl培养液,加入等量DM SO,37℃20min,570nm处测定吸光度[2],用二六二厂酶标自动分析仪程序绘出细胞标准浓度曲线.1.6.2　制作生长曲线　调整细胞的浓度,按2×103/孔接种在96孔板中,置37℃培养,每天用M T T比色法测定3孔细胞的A值,在标准曲线上计算出相应的细胞数,即可绘出细胞的生长曲线.郝新保,男,32岁,讲师,主治医师2　结果2.1　细胞数与A值的标准曲线　根据各稀释度的A值制作细胞浓度的标准曲线,如图1.图1　SK-BR-3细胞浓度的标准曲线2.2　肿瘤细胞的M T T比色法生长曲线　根据每天测定的三孔细胞的A值在标准曲线上求得其对应的细胞数,7～10d后即可绘制细胞生长曲线,如图2.图2　SK-BR-3细胞的生长曲线2×;--0.2×;…20×.2.3　细胞接种密度对生长曲线的影响　当细胞接种密度较低(2×102/孔)和较高(2×104/孔)时,对细胞生长曲线的形状有一定的影响,如图2.2.4　M T T比色法与镜下计数法及流式细胞仪计数法的比较　为了比较M T T比色法和镜下计数法制作的细胞生长曲线,用流式细胞仪的计数结果作为参照,结果表明M T T 比色法与流式细胞仪计数结果更接近,明显优于镜下计数法的结果.3　讨论　从结果可以看出,用M T T比色法制作细胞生长曲线完全可行.因其减少了取样和计数误差,免除了贴壁细胞的消化等,使其具有简便、快速的特点.对几种不同方法制作的生长曲线进行比较发现,M T T比色法在客观性上也比镜下计数法有了很大的提高.要掌握好这个方法首要的一点是标准曲线的制作,稀释一定要准确,在保证标准曲线如实反映细胞数的基础上,才能制作出好的生长曲线.在测定时,接种细胞的密度对生长曲线的影响较大.从图2可以看出,接种密度过高或过低都不利于生长曲线的制作,这与细胞的生长能力有关,可进行简单的预实验确定,一般在(1～5)×103细胞/孔为好.尽管M T T比色法测定细胞生长曲线具有很多优点,但因其需要使用自动酶标仪而受到了一定的限制,如果能开发出细胞生长曲线专用软件,就能摆脱自动酶标仪的限制,利用普通酶标仪就可以开展工作了.参考文献1鄂　征.组织培养技术.第2版.北京:人民卫生出版社,1993: 1542候　健,孔宪涛.四甲基偶氮唑蓝比色法检测人血清白细胞介素6.中华医学检验杂志,1993;16(4):208～210(收稿1996-09-17　修回1997-02-04)编辑　王小仲化云宁滴眼液的质控标准王　颖　雷其云　蒋永培　樊亚萱 (第四军医大学西京医院药局　西安710033)关键词　化云宁　钾离子　耐缺氧　质量控制　刺激性中图号　R289 我院研制的新药化云宁滴眼液为一复方中药制剂,具有活血化瘀、退翳明目的功效,是治疗角膜瘢痕(角膜云翳,角膜斑翳)的理想药物.在化云宁研制和生产的质量控制上,我们采用了钾离子(K+)含量测定、刺激性实验及生物检定方法作为质控标准,保证了化云宁滴眼液在临床上安全和有效地使用.1　材料和方法1.1　药物与试剂　化云宁滴眼液由丹参、黄芩和金银花等生药的提取液按眼药常规要求制备而成;心得安注射液(1mg/ml,批号830706,北京制药厂);丹参素注射液(10 mg/ml,批号820401,上海医科大学附属中山医院制);生理盐水(2ml/支,批号8303023,自制).1.2　实验动物　BA L B/c小鼠,雄性,6～8周龄,体重18～21g;新西兰白兔2只,雄性,编号分别为543,554,体重分别为2.05kg和2.45kg(以上动物均由本校实验动物研究中心提供).1.3　K+含量测定[1]　用System E4A型火焰光度计(美国BECKM AN公司制造)分别测定化云宁滴眼液成品及其组方中各味药的提取液(丹参,黄芩,金银花等)中K+浓度.样品在测定前均用N aO H调p H值至6.8～7.0.1.4　刺激性实验　采用家兔滴眼法.选取健康新西兰白兔2只,编号分别为543,554,用药前,检察兔眼结膜血管、角膜透明度等均属正常,如①结膜无血丝及发红;②王　颖,女,42岁,主管药师角膜不浑浊,呈透明状;③眼角无分泌物.左眼点化云宁滴眼液2滴(批号850619),右眼点生理盐水2滴作为对照,用药后开始记录时间,并观察眼部反应情况.结果判定以上述用药前检察的①～③项指标无异常为无刺激症状表现(-),否则为被检眼药有刺激性(+).1.5　常压耐缺氧实验　按表2中的剂量,小鼠腹腔(注射)给药(批号830509,自制)后30min,放入容量为250ml的磨口玻璃瓶中,瓶内放钠石灰5g,每瓶放小鼠一只,放入后用凡士林密封盖紧,并开始记录其存活时间[2].以生理盐水组为对照,比较各组间统计学上的差异,统计学处理采用t检验.2　结果2.1　药液中K+浓度的测定　在中药滴眼液与中药注射液中常含有来源于植物药材本身的K+,其浓度过高可引起局部疼痛.我们采用中草药注射液的K+浓度限定范围[40%～60%(mg/ml)以下][3]做为化云宁滴眼液的质控标准之一.六个批号的化云宁滴眼液中K+浓度测定的结果见表1,均符合限定标准.此外,对化云宁滴眼液中丹参,黄芩和金银花三种主药提取液的K+浓度也分别进行了检测,结果(三次测定的平均值)分别为47.6%,0.8%和1.2%(mg/ml),由此可见,该滴眼液中的K+主要来源于丹参.2.2　刺激性实验　经2只新西兰白兔左、右眼对照实验观察,除1只兔左眼在用药液后15min时观察有轻度流泪外,其余均无任何刺激性反应.因此,该眼药符合有关规定.。

MTT检测法

MTT法检测细胞存活和生长之袁州冬雪创作MTT全称为3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝.是一种黄颜色的染料.又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法.其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能.二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量.在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比.该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等.它的特点是活络度高、经济. 缺点：由于MTT经还原所发生的甲瓒产品不溶于水，需被溶解后才干检测.这不但使工作量增加，也会对实验成果的准确性发生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害. MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml.因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保管即可.在配制和保管的过程中，容器最好用铝箔纸包住.需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不克不及测定细胞相对数.在用酶标仪检测成果的时候，为了包管实验成果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内. MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保管两周内有效，或配制成5mg/ml保管在-20度长期保管，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解.我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没需要一下子配那末多,尤其当MTT变成灰绿色时就相对不克不及再用了. MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感；往96孔板加时不避光也没有关系，毕竟时间较短，或者你不放心的时候可以把操纵台上的照明灯关掉. 配制MTT时用用PBS溶解,也有人用生理盐水配，60℃水浴助溶.MTT法实验步调贴壁细胞：1、收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边沿孔用无菌PBS填充）. 2.、5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况 3.、5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察. 4、每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h.若药物与MTT可以反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液. 5、终止培养，小心吸去孔内培养液. 6、每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD490nm处丈量各孔的吸光值. 7、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）悬浮细胞：1、收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，顺次序将①补足的1640（无血清）培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100g/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边沿孔用无菌水填充）.每板设对照（加100l 1640）. 2、置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察. 3、每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h.（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步调4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值）4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解.在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）丈量各孔的吸光值. 5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔.关于MTT实验总结MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础.MTT为黄色化合物，是一种承受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不克不及将MTT还原）.还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，操纵酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目.也可以用DMSO来溶解.MTT粉末和溶液保管时都需要避光，用铝箔纸包好便可以.实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，感觉这样比较好.MTT步调：1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目标和要求决议培养时间）.3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液.每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解.4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录成果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线.MTT注意事项：1、选择适当得细胞接种浓度.2、防止血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液停止试验.在呈色后尽可以吸尽孔内残存培养液.3、设空缺对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空缺对照.其他试验步调坚持一致，最后比色以空缺调零.4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度.把药品稀释成分歧的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50.要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06.代入计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4).其中：Xm:lg 最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值.公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 .例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO 之前要尽可以去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒停止比色测定.一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值.一般要低于IC50，防止非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多.我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h.一般肿瘤细胞系空缺处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较分明.有一点观点：我感觉做任何实验都需要试探适合你的实验的条件，不克不及用一个protocol去套所有的实际.拿MTT来讲，这个实验是间接检测活细胞数目标，而需要确定活细胞数目标实验的目标是各种各样的.在分歧的目标下，就需要分歧的条件.以药物筛选来讲，为了准确评价药物的作用，培养时间仅用3～5天可以是不敷的；对于某些细胞来讲，加药培养时可以用维持培养基或无血清培养基更合适.因此，诸如MTT和DMSO加入量、孵育时间等应因事而异，找到最适合你实验要求的就好.MTT实验心得MTT实验是检测细胞活力的实验方法，由于细胞活力与细胞数呈正相关，因此也经常常使用来检测细胞的增殖情况.MTT的原理：活细胞有琥珀酸脱氢酶，将MTT还原成棕褐色沉淀.由于一般先容园子里已经很多，笔者将自己的心得依照实验流程与大家交流交流.1、培养好细胞点板.养细胞没啥好说的，如果不知道细胞如何养，那就看看相关的文献方法.如果知道了细胞的名字，便可以上检索细胞的培养信息，这个网站上的培养方法是尺度培养方法.当然可以根据自己实验要求停止修改.由于细胞计数很繁琐，点板时的细胞浓度是最难掌握的，这一点笔者的心得如下：自己先将细胞养一段时间，大概懂得细胞的增殖情况，在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%，如果打算养48小时就检测，根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况.这时可以将细胞不停止计数，将消化好的细胞混匀后（可以是10 ml）直接在一个废弃（最好停止过无菌处理）的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞，将细胞放置几分钟就会沉到板底了，这时在显微镜下观察，推测哪一个孔的细胞48 h能基本长满板底，假设50 微升的孔比较合适，而点板时没孔需点200 微升，那末就将细胞浓度再稀释4倍便可以正式点板了，这时顺便将细胞停止计数（因为实验记录要求写啊）.这样就OK了！如果细胞还太多，将细胞稀释4倍后再重复以上操纵.注意：不要过分信赖细胞计数，因为细胞计数的取样量为20 微升左右，由于颗粒的分布不平均，代表性是很差的.建议：细胞计数一定要会，但不要完全依赖它.点板时一定要将细胞消化成单个细胞，而且一定要混匀，最好用排枪，否则，MTT的SD会狂大.2、点板规划.其实这一点很多人不懈一顾.如果你的细胞要养48 h或更长，建议不要鄙吝96-孔板的四周边孔，这32个边孔不克不及使用，建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分.因为细胞培养过程中，边孔的水分蒸发很快，培养液及外面的药物会出现稀释现象，细胞的状况就复杂了，有些人称之为“边沿效应”这些孔的SD也会狂大，既然如此，不如不必.3、加MTT.如果确认你考查的药物没有氧化还原性，你可以直接加入MTT溶液（总体积的1/10），如果你没有掌控，建议在加MTT前换一次液；如果你必定考查的药物的氧化还原性很强，比方谷胱甘肽、Vit E、VitC，那建议你用PBS将细胞洗洗，否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀，这种效果可以是你不需要的.4、加入MTT后的反应.时间为3-4h，此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO.为了将沉淀溶解完全，尽可以将水弃除干净，加入DMSO后在摇床上震摇10min.提醒：如果你的细胞贴壁欠好，此时的沉淀在弃去液体时易丢失，因此贴壁欠好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理，要么在弃液体时先用甩板机离心，再轻轻弃去液体.关于DMSO的量，每孔的体积有点儿差别不干扰检测，只要能将沉淀完全溶解就行了.至于DMSO的体积差别分歧为什么不影响检测值已经被数学证了然，在此我未几说，如果有人不大白我再证明给他看.当然为了养成杰出的实验习惯，DMSO的体积还是一致的好.5、检测MTT.还原的MTT在460-630均有较好的吸收，如果你的酶标仪是滤光片，可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片，如果酶标仪有单波长，你可以在检测前扫描一下吸收谱，选用最大细说波长检测就是了，最大波长，大概在550nm附近，需要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收.6、吸收值分析.在抱负的MTT实验中，如果是细胞抑制实验，不加药物处理组的吸收值应该在，太小检测误差占的比例较多，太大吸收值可以已经超出线性范围.这个原理在朗伯-比尔定律中有诠释.7、如果你感觉MTT中出现的问题欠好处理，那末建议你做CCK-8实验，原理与MTT相似，但操纵上简化些，当然，费用也稍微高一些.请问在做MTT实验室是否遇到过下面的情况：调零孔我用的培养基，在加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变更，为黄色，吸取溶液加入DMSO之后，溶液为粉红色，其实不是无色，而且在490nm下的吸收值为0.2左右，我感觉挺大的，而加药组的最高浓度还不如调零孔的大，如果把调零孔的值减掉之后，OD值为负值.别的加药组加MTT4小时之后，溶液颜色有些发红.对照组测出的OD值在0.4～0.5之间.接种体积为100ul，5000cells/well，第一天接种，第二天加药，第三天测mtt，波长490nm.我做了很多次，每次的调零孔都那样，我想不是污染，而且也没污染的迹象.我怀疑时培养基的问题，而且我做过两次测试，一组只加含血清的培养基，一组为不加血清的培养基，其它孔接种细胞，细胞浓度分别为10000cells/well，5000cells/well，2500cells/well，这两次的成果：三个浓度下的OD值两次的都比较吻合，但加含血清培养基的和只加培养基的孔的OD值还是很高，应当还在0.2左右.不知是什么原因，请分析.别的，你所给出的值是不是在570nm下测的，我感觉在490nm下不会那末高吧，而且你复孔之间的差值一般是多少？欠好意思，你说的现象我没出现过.还得注意几点：1、MTT应该新鲜配制，在4度保管最多不克不及超出2周，也有说10天的，反正不克不及太久.2、如果你养细胞的时间长，中途不换液，96孔板周边的孔是不克不及用的，应该加入无菌PBS.3、如果有心，你可以在700 nm做一个参比吸收，将每个孔的检测吸收减掉参比吸收后再分析.4、加入DMSO之前应尽可以将培养液弃除干净.问：96孔板里的细胞长的好象没有在培养瓶里的好,有的时候都无法断定板里细胞的死活了.不知道有没有什么法子?丁香网友chinaefulle认为：1、对于贴壁细胞：死细胞呈圆形，贴壁差；活细胞呈伸展状，贴壁好.2、对于悬浮细胞似乎欠好直接断定.有一个经典方法，就是用台盼蓝染色，细胞染上色的就是死细胞，染不上的就是活细胞，染色很快，一分钟内便可以断定，原因是活细胞的细胞膜完整，而且有什么外排机制，不容易着色.如果96-孔板养欠好，可以试着用24孔板.如果是旧板养欠好，就试着用新板.为了将旧板洗干净，旧板可以下硫酸洗液2-3 h，但不要太长，否则板就黄了.还有一点，旧板的细胞培养时贴壁较差，可以铺多聚赖氨酸试试.如果你的细胞欠好养，尽可以不要用旧板.问：加MTT孵育4小时后，溶液颜色没有发生太大变更，为黄色.我想请问一下，你的MTT是用无血清培养基配的吗？因为我有一次就是加错了，用正常的含血清培养基配了，成果颜色就分歧错误了，干扰了MTT的检测.丁香网友chinaefulle认为：MTT为淡黄色，用0.1 M 的PBS配制，浓度为5mg/ml，配好后直接取20 ul加入到完全培养的细胞孔中（总体积在200 ul左右，MTT的体积占总体积10%）就行了.不要用培养基配制，更不要加血清，因为MTT的稳定性不太好，溶液越复杂，便可以导致MTT越不稳定.问：我也做了很长时间的MTT实验，一直用的是570nm，和您说的波长所测值会有很大差别吗？丁香网友chinaefulle认为：如果酶标仪用的是滤光片，那就没啥选择性.570nm的吸收也是挺高的.波长分歧吸光度会有差别，但不影响检测成果的趋势变更.如果你用的酶标仪有单波长（三棱镜或光栅衍射发生的），那末选用最大吸收波长有利于减少非特异性吸收所导致的误差.问：我在的实验室做MTT实验所用的波长是双波，630和470 ，实验室的酶标仪没有570，不知单波和双波有何区别？丁香网友chinaefulle认为：单波长也是可以用的.双波长主要可以扣除非特异性吸收，比方细胞颗粒造成的吸收和板孔布景导致的非均一性吸收.如果使用96孔板前先检测板孔的布景吸收在0.05以下，或高于0.05的孔标识表记标帜好不必，单波长也能大体扣除因此造成的非特异吸收.对于细胞造成的非特异吸收，细胞数越多，这方面的吸收也越高，对成果断定的方向性不会有太大影响.下图A 是氧化型MTT的吸收曲线，B图是还原型的MTT吸收曲线，对于你的酶标仪建议使用470 nm.氧化型MTT的吸收曲线还原型的MTT吸收曲线问：MTT用PBS配制,原先培养基中10%FBS会影响成果吗?丁香网友chinaefulle认为：不会，因为上清会弃去，每个孔中都平行有10%FBS，即使有影响，其影响的大小也是可以通过阴性对照扣除掉.问：我一直在想一个问题，为什么网上见的protocol 绝大部分都是MTT加10～20ul，然后放3～4h再测？是为了节俭试剂？我想在某种程度上时间能更重要些，但为什么不增加MTT的量，减少孵育时间呢？从我的实验来看，增加MTT、降低孵育时间是可行的.但是现在也存在一个问题，就是即使用到5000/well，现在不加药的孔的OD也能到1.5甚至2以上.是否有MTT增加的原因？这个还在停止验证.希望有我这种实验履历和想法的同行一起讨论.丁香网友chinaefulle认为：你提的这个问题很好，值得探索.但是今朝都是约定加入10%体积的MTT，然后反应3-4h.我个人猜测可以与以下原因有关（纯属猜测，因为没做过实验）：1、根据我的经历，MTT的溶解度不是太好，所以0.5%的MTT母液（相当于10X）已经可以接近最大溶解极限，而直接用含血清的培养液配制因为带入的成分复杂，MTT保管的稳定性可以存在疑问.所以使用孵育3-4h的条件.2、MTT是琥珀酸脱氢酶的人工底物，底物浓度过高可以导致酶抑制，当然，MTT是否有此作用值得实验验证，但大多数酶的底物浓度过高时会发生酶的抑制作用（直接的抑制作用）.问：我的MTT是用PBS配的，5mg/ml，因为每孔的溶液量为100ul，所以我加了10ul.现在我的调零孔孵育4小时后为黄色，但是加入DMSO之后，还是红色的，490nm下的吸收值为0.2左右.莫非是我买的培养基或是血清有问题，我用的是GIBCO的1640培养基，杭州四季青的血清.丁香网友chinaefulle认为：1、MTT温孵4h可以会发生自发的氧化还原作用而发生颜色.因为你是和培养基血清一起孵育的，你的空缺孔470nm吸收在0.2左右，因该说是预期值，要减少它，在你的条件下只能靠减少反应时间.但是要注意你的“有细胞但不加药的孔”吸光度是多少，如果吸光度小，比方低于0.8，那末建议你增加细胞浓度.2、尽可以不要用延长反应时间来增加吸光度，因为MTT 会自发转化，尤其是有血清的帮忙下（血清中含有NADH、Fe3+等物质，这些物质能促进MTT转化），通过增加细胞数减少反应时间来提高检测孔和空缺孔的相对差值是可行的，而通过增加反应时间可以很难凑效.这一点许多书上没说.你除去培养基后是否在加入同体积的PBS.我曾试过，把培养基吸出，然后加同体积的PBS，再加入MTT，测出的值要比有培养基可孔的值低，当时好像能低0.2左右（490nm）.丁香网友山百合的做法是：去除培养基后，直接加用PBS稀释的MTT（MTT母液也是用PBS配制的）200微升，放置1h再加200微升的DMSO.丁香网友chinaefulle认为：估计采取提高MTT浓度以减少孵育时间的做法可以不成行.仅供参考，来由如下：我们惯例加入的MTT是过量的，反应4h后96孔板的溶液仍是黄色，改变较小，这标明MTT加入的量的确是过量的.过量的底物与酶反应实际上是零级动力学过程，即酶已经被底物饱和.如果再增加底物浓度实际上也改变不了一定时间内的产品量.也就是说，底物再增加10倍，要想获得原先的吸光度，以前用3h，现在可以还是要用将近3h.因此意义较小.当然，我用的是实际分析，应该以实验为依据.仅供你参考，如果能分明缩短反应时间那末还是很有意义的.问：我前两天做了两板，孵育四小时候，把液体倒出時发现MTT还原物也被倒出了一些！成果很欠好！而且用移液枪吸出的也带有还原物！我该怎么办呢？问题2：由于我所作的药溶解度非常低一百多微克每毫升就析出！使等倍稀释很不准！有什么法子处理？我们在Hanks液里加了牛血清白蛋白提高溶解度可行吗？不是说血清会影响成果吗？丁香网友山百合认为：1、注意细胞状态，细胞状态好的时候不会掉；或者倒液前离心；2、药物可用DMSO溶解成母液，一般为使用浓度的0.1%左右，不过液有文献报导用1%，我看的文献有用1%、0.5%、0.1%的，尽可以要使工作液中DMSO的含量低，以免影响细胞生长状态.不要加蛋白促溶，一方面是否能起促溶作用不明白，另外一方面蛋白可以吸附药物，尤其是小分子药物问：大家都是用DMSO吗？怎么看到有的文献是用HCl-isopropanol溶液，然后570nm测定？丁香网友chinaefulle认为：DMSO的使用比盐酸-异丙醇方便，至少盐酸-异丙醇溶液你还得配置，而DMSO拿来便可以用，而且使用浓盐酸时你得小心一点，要注意平安.而DMSO就没有这么费事.当然DMSO和盐酸-异丙醇都可以用来裂解细胞溶解被还原的MTT，如果手头上没有DMSO，用盐酸-异丙醇溶液也是可以的.至于盐酸-异丙醇如何配置可以查查书.问：MTT还能用于组织标本中的细胞增殖检测啊?该怎么弄呢?丁香网友chinaefulle认为：应当可以，只要组织是活的，因为MTT检测与琥珀酸脱氢酶活性有关，只要组织中有此酶，MTT反应同样会发生.当然组织需要匀浆.申明以下，以上是实际推测，我还没试过，如有人试过，无妨也来交流交流.MTT试验的一些细节问题(一)细胞1.选择适当的细胞接种浓度.一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞.但由于分歧细胞贴壁后面积差别很大，因此，在停止MTT试验前，要停止预实验检测其贴壁率、倍增时间以及分歧接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以包管培养终止致细胞过满.这样，才干包管MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系.否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差别.2.药物浓度的设定.一定要多看文献，参考他人的成果再定个比较大的范围先初筛.根据自己初筛的成果缩小浓度和时间范围再细筛.切记！否则，可以你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间.3. 时间点的设定.在分歧时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到分歧时间点的抑制率变更情况，画出变更的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）阿谁时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表示的最分明）.4.培养时间.200ul的培养液对于10的4～5次方的增殖期细胞来讲，很难维持68h，如果营养不敷的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于运动，影响成果，我们是在48h换液的.5.MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不克不及测定细胞相对数.做MTT时，尽可以无菌操纵，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高.6.实际未必都是对的.要根据自己的实际情况调整.设置调零孔，对照孔，加药孔.调零孔加培养基、MTT、二甲基亚砜.对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT、二甲基亚砜，分歧的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入分歧浓度的药物.8.防止血清干扰.用含15％胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值.由于试验本底增加，会试验敏感性.因此，一般选小于10％胎牛血清的培养液停止.在呈色后，尽可以吸净培养孔内残存培养液.(二)实验步调贴壁细胞：1.收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度至1000-10000孔，（边沿孔用无菌PBS填充）.。

MTT法检测细胞存活及生长

MTT法检测细胞存活及生长【分享】MTT法检测细胞存活及生长什么是MTT?MTT全称为-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。

是一种黄颜色的染料。

什么是MTT法? 又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲瓒的有机溶剂对实验者也有损害。

MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。

我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。

MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间的简化计算解析

1.MTT比色法测定细胞生长曲线 2.细胞生长曲线的拟合及细胞群体倍增时间的简化计算
1.MTT比色法测定细胞生长曲线
2018/10/31
细胞生长曲线
• 细胞生长曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过长短不同的迟缓期（潜伏期），即进入大量分裂的对数生长期。在细胞达到饱和密度后，停止生长，进入稳定期，然后退化衰亡。
t 24h( Lg 2 / [ Lg (a eb t ln 2 ) Lg (a eb t0 ln 2 )] t 24h( Lg 2 / [ Lg (a 2 ) Lg (a 2
bt b t0
)])
t (24h( Lg 2 / b((t t0 ) Lg 2)
t[24h( Lg 2 / (b t Lg 2)]
• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系，绘出标准曲线。
2018/10/31
• • •
2.细胞生长曲线拟合及细胞群体倍增时间的简化计算
2018/10/31
• 曲线拟合
• 曲线拟合（curve fitting）是指选择适当的曲线类型来拟合观测数据，并用拟合的曲SS是世界上最早的统计分析软件，由美国斯坦福大学的三位研究生Norman H. Nie、C. Hadlai (Tex) Hull 和 Dale H. Bent于1968年研开发成功，同时成立了SPSS公司，并于1975年成立法人组织、在芝加哥组建了SPSS总部。 • 1984年SPSS总部首先推出了世界上第一个统计分析软件微机版本SPSS/PC+，开创了SPSS微机系列产品的开发方向，极大地扩充了它的应用范围，并使其能很快地应用于自然科学、技术科学、社 2018/10/31

细胞生长检测方法

细胞生长检测方法-------MTT法MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。

一、基本原理：其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT 还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。

二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。

在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

它的特点是灵敏度高、经济。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。

这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。

在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

二、MTT 溶液的配制方法MTT全称：3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide汉语化学名：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐商品名：噻唑蓝，是一种黄颜色的染料。

MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。

注意：1.在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住，实验的时候一般关闭超净台上的日光灯来避光）。

2. 配制MTT时用PBS（ph=7.4）溶解，PBS配方：Nacl 8g ＋Kcl 0.2g ＋Na2HPO4 1.44g ＋KH2PO4 0.24g调pH 7.4,定容1L。

MTT比色法原理

MTT比色法原理MTT是一种黄色溶液，其化学名称为五氯化三苯基四唑（3-{1-[(4-氨基邻苯基)亚甲基] - 2- 喹唑基} - 2,5 - 二苯基二氯化三唑）, 其分子结构中携带着两个苯环。

MTT最初是由黄司徒特（Mosmann）于1983年提出的。

在细胞液中，MTT还原为紫色的结晶形式，这些结晶在细胞内或细胞外形成。

使用MTT比色法进行细胞增殖和细胞毒性测定的基本原理如下：1.细胞培养：首先培养细胞在含有适宜的培养基中，并确保它们处于活跃的增殖状态。

2.细胞处理：将待测试的药物、化合物或其他处理物添加到细胞培养物中。

这些处理物可以是药物样品，药物代谢物，细胞培养物的生长因子等。

3.细胞孵育：经过一定的孵育时间（通常为24至72小时），细胞应该接触到处理物并表现出相应的细胞生长或细胞毒性反应。

4.添加MTT溶液：在孵育时间结束后，向细胞培养物中加入MTT溶液，通过吸收角色补充培养基中的MTT。

5.MTT的还原：MTT溶液进入于细胞内后，细胞内的活性酶可以将MTT还原为紫色形成的结晶，结晶聚集在细胞内。

形成紫色为重要的步骤，背后的原理是细胞内存在的一些种类的四氧化三唑酶。

6.细胞裂解：为了释放细胞内的紫色结晶，可以使用一些有机溶剂（如二甲基亚碸、酒精等）以破坏细胞膜。

7. 光密度测量：使用光密度计在570 nm波长( 细胞波长 )测量释放的紫色结晶的光密度。

光密度与细胞活力成线性相关。

活细胞含有较多的还原MTT产物，因此测量的光密度相对较高；而受损细胞和细胞毒性较大的样品则显示较低的光密度。

综上所述，MTT比色法主要通过将MTT添加到细胞中，经过还原反应产生的紫色结晶来测量细胞的增殖和生存能力。

这种方法简单、快速、灵敏，广泛应用于细胞生物学和药物筛选领域。

MTT法测细胞增殖

MTT法细胞增殖2015.05.13 热娜1.方法步骤（from 吴荃论文）a. 接种细胞：用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。

b. 培养细胞：同一般培养条件，培养3-4天（可根据实验目的和要求确定培养时间）。

c. 呈色：培养3-4天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml，用PBS；ph=7.4；配）20ul，继续孵育4小时，种植培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。

每孔加150ul DMSO，震荡10min，使结晶物充分融解。

d. 比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

2.MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，是一种接受氢离子黄颜色的染料。

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-yl)-3,5-di-phenytetrazoliumromide ，MTT噻唑蓝为基础。

活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan）, 甲臜的多少可以用酶标仪测定570nm处的光密度OD值推测出活细胞的数目。

由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT不会有反应。

3.MTT溶液的配制方法通常，此法中的MTT浓度为5mg/ml。

因此，可以称取MTT 0.5g，溶于100ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22um 滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4度避光保存即可。

在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

（实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，就得这样比较好。

）需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能检测细胞绝对数。

MTT比色法测定细胞生长曲线、细胞生长曲线拟合、细胞群体倍增时间的简化计算解析

• 1.标准曲线的测定:
• 例如：用培养液将待检细胞重悬，得到细胞悬液，按照4x10^4/ml细胞密度梯度 ,分别接种于 96孔板 ,每孔 100μl,重复 3孔;采用 MTT法测量吸光值A值,同一浓度下测得的A值为该浓度下3孔的平均值。依检测结果 ,得到吸光值 A值与细胞浓度的对应关系，绘出标准曲线。
以存活细胞数(万/mL)对培养时间 (h或d)作图，即得生长曲线。一般而言，我们主要研究的是对 2018/10/31 数生长期的生长曲线。
测定细胞生长曲线的方法
1.细胞计数法（简单、最常用、有误差）
• • （1）传代后把细胞重悬，得到细胞悬液，把悬液均匀加到24孔板中（2）24 h后开始进行细胞计数，以后每隔24 h计数一次，每次取4孔细胞，分别进行计数，计数结果取4孔的平均值。连续计数6天。 • （3）根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数/mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。 • 24孔板细胞计数板
24h / b
2018/10/31
• 结果 • 曲线一. • b=0.855
Td 24h / b 28.070h
• 曲线二. • b=0.921
2018/10/31
Td 24h / b 26.059h
THANK YOU
2018/10/31
m=（t-2） ln2
Ya e
b m
• 依据以上变量进行曲线拟合 ,记录相应的a,b值。 2018/10/31
2018/10/31
2018/10/31
2.2 细胞群体倍增时间的简化计算方法
2018/10/31
• 细胞群体倍增时间的计算方法有2种。 • 1.做图法:在细胞生长曲线的对数生长期找出细胞增加一倍所需的时间,即倍增时间, • 2.公式法,按细胞倍增时间计算细胞群体倍培时间,其为公式为：

L929细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性实验原理和操作步骤

L929细胞增殖MTT比色法检测IL-1的生物活性实验原理和操作步骤【基本原理】IL-1具有刺激多种来源的成纤维细胞增殖的作用，可用于IL-1生物活性检测。

目前国内外大多数实验室常用L929细胞株（小鼠成纤维细胞瘤细胞）作为检测IL-1生物活性的靶细胞或反应细胞。

MTT比色法的原理是利用四甲基偶氮唑盐[3-（4.5-dime thylthiazol-2- yl）-2，5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT]在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。

故通过反应细胞形成的MTT-甲肷量，即可测定IL-1对L929细胞促增殖作用程度，从而间接测定IL-1的生物活性。

【材料和试剂】（1）已诱生的IL-1待检样品：倍比稀释成不同浓度。

（2）IL-1标准品：倍比稀释成不同浓度。

（3）L929细胞：作为反应细胞或靶细胞，存活率应>95%。

（4）0.25%胰蛋白酶（5）10%FCS-RPMI-1640完全培养液（6）MTT：用PBS稀释成5mg/ml，用0.22μm膜过滤除菌及杂质，4℃避光保存。

（7）酸化异丙醇（含0.04mol/L HCl的异丙醇）：100ml异丙醇中加入0.4ml的36% HCl即可。

（8）96孔细胞培养板，刻度吸管，毛细吸管，加样器（头），刻度离心管，离心机，细胞计数板，倒置显微镜，5%CO2培养箱，超净工作台，酶标测定仪，570nm与630nm滤光片。

【操作步骤】（1）将生长状况良好的L929细胞用0.25%胰蛋白酶消化2-3min；（2）将L929细胞用10%FCS-RPMI-1640培养液洗涤2次，以去除消化液及原生长培养液；（3）用10% FCS-RPMI-1640培养液调L929细胞浓度为2×105/ml；（4）将L929细胞悬液加至96孔细胞培养板，100μl/孔；（5）分别加入不同倍比稀释度的IL-1标准品和待测样品于96孔细胞培养板中，100μl/孔，各设3个复孔，同时设立培养液空白对照；（6）置37℃，5% CO2培养箱中培养56h；（7）将96孔培养板取出，各孔加入MTT，10μl/孔；（8）置37℃，5% CO2培养箱中继续培养4h；（9）取出培养板，先从各孔中轻轻吸出100μl上清液弃去，再加入酸化异丙醇或D MSO，100μl/孔，置室温10~20min，吹打震荡，充分混匀，使 MTT-甲肷产物充分溶解；（10）用酶标仪以检测波长570nm，参考波长630nm，分别测定各孔OD值。

MTT法观察细胞生长曲线

MTT法绘制生长曲线一细胞生长曲线：A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。

只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。

因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料（一）仪器1. 净化工作台2. 离心机3. 恒温水浴箱4. 冰箱（4℃、-20℃）5. 倒置相差显微镜6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）（二）玻璃器皿1. 吸管（弯头）2. 培养瓶3. 玻璃瓶（250ml、100ml）4. 废液缸（三）塑料器皿1. 吸头2. 枪头3. 24培养板4. 胶塞（四）其他物品1. 微量加样枪2. 红血球计数板（五）试剂1. D-Hanks液2. 小牛血清3. RPMI16404. 双抗（青霉素、链霉素）5. 0.08%胰酶（四）、操作步骤1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。

3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。

培养3～5d常要给未计数的细胞换液。

4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。

9（五）、注意事项1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。

2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。

3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。

4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。

MTT实验法测定细胞增殖

MTT实验法测定细胞增殖1.实验材料1.1. 实验细胞株癌细胞株用含有10%新生小牛灭活血清RPMI-1640培养基，培养在37℃、饱和湿度、5%CO2的无菌培养箱中，每隔2～3天进行一次细胞传代。

1.2 药物与试剂RPMI-1640 培养基DMSO 胰蛋白酶粉1-甲基乙内酰脲5-氟尿嘧啶MTT 粉甘油碘化丙啶(PI)新生小牛血清1.3 仪器设备超净工作台（SW-CJ-2FD 型）超低温电冰箱恒温水浴箱低温高速离心机恒温震荡摇动床-20℃电冰箱光学显微镜电子天平Eppendorf 移液枪（10、100、1000ul）去离子纯水仪流式细胞仪低温数控高速离心机普通离心机1.4 主要试剂配方1.4.1 PBS 溶液磷酸二氢钾(KH2PO4)0.24g、氯化钠(NaCl)8.0g、磷酸氢二钠（Na2HPO4）1.44g、氯化钾(KCl)0.2g，用去离子水(ddH2O)溶解，然后将其定容使总体积为1.0L。

再使用盐酸将PH 值调至7.4，用无菌盐水瓶分装好，高压消毒灭菌，4℃内保存。

临用前要在37℃水浴加热。

1.4.2 细胞培养基称取RIPM-1640 培养基粉10.4g，用 1.0L ddH2O 溶解，再往溶液中加入2g NaHCO3，再用盐酸将PH 值调整至7.0，采用抽滤法除菌，无菌盐水瓶分装，置于4℃冰箱中保存，使用前往瓶中加入灭活新生小牛血清，使每瓶培养基中灭活新生小牛血清的浓度为10%。

每次临用前要将含有10%灭活新生小牛血清的RPMI-1640 培养基置于37℃水浴箱中加热。

1.4.3 新生小牛血清临用前，将新生小牛血清置于56℃水浴中灭活30min，之后用无菌盐水瓶分装密封，再置于-20℃冰箱中保存。

1.4.4 胰蛋白酶在100ml 的PBS 溶液中加入胰蛋白酶粉0.25g，置于4℃冰箱中过夜，用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌器除菌后分装、密封，置于4℃冰箱中保存。

1.4.5 MTT 溶液(5mg/ml)往50ml 无菌PBS 中加入250mg MTT 粉，轻轻摇匀，使MTT 粉充分溶解，予用直径为0.22μm 微孔滤膜除菌后分装、密封，锡箔纸避光，置于4℃冰箱中临时保存（≤7 天），置于-20℃冰箱中短期保存（≤1 月）。

干货：细胞生长的检测方法大总结（一）

干货：细胞生长的检测方法大总结（一）我们在研究新基因功能或者筛选药物在某种疾病中的作用研究时，经常要检测它们对细胞的生长。

今天，医学方小编就给大家总结一下有关细胞生长状况的功能学实验。

细胞生长曲线细胞生长曲线是最基本的指标，用来测定细胞增长基本规律常用的简便方法。

标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，经过一段时间的潜伏期，再进入对数生长期，达到平台期和生长稳定，最后衰老。

1台盼蓝染色法细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一。

所用材料为血球计数板，和显微镜。

细胞计数的基本步骤：(1)取清洁计数板和专用盖玻片，用无尘布轻轻拭干.(2)取细胞悬液0.3mL，加入0.9mL结晶紫(或台盼蓝)染液，混匀后，滴半滴于血球计数板内，以充满不外溢为宜。

也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中，不要溢出，也不要过少或出现气泡.(3)在显微镜下用10×物镜观察计数四角大分格中的细胞数。

代入下式得出细胞密度。

细胞数/ml=(4大格细胞数之和/4大格细胞)×104×稀释倍数台盼蓝染色法可计算出活细胞数和死细胞数以测定细胞存活百分率。

一般0.5%～1%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色，活细胞不着色。

细胞计数除用上述方法外，目前还有新型的自动计数仪，可供大规模细胞计数工作使用。

各种型号的计数操作不尽相同，可根据使用说明进行操作。

注意事项：在进行细胞计数操作时，必须把细胞悬液准备好，细胞应分散良好，并充分混匀。

2氧化还原法检测细胞生长增殖图片来自网络常用的方法有MTT，WST-8，CCK-8等。

该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

MTT基本原理是利用活细胞的线粒体脱氢酶在代谢过程中将黄色的可溶性四唑盐还原为不溶于水的甲臢,其与活细胞数量和细胞活化状态呈正比线性关系。

溶解沉积在细胞中的甲臢晶体，通过酶标仪测量细胞液的吸光度值(Optical density即OD值)便可检测出待测细胞样活性，细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。