第五讲基因定点诱变PCR技术

Description
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃ 150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
靶DNA的扩增
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
Parameter
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
Concentration
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μ M(each one) 100 g/ml (optional) 0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M) >0.5mM< 10mM 1 unit 25—100μ l
所用酶类


T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持 续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素


1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp 2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
寡核苷酸定点诱变技术

M.Smith（加拿大生物化学家） 1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了 寡核苷酸定点诱变技术。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以 认为地通过基因的改变来修饰、改造某 一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质 的结构及其与功能的关系、蛋白质之间 的相互作用。
基因诱变的应用


Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme
Klenow Sequenase Taq BstE Pfu Tth UlTma
Microbial Source
Escherichia coli T7 bacteriophage Thermus aquaticus Bacillus stearothermophilus Pyrococcus furiosus Thermus thermmophilus Teratoga maritima

基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿 主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩 增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增

PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗 传研究室的科学家K.B.Mullis发明 的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基 因或DNA序列的方法，有称之为体 外扩增法。
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
ung -：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖
基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶
E.Coli （dut-，ung-）

合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。

CJ236(dut-，ung- ，F+ )
ssDNA制备载体

1 单链噬菌体载体 M13 2 phagemid载体-辅助噬菌体
பைடு நூலகம் 温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
Thermotolerance
No No Yes Yes Yes Yes Yes
Characteristics of Taq Polymerase
Characteristics
Origin Molecular weight Optimal temperature Activity Stability Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity

1 2 3 4 5
结构和功能 基因的注释 代谢途径-分子育种 蛋白质的修饰 分子设计-分子进化工程
缺失诱变


1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶 切位点进行切割，而后用T4连接酶进行 连接。 2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大 片段
插入突变



1 2 3 4
Typical PCR Thermal Profile
Program
94℃ (first step) 1min 1min 1min
37—60℃ (second step) 1min 1min 1min
72℃ (third step) 1min 1min 10min
Reps
Cycle1 Cycle2—30 Cycle31*
人工合成片段 Transposon insertion （Tn5） 同源重组 PCR
基 因 的 体 外 诱 变
Kunkel法 或称”U”法
dut -
：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不
能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含 量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正 常情况下有“T”占据的位置。