第五讲基因定点诱变PCR技术
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。
该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。
整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。
第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
第五讲基因定点诱变PCR技术
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持
续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp
1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补 的人工合成的寡核苷酸片断。
1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 atggctant… 3.嵌套引物
2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿
主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩
增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术
Origin
Thermus aquaticus strain YT1
Molecular weight
94 kd
Optimal temperature 72--80℃
Activity
150 nucleotides/sec/molecule
Stability
>50% at 95℃ for 40 min
Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
1× 29× 1×
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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• EMSA • 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA • 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
• 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲酯的用量非常关键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀DNA（包括与DNA相结合的蛋白质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
• 酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术，可识别稳 定结合于DNA上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核 生物中DNA-
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一）酵母双杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
• 真核生物的转录因子大多是由两个结构上分开、 功能上独立的结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录激活域（AD）。
• 单独地BD能与特定基因地启动区结合，但不能激 活基因的转录，而由不同转录因子的BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。
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4）一旦酵母细胞中表达的“诱饵”蛋白与“猎物” 载体中表达的某个蛋白质发生相互作用， 不同转录调控因子的AD和BD结构域就会 被牵引靠拢，激活报告基因表达。
5）分离有报告基因活性的酵母细胞，得到所 需要的“猎物”载体，获得与已知蛋白相互 作用的新基因。
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AD:Activation domain DNA-BD:Binding domain
定点诱变技术
Family gene shuffling library of chimeras
Generating chimeras with crossovers of large blocks of sequences
How DNA shuffling works ？
一、单基因和基因家族的重组装
Fragment with DNAseI
第三章 DNA突变技术
基因突变包括单个碱基或片断的替换，基
因片断的插入与删除等。
根据其特点可将基因突变技术分两大类：
1.位点特异性突变
定点突变
2.随机突变 表型筛选
随机突变
易错PCR法(Error-prone PCR)
降低一种dNTP的量（降至5％-10％） 加入dITP来代替被减少的dNTP 缓冲液中另加0.5mmol/L Mn2+
适用于插入片段长度在 1.0kb以下的多点突变。
Steps of Multipoints Mutagenesis Kit (TaKaRa)
X
XXX
X
Reassemble fragments
XXX
X
Select best recombinants
XXX
XX
X
XX
X
XX
X
XXX X
XXX X
XXX X
XX XXX X X X X X
XX X
X
XX X
X
XX X
X
XX X
XXXXXX NhomakorabeaXX
X
Repeat for multiple cycles
枯草杆菌蛋白酶E热稳定性的分子进化 （Huimin Zhao等，1999）
DNA与蛋白质互作及定点突变
C 沉默子
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启动子（promtor）在转录起始点上游约100－200bp以内，
每个元件长度约为7－20bp，决定RNA聚合酶Ⅱ转录起始
点和转录频率的关键元件。 增强子(enhancer)能使和它连锁的基因转录频率明显增加的 DNA序列，顺式作用元件（DNA序列）。 沉默子(silencer)负性调节元件，与相应的反式因子结合后， 可以使正调控系统失去作用，阻遏基因转录。
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六）体内足迹试验
• 用适量DMS处理完整的游离细胞，使染色 质中的G残基甲基化，提取DNA并加入六氢 吡啶切割DNA链。与对照的裸露DNA经甲基 化处理后形成的梯度相对照，就能发现DNA 链上的蛋白质结合区。
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七）染色质免疫沉淀实验 Chromatin Immunoprecipitation(ChIP) Assay
5
2.寡核苷酸引物诱变技术
• 用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片 段作为引物，启动单链DNA的复制，新产 生出来的心链就具有已发生突变的碱基序 列。
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㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法
•
该方法是利用四种引物，三轮PCR反应来 进行的。操作较为繁琐。
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片产 段生 末一 端种 的突 突变 变位 体点 远 离
五、基因定点诱变
1
定位诱变技术就是指按照设计要求， 在体外将基因特定区域的碱基进行突变， 这样就有可能在缺乏表型选择时进行遗传 分析，以便于研究基因结构与功能的关系 和基因表达调控的过程。其诱变技术有两 种类型，即区域随机诱变和点突变。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
pcr定点诱变原理例题
pcr定点诱变原理例题
PCR（聚合酶链式反应）定点诱变是一种用于引入特定突变的技术，其原理是利用PCR反应来产生特定的突变。
这种技术可以被用于研究基因功能、蛋白质结构和酶催化机制等领域。
下面我将从原理和例题两个方面来回答你的问题。
首先，我们来看一下PCR定点诱变的原理。
PCR定点诱变利用了PCR反应中的错误复制和修复机制。
在PCR反应中，DNA聚合酶会复制DNA模板，但是由于其复制过程中的错误率，会产生一些突变。
通过控制PCR反应条件和引入特定的引物（引物中包含所需的突变信息），可以在特定位点引入所需的突变。
之后，可以通过转化或者其他方法将这些突变引入到目标生物体中，从而实现对特定基因的定点诱变。
接下来，我们来看一个例题。
假设我们希望在一个特定的基因中引入一个点突变，使得蛋白质的一个氨基酸发生改变。
首先，我们需要设计引物，其中包含我们希望引入的突变信息。
然后，我们进行PCR反应，使用这些引物来引发特定的突变。
接下来，可以通过测序等方法验证是否成功引入了突变。
最后，可以将这个突变基因导入到目标生物体中，观察其表型变化以及对应的功能变化。
通过PCR定点诱变技术，我们可以精确地引入特定的突变，从而研究基因功能、蛋白质结构以及酶催化机制等方面的问题。
这种技术在分子生物学和遗传学研究中具有重要的应用价值。
希望这个例题能够帮助你更好地理解PCR定点诱变的原理和应用。
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。
以下是几种常用的DNA实验技术方法：1.基因测序技术基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。
经过多年的发展，现在有很多种基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和单分子DNA测序。
这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选择性地扩增感兴趣的基因片段。
对于基因定点突变的研究，PCR可以用来扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。
该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。
引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA来检测和分析基因定点突变。
当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大量的基因表达水平。
通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行杂交反应，可以检测不同样品中基因定点突变的存在。
以上是几种常用的DNA实验技术方法，用于研究和检测基因定点突变。
随着技术的不断发展和创新，这些方法将进一步提高灵敏度和分辨率，为基因定点突变的研究提供更多的选择和可能性。
基因定点诱变技术与DNA与蛋白质互作及定点突变介绍
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酵母双杂交的基本原理示意图 25
二） 酵母单杂交系统
? 酵母 单杂交系 统是上世 纪90年代中 发展起来的研 究DNA-蛋白质之间相互作用的新技 术，可识别稳 定结合于DNA 上的蛋白 质，在酵母 细胞内研究真核 生物中 DNA-蛋白 因。
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一）酵母双 杂交系统 （yeast two-hybrid system)
1. 原理：
? 真核生物的 转录因子大多是由两个 结构上分开、 功能上独立的 结构域组成的，即 DNA结合域（BD） 和转录 激活域（ AD）。
? 单独地BD能与特定基因地启 动区结合，但不能激 活基因的 转录 ，而由不同 转录 因子的 BD和AD所形 成的杂合蛋白却能行使激活 转录的功能。
– 1.盒式诱变 – 2.寡核苷酸引物诱变技术
? ㈡ PCR点突变技术
– 1.重组PCR定点诱变法 – 2.引物PCR定点诱变法
3
㈠寡核苷酸介 导的定点突 变技术
? 1.盒式诱变（casette mutagenesis） ? 利用一段人工合成的具有突变序列的
寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应 序列。
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? EMSA ? 还被
用于 研究 与蛋 白质 相结 合的 DNA ? 序列 的特
异型。
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四）DNaseI足迹试验 （DNase I foot printing）
? 主要步骤： ① 用32P标记DNA双链末端，并用 RE切去一端； ② 加入细胞特定周期蛋白 质提取物，温育； ③ 加入适量DNaseI或硫酸二甲 酯-六氢吡啶，使 DNA链发生断裂。 这一反应中，DNaseI或硫酸二甲 酯的用量非常关 键， 要保证一条链只发生一次断裂！ ④沉淀 DNA（包括与 DNA 相结合的蛋白 质）； ⑤进行DNA凝胶分析。
基因定点诱变
使用化学合成的含有突变碱基 的寡核苷酸片段作引物,启动 单链DNA分子进行复制，随 后这段寡核苷酸引物便成为了 新合成DNA子链的一个组成 部分。
寡核苷酸引物诱变过程
正链DNA合成 突变引物合成 异源双链DNA分子制备 闭环异源双链DNA分子富集 转化 突变体筛选
寡核苷酸引物诱变法的局限性
异源双链DNA分子并非真正异源 突变体子代中突变碱基被错配修 复体系修复
提高寡核苷酸引物诱变突变效率的方法
(1) Kunkel 定点诱变法: 1985年由
(2) 硫代磷酸诱变法: 已知有些限制酶不能切割 硫代磷酸DNA分子．在异源双链DNA分子 制备时，加入硫代核苷酸，使之掺入突变 链中．然后用前述酶切割，并用外切酶局 部消化后，进行聚合反应，从而产生具有 定点突变的异源双链DNA
2.4.３ ＰＣＲ诱变
(1) 重组PCR定点诱变:克服寡 核苷酸引物诱变能力仅限于5’ 端.
特点:经3轮PCR反应,一对互补 的带有突变碱基的内侧引物和 2个外侧引物
(2) 大引物诱变:核心是第一 轮PCR产物为第二轮PCR引 物
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返回第二章
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变的方法及原理基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。
通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。
该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。
CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。
TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。
TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）与核酸酶（nuclease）融合而成的一种基因编辑工具。
锌指蛋白能够识别和结合到特定的DNA序列上，而核酸酶则通过识别锌指蛋白与DNA结合后的底物序列引发DNA的切割。
ZFN系统利用设计合成的锌指蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，从而在特定的位置诱导DNA的双链断裂，进而引发基因突变。
定点突变pcr原理
定点突变pcr原理宝子们，今天咱们来唠唠这个超有趣的定点突变PCR原理呀。
咱先得知道啥是PCR。
PCR就像是一个超级复印机，能把咱想要的那段DNA不断地复制。
你想啊，DNA那么小，咱要研究它，不多复制点怎么行呢？它就靠着那些个酶啊、引物啊啥的，在合适的温度下，像变魔术一样，把一小段DNA变成好多好多相同的片段。
那定点突变PCR呢，就是在这个复印的基础上搞点小创意。
它呀，就像是给DNA 这个小房子重新装修一下，不过不是大动干戈，而是精准地改变某个小角落。
比如说，DNA里有个碱基就像小房子里的一块小砖头，咱定点突变PCR就是要把这块小砖头换成另外一种。
这里面的关键就是引物啦。
引物就像是一把小钥匙，它能找到DNA上特定的位置。
在定点突变PCR里，这个引物可是特制的呢。
它不是完全和原来的DNA匹配，而是在想要突变的地方故意设计得不一样。
就好像你要把一扇蓝色的门换成红色的，那你做的这把钥匙就得对应红色门的形状，也就是对应突变后的DNA序列。
然后呢，当这个特制的引物和原来的DNA结合的时候，就开始了复制过程。
DNA 聚合酶这个小工匠啊，就沿着引物开始合成新的DNA链。
因为引物是按照突变后的序列设计的，所以新合成的DNA链在这个突变的地方就和原来的不一样啦，就像按照新的设计图盖了一部分房子。
接着一轮一轮的PCR循环，新的、带有突变的DNA链就越来越多。
这个过程就像是一群小工匠，不断按照新的设计来建造房子，慢慢地，原来那种没有突变的DNA就越来越少，而我们想要的带有定点突变的DNA就占了主导地位。
宝子们，你可以想象一下，如果DNA是一个长长的珠链，每个珠子就是一个碱基。
定点突变PCR就是把其中一颗珠子换成另外一种颜色的珠子，而且换得特别精准。
这在科学研究里可太有用啦。
比如说，科学家想研究某个基因里一个碱基改变后对生物会有啥影响，就可以用定点突变PCR来制造这个改变后的基因，然后放到细胞或者生物体内去观察。
这就像是给生物做了个小改造，然后看它会有啥新的表现。
定点突变pcr步骤
定点突变pcr步骤嘿，咱今儿就来讲讲定点突变 PCR 步骤这档子事儿。
你想啊，这定点突变就像是给基因来个精准的小改造，就好比给一个小机器换个关键零件似的。
第一步呢，那得先设计引物。
这引物就像是给基因改造找个精准的引路人，可重要了呢！你得精心设计，不能马虎，不然这后面的路可就走歪啦。
接下来，就是进行 PCR 反应啦。
这就好比是一场基因的大冒险，各种酶啊、核苷酸啊都参与进来，热热闹闹的。
温度一会儿高一会儿低，就像坐过山车似的，刺激得很呢！然后呢，把得到的 PCR 产物处理一下。
这就像是给刚出炉的宝贝加工打磨，让它更精致。
再之后，就是转化啦。
把处理好的产物放到合适的细胞里，就好像给它找了个新家，让它在里面生根发芽。
之后就是筛选啦，要把那些成功突变的小家伙们挑出来。
这可不容易哦，就像在一堆沙子里找金子似的。
最后，还得验证一下，确定是不是真的突变成功啦。
这就好比给改造好的机器来个最终测试，看看是不是真的符合要求。
你说这定点突变 PCR 步骤是不是挺有意思的？就像一场精心编排的大戏，每一步都得演好，不然可就出乱子啦。
想想看，如果引物没设计好，那不就像领错了路，全跑偏啦！要是 PCR 反应出了岔子，那这场冒险不就失败啦？所以啊，每一步都得仔仔细细，不能有一点儿马虎。
咱搞科研的不就是这样嘛，要的就是严谨和细致。
这定点突变 PCR 步骤虽然听起来复杂，但是只要咱一步一步来，肯定能把它搞定。
就像爬山一样，虽然过程累，但爬到山顶看到美景的那一刻，啥都值啦！你说是不是这个理儿？反正我是这么觉着的。
这定点突变PCR 步骤啊，可真是个神奇的过程，能让咱的基因变得更有趣，更有意义。
咱可得好好研究，好好掌握，让它为咱的科研事业添砖加瓦！。
基因定点突变技术.
在酶工业方面：
一般通过定点突变技术获得突变的酶的稳定性效果不 显著，因为酶的稳定性与活性有关。从酶的稳定性与影响 酶活性的条件相关性我们可以得出：蛋白的变性是由高温、 极端ｐＨ、有机溶剂或去污剂的存在诱导而产生的。基于 这些理论，有利于人们选择高稳定性的突变体来改变酶的 结构和功能。
在医药方面：
通过在蛋白质工程中使用定点突变技术，筛选影响抗 生素耐性增强的突变子，对于研发更高效的抗生素具有非 常重要的指导意义。
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
在农业方面：
利用基因某一位点的改变进而来改变蛋白质的一级结 构，以此来改良或改造毒蛋白的活性。同时，还可以利用 突变技术改变结构域中的氨基酸残基，使突变毒蛋白与新 的昆虫受体相结合来扩大杀虫的范围，可以取代具有有机 磷污染 民用杀虫剂。
２、ＤＮＡ缺失改造
心钠素（ＡＮＰ）和干扰素（ＩＦＮ）在临床上 有着非常诱人的应用前景。这两产物在大肠杆菌和酵 母系统中都能以融合蛋白的形式表达出来。但由于在 克隆过程中不可避免地引进了一些没有用的核苷酸序 列，这样表达出来的产物就与天然产物存在着一定的 差异。为了使克隆表达的产物与天然的产物一样，人 们便采用寡核苷酸指导的定点突变技术，成功地对这 些多余的核苷酸进行了缺失改造，以期得到正确的产 物。
基因定点突变技术
定点突破旳措施
• 寡核苷酸介导旳基因突变指用具有突变碱基旳寡聚核苷酸
片断作为引物，在聚合酶旳作用下开启DNA分子进行复 制。
• 盒式突变是利用一段人工合成旳含基因突变序列旳寡核
苷酸片段，取代野生型基因中旳相应序列。
• PCR介导旳基因突变
寡核苷酸介导旳定点突变
• 寡聚核苷酸定点诱 变技术是由加拿大 旳生物化学家 ( michael smith )发明 旳.
在分子生物学和基因工程中旳应用
探明未知序列旳构造和功能旳关系，如开启子诱变筛选，真 核旳TATA盒保守序列拟定。 载体构建：调控元件，强开启子，多接头。 研究基因调控序列，如AUG前加入ACC序列最佳。
在蛋白质工程中旳应用
降低毒性，如TNF 变化亚型和种旳特异性，如IFN旳23位AAG（赖氨酸），AGG （精氨酸），使IFN2a变成IFN2b。123位Try（酪）变甘/丝， 使IFN种属特异性明显变化，对人抗病毒活性不大于牛。 提升活性和稳定性，如IFN- βser17（cys变ser） 提升蛋白质作用旳专一性，如IFNβ旳9-56位被IFNa旳7-54位 取代后，活性提升40倍。
• 定点突变技术旳潜在应用领域很广，例如研究蛋白质相互 作用位点旳构造、改造酶旳不同活性或者动力学特征，改 造开启子或者DNA作用元件，引入新旳酶切位点，提升蛋白 旳抗原性或者是稳定性、活性、研究蛋白旳晶体构造，以 及药物研发、基因治疗等等方面。
应用前景
• 不同于定点突变旳是基于PCR旳随机突变，经过变化PCR条件提 升PCR过程中旳随机犯错，这种措施合用于未知旳蛋白质，作全 局性分析，所以有人称为饱和突变（saturation mutagenesis）。 但是这种措施因为没有目旳性，分析操作相当繁琐，而且不会出 现一种位点2个以上碱基突变，因而应用上有不足。定点突变合 用于蛋白构造已经有初步了解旳基因，比PCR随机突变更有目旳 性，也更为精确，简朴，同步改造基因愈加“随心所欲”。因为 定点突变技术在蛋白质组学中有这非常广泛旳应用前景，相信这 个技术在不远旳将来还会有更大旳改善和发展，也必将为更多人 熟悉应用。
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术原理
基因定点突变技术是现代分子生物学研究中常用的一种技术手段。
该技术可以精准地改变靶标基因的某些特定位点，从而实现研究基因功能、疾病机理等方面的目的。
该技术主要基于人工合成的DNA片段与目标基因的同源重组，以实现基因定点突变。
具体来说，该技术分为两个步骤：首先，利用PCR技术、化学合成等手段，合成出目标基因的突变片段。
其次，将突变片段与目标基因进行同源重组，从而在特定位点引入突变。
基因定点突变技术的主要优点是可以精准地改变目标基因的某些特定位点，不影响其它部分的结构和功能。
同时，该技术可以对不同类型的生物进行操作，包括细菌、酵母、植物、动物等。
因此，该技术在研究基因功能、疾病机理、农业生产等方面具有广泛的应用前景。
- 1 -。
简述定点突变pcr原理
简述定点突变pcr原理亲爱的今天咱们来聊聊定点突变 PCR 这个神奇的玩意儿，保证让你轻轻松松就搞明白它的原理！想象一下，咱们就像是一群超级基因工程师，要对 DNA 这个神秘的密码进行精准改造。
定点突变 PCR 呢，就是咱们手里的神奇魔法棒。
咱们先来说说 DNA 吧，它就像是一个长长的密码串，决定了生物的各种特征。
但有时候，咱们想要让这个密码串发生一点点小变化，来实现咱们的特定目的，这时候定点突变 PCR 就派上用场啦！在这个过程中，咱们得有几个关键的小伙伴。
首先就是咱们的模板 DNA ，这就像是我们要改造的原始蓝图。
然后呢，还有一对特别设计的引物，这俩家伙可是关键中的关键哦！这对引物啊，就像是两个聪明的小向导。
它们可不是随便设计的，而是经过咱们精心谋划的。
它们身上带着咱们想要引入的突变信息。
比如说，咱们想在某个特定的位置把一个碱基换成另一个，这对引物就会在这个位置做出相应的改变。
接下来，PCR 反应就开始啦！就好像是一场热闹的大派对。
在 PCR 反应的锅里，有各种神奇的试剂，模板 DNA 、引物、酶等等都在里面欢快地跳舞。
DNA 会在高温下解开双链，就像是把紧紧抱在一起的双胞胎给分开。
然后，引物就会迅速地找到它们对应的位置，紧紧地贴上去，就像找到了自己的归属。
然后呢，在酶的帮助下，新的 DNA 链就开始合成啦！因为引物带着咱们设计好的突变信息，所以新合成的 DNA 链就会有咱们想要的突变啦！一轮 PCR 反应结束后，咱们就得到了一部分带有突变的 DNA 。
但是别着急，这还不够呢！咱们还要再来几轮，让带有突变的 DNA 越来越多，直到成为咱们的主力军。
经过一轮又一轮的 PCR 反应，最后咱们就能得到大量含有定点突变的 DNA 啦！是不是感觉超级神奇？其实啊，定点突变 PCR 就像是一场精心策划的基因改造大作战。
咱们通过巧妙地设计引物，利用 PCR 反应的强大力量，实现对 DNA 密码的精准修改。
定点突变pcr[宝典]
![定点突变pcr[宝典]](https://img.taocdn.com/s3/m/f0e9c039dc36a32d7375a417866fb84ae45cc33f.png)
人血管生长因子基因（hVEGF）的PCR定点突变实验原理PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至95℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
目的学会引物的设计、PCR扩增及巩固琼脂糖凝胶电泳分析。
主要内容1、PCR引物设计的最基本注意事项；2、PCR扩增中的注意事项；3、PCR产物的琼脂糖凝胶电泳分析。
VEGF成熟基因序列：GgatccGCACCCATGGCAGAAGGAGGAGGGCAGAATCA TCACGAAGTGGTGAAGTTCA TGGA TGTCTA T CAGCGCAGCTACTGCCA TCCAA TCGAGACCCTGGTGGACA TCTTCCAGGAGTACCCTGATGAGA TCGA GTACA TCTTCAAGCCATCCTGTGTGCCCCTGATGCGATGCGGGGGCTGCTGCAA TGACGAGGGCCTGG AGTGTGTGCCCACTGAGGAGTCCAACATCACCA TGCAGA TTA TGCGGATCAAACCTCACCAAGGCCA GCACA TAGGAGAGA TGAGCTTCCTACAGCACAACAAATGTGAATGCAGACCAAAGAAAGA TAGAGCA AGACAAGAAAATCCCTGTGGGCCTTGCTCAGAGCGGAGAAAGCATTTGTTTGTACAAGA TCCGCAGA CGTGTAAA TGTTCCTGCAAAAACACAGACTCGCGTTGCAAGGCGAGGCAGCTTGAGTTAAACGAACG TACTTGCAGA TGTGACAAGCCGAGGCGGTGA突变酶切位点Ggatcc（BamH1）GAATTC（EcoR1）引物VEGF165-Primer-上游：5’- GAA TTCGCACCCA TGGCAGAAGGAGGAG-3’VEGF165-Primer下游：5’- GCAAGCTTTTAGTCTAGACGCCTCGGCTTGTCACA TC-3’实验步骤1 按下列比例加入试剂PCR反应体系如下：试剂终浓度加量（25 µL）10×Buffer 1× 2.5 µL25 mM MgCl2 1.5 mM 1.5 µL10 mM dNTP s 0.2 mM 0.5 µL5 U/μL Taq 酶 1 U 0.2 µL10 μM 上游引物 1.0 µL10 μM 下游引物 1.0 µL模板0.5 µL补加ddH2O 至25 µL2 进行PCR扩增PCR反应条件：95 ℃预变性，4 min，一个热循环；95 ℃热变性30 s，53 ℃褪火30 s，72 ℃延伸45 s，28个热循环；72 ℃复性10 min；16 ℃保存。
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温度（℃）
94
循环1
94℃变性 （1min）
循环2
循环3
72 60 60 ℃退火 （1min）
72 ℃延伸 （1.5min）
时间（min）
PCR反应的温度循环周期
PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引 物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反 应参数是94℃变性1min， 60 ℃退火1min， 72 ℃ 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增 产物的数量满足实验需求为止。
5’ (a) (b) 引物2 5’ 3’ 5’ (c) 引物2互补链 3’
(d)
靶DNA的扩增
3’ 3’ 5’ 引物1 3’ 引物1互补链
5’
新引物
3’ 5’
5’ 3’
(e)
不同长度的链
单位长度的链
(f)
引物2互补链
5’ 3’
3’ 5’
引物1互补链
(g)
目的片段（不同长度的链未示出）
聚合酶链式反应示意图
1× 29× 1×
*This cycle is normally included in a PCR assay in order to allow any “unfinished” product from previous amplification to achieve its full length
所用酶类
T4噬菌体聚合酶：诱变几率65% T7噬菌体聚合酶：3‘-5’外切活性强，持 续合成DNA的能力强，遇到引物时会停 止。诱变几率83% KlenowDNA聚合酶：前端有引物或双链 时，可能会替换。诱变几率36%
影响因素
1 引物：热动力学（配对），突变碱基 的左右8-10bp 2 T4连接酶 3 5’端磷酸化 4 单链结合蛋白：解决颈环结构
1 2 3 4 5
结构和功能 基因的注释 代谢途径-分子育种 蛋白质的修饰 分子设计-分子进化工程
缺失诱变
1 简单缺失 通过对DNA片段中具有的相应的酶 切位点进行切割，而后用T4连接酶进行 连接。 2 系统缺失 核酸外切酶III、S1核酸酶、Klenow大 片段
插入突变
1 2 3 4
人工合成片段 Transposon insertion （Tn5） 同源重组 PCR
基 因 的 体 外 诱 变
Kunkel法 或称”U”法
dut -
：dUTP酶（dUTPase）缺陷，细胞不
能把dUTP转化为dUMP,因此细胞内dUTP的含 量大为增加，其中一些dUTP可掺入DNA中正 常情况下有“T”占据的位置。
Typical PCR Thermal Profile
Program
94℃ (first step) 1min 1min 1min
37—60℃ (second step) 1min 1min 1min
72℃ (third step) 1min 1min 10min
Reps
Cycle1 Cycle2—30 Cycle31*
Description
Thermus aquaticus strain YT1 94 kd 72--80℃ 150 nucleotides/sec/molecule >50% at 95℃ for 40 min 1.1×10-4 substitutions per cycle >0.5mM<10mM 5’ to 3’only 5’ adenosines
Some DNA Polymerases Used in PCR
Enzyme
Klenow Sequenase Taq BstE Pfu Tth UlTma
Microbial Source
Escherichia coli T7 bacteriophage Thermus aquaticus Bacillus stearothermophilus Pyrococcus furiosus Thermus thermmophilus Teratoga mariti Yes Yes Yes Yes Yes
Characteristics of Taq Polymerase
Characteristics
Origin Molecular weight Optimal temperature Activity Stability Fidelity Mg2+ concentration Exonuclease activity Transferase activity
寡核苷酸定点诱变技术
M.Smith（加拿大生物化学家） 1993年诺贝尔化学奖，1978年发明了 寡核苷酸定点诱变技术。 利用寡核苷酸定点诱变技术，可以 认为地通过基因的改变来修饰、改造某 一已知的蛋白质，从而可以研究蛋白质 的结构及其与功能的关系、蛋白质之间 的相互作用。
基因诱变的应用
基因扩增（gene amplification）
主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿 主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩 增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增
PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗 传研究室的科学家K.B.Mullis发明 的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基 因或DNA序列的方法，有称之为体 外扩增法。
ung -：UDG酶缺陷，UDG酶（尿嘧啶-N-糖
基化酶）可除去DNA中的尿嘧啶
E.Coli （dut-，ung-）
合成的DNA中含有尿嘧啶，M13噬菌体 DNA中将含有20-30个尿嘧啶碱基。
CJ236(dut-，ung- ，F+ )
ssDNA制备载体
1 单链噬菌体载体 M13 2 phagemid载体-辅助噬菌体
Reaction Condition for a Typical PCR Assay
Parameter
Template pH dNTPs Gelatin Primers Mg2+ oncentration Enzyme Total volume
Concentration
10 attomoles(~1×106 molecules) 8.4（10mM Tris-Hcl） 200 μ M(each one) 100 g/ml (optional) 0.5 μ M(each one);(0.1—1.0μ M) >0.5mM< 10mM 1 unit 25—100μ l