植物反应器研究进展

植物反应器研究进展

摘要：以转基因植物作生物反应器生产外源蛋白，包括抗体、疫苗、药用蛋白等具很强的优越性，目前已成为国内外基因工程研究领域的热点之一。植物系统具有低成本、安全和易规模化优势，其表达生物活性药用蛋白能力已被许多研究所证实；同时，植物药用蛋白产品还表现出潜在的市场和广阔应用前景。

关键词：植物、生物反应器、外源蛋白

1 前言

随着人类经济社会的发展，对传统农业产品的要求也越来越高。现代生物技术，尤其是农业生物技术的迅速发展，对全球现有的农作物种植和生产结构能够产生重要影响，增强农产品对人类的服务功效及市场竞争力，增加农民的收入，促进农业的可持续发展。通过转基因用植物体表达外源蛋白(包括疫苗、抗体、药用蛋白)已成为植物基因工程领域内一个研究的热点，正在逐步形成产业化，具有极大的市场前景和商业价值。植物生物反应器就是利用植物这个系统，包括植物细胞、组织器官以及整株植物为工厂，来生产具有商业价值的生物制品，包括疫苗、抗体、药用蛋白等[1]。目前，已用于生物反应器的植物有烟草、拟南芥、大豆、小麦、水稻、玉米、油菜、马铃薯、番茄等[2]。

生物技术特别是在基因工程研究领域内的快速进展使人类进一步拓宽了植物的应用范围。国外发达国家特别是美国采用植物生物反应器这种“分子农业”的方法，已经成功地生产出多种高新生物技术产品，包括特殊的饱和或不饱和脂肪酸、改性淀粉、环糊精或糖醇、次生代谢产物、工农业用酶以及一些高经济附加值的药用蛋白多肽，一些研究机构和公司已经开始从这些产品生产中获得巨大的经济效益[3]。

2 植物生物反应器简介

生物反应器是指利用生物系统大规模生产有重要商业价值的外源蛋白，用于医疗保健和科学研究[4]。1982年首次成功地利用细菌生产重组胰岛素，这一突破消除了大规模应用胰岛素的限制因素，但依赖微生物发酵和哺乳动物培养生产商业蛋白体系成本高、规模化生产困难，安全性较差[5]。随着DNA重组技术和植物组织培养技术的快速发展，世界第一例转基因植物在1983年成功诞生于美国的华盛顿大学。1989年哺乳动物抗体在转基因植物中首次成功表达，证实了植物作为生物反应器的可行性。此后，植物生物反应器研究逐渐兴起。

2.1 植物反应器概念

广义上讲，植物生物反应器是指以植物悬浮细胞培养、天然的或经基因工程改良的植物细胞和组织，或整株植物为“工厂”大量生产具有药用价值(如人类或动物的疫苗、抗体)，或可作为工业原料的植物次生代谢产物、食品添加剂等重要应用价值的蛋白或氨基酸。从狭义上讲，植物生物反应器是指以转基因的整株植物为“工厂”来大量生产各种价值及附加值高的生物制品[6]。

2.2 植物反应器的优点

植物作为生物反应器的优势有：(1)植物生产外源蛋白成本低，只需阳光、土壤、水分和肥料，而微生物发酵和动物细胞培养则需要昂贵的培养基，并且工业化大规模生产时需要严格控制培养条件，增加生产成本。(2)植物细胞能够再生成植物，易于成活、生长周期短、易于快速筛选转基因阳性植物、比构建动物生物反应器省时、成功率更高。(3)转基因植物通过自交得到的后代遗传性状稳定，从而可以在植物体内积累多基因[7]。(4)植物可大规模种植，产物贮藏在种子、果实、块茎中，易于保存、运输，其中那些能直接食用的植物疫苗

不需特殊贮存条件[8]。(5)植物生物反应器能正确地表达、组装复杂的蛋白质，生产的蛋白活性高，很多复杂的蛋白质在微生物系统中不能正确地翻译、折叠、聚合，最终被降解或形成没有活性的包涵体，而植物具有生产任何复杂蛋白的潜能性。(6)植物生物反应器生产外源蛋白更安全，植物体只表达部分免疫蛋白，不含致病微生物，没有其他病原菌污染[9]。2.3 植物反应器的创建步骤

创建步骤可分为4个部分：①外源目的基因在植物表达载体中的克隆及对植物细胞的转化表达；②转化体系的再生和选择；③重组蛋白的回收和纯化；④终产物的鉴定。到目前为止，大多数的工作都集中在外源目的基因的克隆和表达方面[10]。

3 植物生物反应器研究现状

3.1 植物反应器平台

利用DNA重组技术在植物系统中表达目标生物活性分子——植物生物反应器研究仅有近20年历史；植物系统安全、低成本和易规模化优势使之成为目前重组蛋白生产主要系统之一。植物主流表达系统有3种：稳定核基因组转化、稳定叶绿体基因组转化和病毒瞬时转化，三者各有优势，均有不足。核基因组转化可以稳定遗传和具有较高级蛋白加工和修饰系统，不过外源蛋白表达水平低；叶绿体基因组转化可以实现外源蛋白高效表达、稳定遗传(胞质)和转基因花粉无逃逸风险，但无法完成复杂蛋白加工修饰，与原核生物类似；病毒瞬时转化，操作程序简单，也可以实现外源蛋白高效表达，但不能稳定遗传[11]。

目前使用的植物平台有双子叶植物(拟南芥、胡萝卜、羽扇豆、烟草、番茄、紫花苜蓿、叶用莴苣、大豆和马铃薯)、单子叶植物(玉米、大麦、小麦和水稻)、某些水生植物、藻类和苔藓。

3.2 疫苗生产现状

将人体免疫机理与植物转基因技术相融合所生产出的能使机体获得免疫功能的疫苗就是转基因植物疫苗。转基因植物生产疫苗有两种方式：一种是使用整株植物生产免疫蛋白，即注射疫苗，需要分离提纯；一种是直接在植物的可食性器官中合成，即口服疫苗，无需分离提纯，可直接食用。近几年来已成功表达的有病毒疫苗、细菌疫苗、寄生虫疫苗等[12]。

3.3 抗体生产现状

将编码全抗体或抗体片段的基因导入植物，在植物中表达出具有功能性识别抗原及结合特性的全抗体或部分抗体片段就是植物抗体。1989年，Hiatt克隆了小鼠的IgG基因导人烟草，再通过有性杂交获得F1抗体，从此，植物抗体开始了迅猛的发展。目前成功表达的全抗体包括IgG1、IgA 和IgG1／IgA嵌合抗体以及Fab抗体；抗体片段包括抗精子微型抗体scFvl9和乙型脑炎抗体重链可变区等[13]。

4 植物生物反应器存在问题及解决策略

4.1 基因沉默或不稳定表达

基因沉默指利用遗传转化方法导人并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因。在当代转化体或在其后代中表达受到抑制的现象。这就使转入的基因在受体植物中往往不能稳定表达，有时甚至完全不表达，其可以通过以下途径解决：(1)探明影响植物基因表达的基因调控元件，加以修饰和开启控制；(2)了解转录过程，以便在转录水平进行基因操作，提高转录效率；(3)研究翻译过程，提高翻译效率；(4)构建一些新的植物高效表达系统，即各种载体及高效元件[14]。

4.2 蛋白表达含量低

多数转基因植物通过自交后可以选择出目的基因纯合的后代，可以稳定遗传，使表型得以延续．但是大部分外源基因的表达水平在植物体内不高，目前没有得到很好的解决．但可以尝试以下方法加以解决：(1)选择合适的植物表达宿主是表达量高低的关键，烟草以其高的生物学产量和成熟的转化步骤被广泛用来表达各种药物蛋白质；而植物种子的定位表达