sirna转染常见问题解答
sirna转染常见问题解答
siRNA转染常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA 与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
siRNA细胞转染实验操作指南
siRNA细胞转染实验操作指南siRNA产品的最佳工作浓度、转染后检测时间因不同的细胞类型和研究目的而异。
一般推荐的siRNA工作浓度为50nM，检测时间为转染后24~72h。
可以通过设置时间梯度和浓度梯度进行组合实验来选择最优的siRNA工作浓度和检测时间。
由于siRNA过量会对细胞产生毒性，实验建议的siRNA 工作浓度优化的范围为5~100nM。
下面以Lipofectamine 2000转染24孔板的293T细胞为例，选取50nM的siRNA工作浓度，介绍siRNA转染细胞的操作步骤。
若使用其他的转染试剂，请参照对应的产品说明书进行操作。
1.在转染前一天，按1×105~5×105个/孔的量将细胞接种于不含抗生素的完全培养基中，使次日转染时细胞融合度30-50%为宜。
接种时尽量保证每孔细胞的接种数量一致，使细胞均匀地平铺在生长表面。
注意:降低转染时的细胞密度可延长转染和收样的时间间隔，避免细胞过度生长对实验结果造成影响。
可根据细胞特性和实验目的等，调整接种时的细胞密度。
2.每个待转染的细胞样品（每个培养孔），按以下体系配置转染所需的siRNA-Lipofectamine 2000复合物:（1）配制稀释液A:取25pmol siRNA于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀。
（*siRNA的用量计算参照表1）（2）配制稀释液B:使用前先将Lipofectamine 2000轻轻混匀，取出1ul于50ul Opti-MEM无血清培养基中稀释，轻轻混匀，室温下孵育5分钟。
注意孵育时间不能超过25min。
（3）孵育完成后，将稀释液A与B轻轻混匀得到siRNA-Lipofectamine 2000复合物，在室温下孵育20分钟。
此时溶液可能会浑浊，属于正常现象。
表1 不同细胞培养板siRNA 转染用量参考表3.将孵育好的siRNA-Lipofectamine 2000复合物分别加到对应的细胞孔中，轻轻混匀。
sirna转染实验步骤及实验要点
sirna转染实验步骤及实验要点siRNA转染实验步骤如下：1.细胞接种：提前一天将细胞种植在24孔板中，以转染时细胞汇合度在30%左右为宜，转染前全培养基总量为0.45ml。
2.转染过程：•取0.67μg (50pmol) 的siRNA，加入一定量无血清稀释液，充分混匀，制成RNA稀释液，终体积为25μl。
注意：无血清稀释液建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640。
•取1μl的EntransterTM-R4000，然后加入24μl无血清稀释液体，充分混匀，制成EntransterTM-R4000稀释液，终体积为25μl。
室温静置5分钟。
•将EntransterTM-R4000稀释液和RNA稀释液充分混合（可用振荡器振荡或用加样器吹吸10次以上）混合，室温静置15分钟。
转染复合物制备完成。
•将50μl转染复合物滴加到有0.45ml全培养基（可含10%血清和抗生素）的细胞上，前后移动培养皿，混合均匀。
注意：对本试剂，采用含血清的全培养基有助于提升转染效率。
•转染后6小时观察细胞状态，如状态良好可不必更换培养基，继续培养24-96小时得到结果。
3.观察和检测：根据具体实验需求，可以在转染后的不同时间点观察细胞状态、检测基因表达、蛋白质表达等。
实验要点：1.细胞接种密度要适宜，一般在30%左右汇合度较好。
2.无血清稀释液的选择对于siRNA的稳定性和转染效率至关重要。
建议采用OPTI-MEM、无血清DMEM或1640等品牌。
3.在制备转染复合物时，要保证各个步骤的混合均匀，避免产生气泡。
4.在将转染复合物加入细胞时，要保证细胞的生存环境，避免对细胞造成损伤。
5.在转染后的观察和检测中，要注意保证实验结果的准确性和可靠性。
以上信息仅供参考，建议查阅专业文献获取更准确的信息。
RNAi和siRNA
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1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省 时间，还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作 用的时间到2周。
2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较 好，效应持续时间长。
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2. 采用SIRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最 方便，成本高，适用于长期使用特定siRNA
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4.哺乳动物系统的RNAI实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基 因表达抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞 的增殖速度和siRNA的有效性。大部分RNAi实验 可以在此时间段获得结果，而且可以通过再次转 染获得超过1周的基因表达抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的 基因表达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择 shRNA表达载体较为合适。
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5.RNAI效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和 蛋白水平表现，也可能会在细胞形态等生理学 方面表现。
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第二部分 哺乳动物系统的RNAI实验设计
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主要内容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实验 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
RNAI和 SIRNA转染
精品文档1内容来自第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
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第一部分 RNAI实验基本概念
siRNA转染 Protocol
siRNA转染实验是一种常用的基因沉默技术，其基本原理是通过将小干扰RNA（siRNA）引入细胞，从而在翻译水平上抑制特定基因的表达。
以下是siRNA转染的实验原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、实验原理siRNA是一种21-23个核苷酸长的双链RNA，它与靶基因的mRNA 序列互补，通过碱基配对原则与mRNA结合，抑制基因表达。
siRNA 转染实验是通过将siRNA转入细胞内，利用细胞内自然存在的RNA 干扰机制，在转录后水平抑制基因表达。
这种技术具有高效性、特异性和可逆性等特点，被广泛应用于基因功能研究、药物筛选和疾病治疗等领域。
二、所需试剂和耗材1.试剂：o siRNA：针对特定基因的siRNA分子。
o转染试剂：如Lipofectamine、JetPrime等，用于将siRNA转入细胞。
o培养基：如DMEM、F12等，用于细胞培养。
o血清：如胎牛血清，提供细胞生长所需的营养物质。
o抗生素：如青霉素、链霉素等，用于防止细胞污染。
2.耗材：o细胞培养瓶、板：用于细胞培养。
o离心管：用于离心和分离细胞。
o移液器及枪头：用于精确加样。
o过滤器：用于过滤溶液中的杂质。
o无菌水：用于稀释和配制溶液。
三、实验仪器1.实验室搅拌器：用于混合溶液。
2.高速冷冻离心机：用于离心和分离细胞。
3.水浴锅：用于加热溶液。
4.无菌工作台或超净工作台：用于进行无菌操作。
5.分光光度计：用于测量细胞生长状况和转染效率。
6.荧光显微镜：用于观察细胞转染后荧光蛋白的表达情况。
7.CO2培养箱：提供细胞培养所需的气体环境。
8.显微镜：观察细胞的生长状态和siRNA转染后的细胞变化。
9.细胞计数板或细胞计数仪：用于细胞计数，确定细胞的密度和生长状态。
10.酶标仪或多功能读板仪：用于检测细胞因子的浓度。
四、实验准备工作1.确认细胞系和siRNA：实验前要明确所使用的细胞系以及针对的目标基因。
siRNA 使用说明(两篇)
引言概述：siRNA（小干扰RNA）是一种小分子RNA片段，具有靶向特异性和高效沉默靶基因的能力。
本文将详细介绍siRNA的使用说明，主要包括siRNA的设计、转染方法、转染效率的评估、靶基因沉默效果的验证以及操作注意事项。
通过本文的阐述，用户能够更好地了解和掌握siRNA的使用方法，从而实现对目标基因表达的特异沉默。
正文内容：一、siRNA的设计1.确定靶基因：首先需要明确自己要沉默的目标基因，可以通过文献调研、数据库查询等方式确定目标基因。
2.设计siRNA序列：根据目标基因的序列信息，可以使用在线工具或者软件进行siRNA序列的设计。
siRNA的设计需要满足一定的规则，如目标序列的选择、GC含量、二次结构等方面的考虑。
二、siRNA的转染方法1.载体选择：siRNA可以通过多种载体转染到细胞内，如质粒转染、病毒载体转染等。
根据实验需要和细胞特性，选择适合的转染载体。
2.转染试剂：根据实验需要，选择适合的转染试剂，如化学转染试剂、电穿孔法等。
3.转染条件优化：对于每个细胞系和siRNA，转染条件需要进行优化，包括转染试剂浓度、转染时间、细胞密度等。
三、siRNA转染效率的评估1.转染效率的检测：可以通过荧光探针标记siRNA，利用荧光显微镜观察转染效率。
2.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，来评估siRNA的沉默效果。
3.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来评估siRNA的沉默效果。
四、靶基因沉默效果的验证1.实时荧光定量PCR：通过检测靶基因mRNA的降解情况，可以验证siRNA的沉默效果。
2.Westernblot：通过检测靶基因蛋白的表达水平，来验证siRNA的沉默效果。
3.功能实验：通过观察细胞的表型变化、增殖能力的变化等方面，来验证siRNA的沉默效果。
五、操作注意事项1.siRNA的保存：应在20°C下保存，避免反复冻融。
2.转染前的细胞处理：细胞的状态和密度对转染效率有影响，应注意细胞的处理方法和细胞密度的选择。
转染讨论
最好同时设计几对，选择效果较好的，别忘了做对照（GFP）,排除非特异性干预2.对于转染后的效应检测，体外直接合成的SiRNA多半在48h检测，也有72H的，但时间再长有可能降解而失去功效。
对于用U6或H1质粒载体体内转录生成siRNA的，因为有一个转录时间，所以检测可以稍靠后；而且，与体外合成的相比，虽然载体也不能大量整合到细胞基因组中，但毕竟不会马上降解，Knockdown的时间效应相对要长，一般一周左右没有问题。
所以可以在检测时做一个时间梯度，使实验数据更加丰满完善一些。
（但要考虑靶细胞生长特性，疯长的可能效果较差）一般在转染后4－6小时补加血清，可以就在你原来的无血清培养基中滴两滴血清。
如果你觉得LF2000可能对你的细胞有毒性作用的话（一般LF2000的毒性不至于很大，可以不用更换培养基，具体看你细胞的生成状态了），你可以把原来的无血清培养基吸出来，更换成含血清的培养基。
在转染后的4－6小时，最好不要动你的细胞，让它安静地躺着，因为此时细胞最为脆弱，不合适的动荡会使其死亡率增加。
lipofectamine2000转染后在6小时左右最好换液且换为有血清的血清，其一因为lipofectamine2000对细胞的毒性作用还是有的，其二可降低因血清的缺乏引起的细胞的死亡。
转染时不加血清是防止血清的干扰作用，转染后可适时加入。
加入过早会引起未转染细胞的优势生长，过晚会引起较多细胞死亡。
可时时观察1/5细胞变圆的时候加入血清。
转染全程都不应加有抗生素的，我刚刚做完LP2000转染的，把我的一点经验告诉你啊： 1.加完脂质体DNA混合物后细胞就出现小黑点，这很正常的，因为LP2000即使毒性再小它也是有毒性的，减轻的办法就是4－5小时把混合物去掉换有血清的新培养基培养，我做之前看有些战友的意见毒性大3小时换也行的。
2.我的是在无血清的DMEM下转的，推荐买OPTI-MEM，但到货一个月，我也没用，不过还可以的3.多摸几个浓度比例，找出最适合的，如果有报告基因就最好了，但是我的也没有。
siRNA的转染
siRNA的转染将制备好的siRNA，siRNA表达载体或表达框架转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：1.磷酸钙共沉淀将氯化钙，RNA(或DNA)和磷酸缓冲液混合，沉淀形成包含DNA且极小的不溶的磷酸钙颗粒。
磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮进入目的细胞的细胞质。
沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。
在实验中使用的每种试剂都必须小心校准，保证质量，因为甚至偏离最优条件十分之一个pH都会导致磷酸钙转染的失败。
2.电穿孔法电穿孔通过将细胞暴露在短暂的高场强电脉冲中转导分子。
将细胞悬浮液置于电场中会诱导沿细胞膜的电压差异，据认为这种电压差异会导致细胞膜暂时穿孔。
电脉冲和场强的优化对于成功的转染非常重要，因为过高的场强和过长的电脉冲时间会不可逆地伤害细胞膜而裂解细胞。
一般，成功的电穿孔过程都伴随高水平（50%或更高）的毒性。
3.DEAE-葡聚糖和polybrene带正电的DEAE-葡聚糖或polybrene多聚体复合物和带负电的DNA分子使得DNA 可以结合在细胞表面。
通过使用DMSO或甘油获得的渗透休克将DNA复合体导入。
两种试剂都已成功用于转染。
DEAE-葡聚糖仅限于瞬时转染。
4.机械法转染技术也包括使用机械的方法，比如显微注射和基因枪（biolistic particl e）。
显微注射使用一根细针头将DNA，RNA或蛋白直接转入细胞质或细胞核。
基因枪使用高压microprojectile将大分子导入细胞。
5.阳离子脂质体试剂在优化条件下将阳离子脂质体试剂加入水中时，其可以形成微小的（平均大小约100-400nm）单层脂质体。
这些脂质体带正电，可以靠静电作用结合到DNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。
因此使用阳离子脂质体转染的原理与以前利用中性脂质体转染的原理不同。
使用阳离子脂质体试剂，DNA并没有预先包埋在脂质体中，而是带负电的DNA自动结合到带正电的脂质体上，形成DNA-阳离子脂质体复合物。
siRNA转染过程中常见问题及解答
siRNA转染过程中常见问题及解答
1. RNA与转染试剂比例不佳
由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。
2. 细胞密度不佳
调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。
成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。
由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。
如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。
3. RNA效率不高
选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。
siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。
4.转染试剂不合适
选择专门针对siRNA转染的试剂，如Entranster试剂。
转染中常见小问题及解决方法
在DNA转染和DNA-siRNA共转染过程中，细胞密度控制在60~70%之间；在siRNA转染过程中，细胞密度控制在50%左右。
使用了次优化的反应条件，如转染试剂的用量，DNA的用量以及DNA-转染试剂复合物形成时间等参数未优化。
如果您不清楚最优化的反应条件或者不知道如何针对待转染细胞进行条件优化，请致电或发邮件至info@寻求技术支持。
严格控制细胞生成条件，务必使每一次转染时细胞的密度较为均一。如果细胞传代太多，建议重新复苏一批新鲜细胞进行培养。
转染试剂
有时呈云
雾状浑浊
转染试剂储存温度太低
请务必不要低温保存转染试剂，+4℃环境即可；如果将转染试剂误放在-20℃以下环境，建议将冰冻的转染试剂(LipoD293™和LipoJet™转染试剂除外)温浴10分钟后，待完全融化后，再进行转染操作。一般情况下不会导致转染效率降低。
转染复合物的最佳放置时间和温度是室温条件下10~20分钟，长时间放置会显著地降低转染效率，请务必控制放置时间在20分钟之内。
使用LipoD293™和PolyJet™转染试剂时，细胞的密度太低
使用LipoD293™和PolyJet™转染试剂时，细胞的密度控制在~70%为宜
高转速离心转染复合物
在形成转染复合物时，标准操作步骤推荐数秒内涡旋混合转染试剂和DNA或siRNA以生成高效转染复合物。如果想将粘附于管壁的复合物离心到管底，请务必使用极低转速离心，如80g离心5秒钟足够，离心转速太高将显著降低转染复合物的转染效率。
确定转染效率的方法学问题
建议每次转染时，设定一个阳性对照，如绿色荧光蛋白(GFP)。
所使用DNA的启动子不能被待转染细胞所识别
在转染实验前，请确认所转染DNA确实能在待转染细胞内表达。
sirna小干扰rna转染程序
siRNA小干扰RNA 转染程序将制备好的siRNA和其表达载体转导至真核细胞中的方法主要有以下几种：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（显微注射和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
目录一、转染方法哺乳动物转染的常见方法有：磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE-葡聚糖和polybrene、机械法（例如，和基因枪）、阳离子脂质体试剂，其中阳离子脂质体试剂转染法是目前最常用的转染方法。
二、脂质体型转染(一)注意事项1.转染试剂的用量2.si（小干扰）的用量3.转染时的细胞密度4.转染时的操作顺序5.细胞与转染试剂/si（小干扰）复合物的温浴的时间(二)SiMi转染试剂选择最适合的转染试剂和转染条件，往往取决于不同的哺乳动物细胞类型和不同的核酸分子.SiMiTransfectionReagents适用于核酸的体内和体外操作，可应用于DNA、、反义寡核苷酸、si（小干扰）的转染，也可应用于DNA/si（小干扰）的共转染操作；是一种新型的高效si 转染试剂。
(三)SiMi应用领域1.原代培养细胞和细胞株的基因转染2.si（小干扰）高通量转染试验3.DNA转染；DNA和si（小干扰）的共转染4.核酸（si、DNA、）的体内导入试验5.贴壁细胞和悬浮细胞转染(四)SiMi特点1.不必更换培养基，操作简便易行，可在半小时内完成操作2.在含血清培养基中也能表现高转染效率3.细胞毒性低；适用细胞广泛4.即用型试剂，可在含有抗生素的完全培养基中转染5.基于脂质的转染试剂，确保没有se活性6.可介导si（小干扰）高转染细胞及体内si（小干扰）的高效导入三、适用细胞类型SiMiTransfectionReagents转染试剂可广泛应用于多种细胞系的DNA和si（小干扰）转染如：HeLa(人颈部癌细胞)、MCF-7(人乳房癌细胞)、Hep3B(人肝细胞癌细胞)、COS-7(猴肾细胞)、Neuro-2a(鼠神经母细胞瘤细胞)、NIKS(人角质化细胞)、B16(鼠黑素瘤细胞)、DLD-1(人结肠癌细胞)、NIH/3T3(鼠胚胎成纤维细胞)、HT-29(人结肠腺癌细胞)、A549(人肺癌细胞)、CHO-k1(仓鼠卵巢细胞)和293(腺病毒5DNA的人胚胎肾细胞)，SVRbag4细胞等。
siRNA实验方法和设计常见问题解答
siRNA实验方法和设计常见问题解答转载请注明来自丁香园发布日期：2012-09-20 11:35 文章来源：丁香园分享到：收藏夹新浪微博腾讯微博开心网豆瓣社区人人网关键词：RNA miRNA 技术专题锐博生物丁香通丁香园点击次数：1080Q:如何选择转染方法和转染试剂A:我们的siRNA适用于各种转染方法。
转染方法和转染试剂的选择，需要根据细胞来选择，对于容易转染的细胞，常用的转染方法是脂质体转染。
Q:对于难转染的细胞，应该如何提高其转染效率转染效率又该如何确定A:1)对于贴壁细胞，推荐采用转染试剂转染即可；2)对于难转染的细胞的转染，如何提高转染效率的问题也是目前研究的技术难题。
一般建议使用电转的方法，但是由于电转的方法对细胞损伤比较大，该方法也未必是最佳的。
转染效率的确定，常用的是使用荧光标记的siRNA，通过荧光显微镜，共聚焦显微镜，流式细胞仪检测的方法。
具体可以参考我们的产品说明书。
Q:细胞的转染效率是否与siRNA序列相关A:转染效率的高低取决于与细胞自身及转染方法，而于siRNA的序列并没有直接关系。
因此，siRNA在不同的细胞转染效率可能不一样。
Q:转染siRNA时候的细胞密度多少为宜A:依不同的转染方法或转染试剂而定。
如使用lipofectamine 2000作为转染试剂，单独转染siRNA，30%～50%密度较佳；而siRNA与质粒共转染，密度可以到80%-90%。
Q:siRNA转染时的培养基要求，可否含血清A:不同的转染试剂可能有不同的要求，对于lipofectamine 2000，在配制siRNA和lipofectamine 2000混合物时不能含有血清，但细胞培养基可以含有血清，但不能含有抗生素。
Q:siRNA的储存液体浓度和工作浓度有何区别A:siRNA的贮存浓度就是保存的最佳浓度，锐博推荐的贮存液浓度为20 μM；而siRNA的工作浓度就是使siRNA能够达到最佳沉默效果的转染浓度，一般10～100 nM范围内，锐博生物推荐的转染浓度是50nM。
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明 (2)
siRNA-mate 转染试剂使用步骤及说明产品介绍与其它转染试剂比较，siRNA-mate 转染效率高、细胞存活率高、毒性小。
可广泛用于瞬时和稳定转染，也可以应用于蛋白表达和基因功能的研究。
转染试剂保存在4℃，有效期2 年。
重要提示1. 细胞的状态：转染时贴壁细胞的密度以30 - 50%为佳，而且转染时细胞应处在生长旺盛的对数生长期。
细胞密度过高和细胞传代数过高会影响转染效果。
2. siRNA 的质量：使用高纯度的siRNA 也是转染成功的关键。
在转染前需确定siRNA 的含量和纯度，实验过程中需要使用DEPC 处理过的耗材和试剂，注意避免RNase 污染。
3. 血清的影响：在制备siRNA-mate和siRNA 形成复合体过程中不能添加血清，建议用OPTIMEM 或其他无血清培养基（如DMEM、RPMI-1640 等）稀释siRNA 和转染试剂，以达到复合物形成的最佳效果。
但是，在随后的转染过程中，血清的存在并不影响复合体的转染效果。
4. 转染试剂的用量：对于一定量的siRNA 建议尝试按照推荐剂量的siRNA-mate 转染试剂进行优化，以确定最佳的转染效率。
以24 孔板为例，每10pmol siRNA 可使用0.5 μl，1 μl，1.5 μl 和2 μl 转染试剂作为初步实验条件。
操作流程（24 孔板）以24孔板为例，若要检测基因沉默的效果，推荐最低siRNA 终浓度10 nM；若要在显微镜下从荧光强度看转染效率，因荧光信号被检测到需要一定的敏感度，推荐siRNA 终浓度50 nM。
遵循以下操作方法可以高效地将siRNA 转染贴壁和悬浮培养的多种真核细胞。
但是对某些特殊的细胞系和培养条件，或特殊应用等，也许需要单独特别优化。
A. 细胞铺板贴壁细胞数量：在转染实验之前的18 - 24 个小时，在每个孔的500 μl 生长培养基中加入1.5 - 3.5 × 104 个细胞（确保转染时细胞密度在30- 50%）。
siRNA解答
吉玛公司提供的siRNA是双链的还是单链的？吉玛公司的siRNA是双链的,而且也是按照双链来定价的。
吉玛公司RNA寡核苷酸使用什么纯化方法？吉玛公司运用国际上通用的HPLC纯化，如果特殊需要可以进行PAGE纯化。
合成RNA寡核苷酸的最大长度是多少？目前RNA寡核苷酸的最大长度是40碱基。
我们需要提供什么信息用于siRNA的合成？你们可以帮助免费设计吗？您需要准确地提供siRNA的19个核苷酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的GeneID 或者Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。
如何选择siRNA的悬垂组成？悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。
最近研究表明悬垂的组成在mRNA靶识别和酶解中不是很重要。
悬垂可能在形成RISC的过程中起结构的作用。
很多研究人员选择dTdT是因为研究表明脱氧核糖核苷能保护siRNA免受酶解。
合成序列最重要的是确定靶mRNA的19个碱基的核心结构。
针对人体基因设计的siRNA对其他物种是否也有效？一般siRNA都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的siRNA不会沉默其他物种的同源序列。
然而，也有研究表明siRNA经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行siRNA设计和生物信息学分析。
你们提供的siRNA是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？吉玛公司为您提供的siRNA是冻干粉包装的，在常温下运输。
这些冻干的样品在室温下能稳定保存2－4个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。
但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。
在体外实验中，需要多少量的siRNA？我们建议您用于实验的siRNA的浓度为100nM。
1nmol siRNA的量对于一个24孔板或是96孔板的实验已经足够了。
用100nM 的siRNA转染时只得到50%沉默效率，我可以把siRNA的浓度增加到200nM甚至400nM吗？增加siRNA的浓度一般不能改进沉默效率。
荧光标记的siRNA转染方法及步骤
荧光标记的siRNA转染方法及步骤一、荧光标记的siRNA转染效率的高低可以通过观察荧光标记(FAM、CY3、CY5)的siRNA转染细胞后的荧光强度判断。
荧光标记的siRNA转染细胞后，可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测，确定转染是否有效及转染条件。
荧光标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记杭体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
二、使用荧光标记的siRNA检测转染效率荧光标记的siRNA的溶解及保存1.由于OligoRNA是很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开离心管前先离心，10000 rpm，2 min然后再慢慢打开管盖，溶解时加适量DEPC 水后盖上管盖，振荡溶解。
2.需要浓度20μM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？1 OD的siRNA，加入125μl附送的DEPC水,溶解后终浓度为20μM。
3.贮存和稳定性：-20°C ,避光保存，冻干粉或液体。
液体(贮存浓度为20μM)避免反复冻融，GenePharma保证在上述条件下siRNA oligo冻干粉的稳定性可达到6个月，液体状态下建议3个月内使用完。
转染1.使用lipo fectamin2000转染的步骤(以贴壁细胞为例，仅供参考)a.以24孔培养板操作为例(其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000manual”)，转染前一天，将0.5-2×105个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500μl含血清的完全培养基，使转染时的细胞密度能够达到70%；b.取1μl/孔Lipo fectamine2000(使用前轻轻摇匀)，用50μl Opti-MEM I ReducedSerum Medium稀释。
轻轻混和后在室温孵育5 min ;c.取2μl荧光-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释，轻轻混和均匀;d.稀释的Lipofectamine2000(步骤b)经过5min的孵育后，与稀释荧光-siRNA(步骤c)轻轻混和，室温静置20min，以形成荧光-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液出现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。
rna干扰常见问题解答
RNA干扰常见问题解答SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在50-100nM。
RNAi和siRNA转染
内 容
第一部分
RNAi实验基本概念
第二部分
第三部分
RNAi实验具体设计
siRNA转染过程相关问题及解答
第一部分
RNAi实验基本概念
主要内容
1.RNAi的概念
2.RNAi的启动途径
3.非哺乳动物系统的RNAi实验 4.哺乳动物系统的RNAi实验 5.RNAi效应表现
hairpin RNA ）表达载体在细 胞内表达shRNA后，在 Dicer作用下形成 siRNA 分子，导致 RNAi 的发生。可能具有细胞毒性。
shRNA可能通过 竞争Exportin-5 造成致命毒性
3.非哺乳动物系统的RNAi实验
如线虫、果蝇等不涉及抗病毒免疫应答反应，
可通过与靶基因序列互补的长链 dsRNA （通常 >200bp）介导RNAi的发生 。
第三部分sirna转染过程相关问题及解答?1sirna转染过程相关问题?2sirna转染疑问解答1sirna转染过程相关问题?1转染细胞数量的问题?2转染时sirna工作浓度?3转染时血清的问题?4转染时抗生素的问题?5转染过程?6转染后换液的问题?7转染条件优化的问题?8rnai效应检测方法1转染细胞数量的问题?细胞数量
主要内容
1.
需要短期抑制还是长效抑制?
2.
3. 4. 5. 6.
采用siRNA进行实验的途径
构建shRNA表达载体进行实验 siRNA设计需要注意的问题 脱靶效应 转染是RNAi实验的瓶颈
1.需要短期抑制还是长效抑制?
1 周以内，采用 siRNA 较好，无需构建载体，节
高的siRNA转染；
代表产品有 invitrogen 公司的 lipofectamineTM
荧光标记的siRNA转染方法及步骤
荧光标记的siRNA转染方法及步骤一、荧光标记的siRNA转染效率的高低可以通过观察荧光标记(FAM、CY3、CY5)的siRNA转染细胞后的荧光强度判断。
荧光标记的siRNA转染细胞后，可以用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪等检测，确定转染是否有效及转染条件。
荧光标记的siRNA还可用作siRNA胞内定位及双标记实验(配合标记杭体)来追踪转染过程中导入了siRNA的细胞，将转染与靶蛋白表达的下调结合起来。
二、使用荧光标记的siRNA检测转染效率荧光标记的siRNA的溶解及保存1.由于OligoRNA是很轻的干膜状附在管壁上，打开时极易散失，所以打开离心管前先离心，10000 rpm，2 min然后再慢慢打开管盖，溶解时加适量DEPC 水后盖上管盖，振荡溶解。
2.需要浓度20μM的样品，如何计算重悬siRNA缓冲液的量？1 OD的siRNA，加入125μl附送的DEPC水,溶解后终浓度为20μM。
3.贮存和稳定性：-20°C ,避光保存，冻干粉或液体。
液体(贮存浓度为20μM)避免反复冻融，GenePharma保证在上述条件下siRNA oligo冻干粉的稳定性可达到6个月，液体状态下建议3个月内使用完。
转染1.使用lipo fectamin2000转染的步骤(以贴壁细胞为例，仅供参考)a.以24孔培养板操作为例(其他孔板各种的试剂用量，请参照“Lipofectamine2000manual”)，转染前一天，将0.5-2×105个细胞接种于培养板中，每孔中加入约500μl含血清的完全培养基，使转染时的细胞密度能够达到70%；b.取1μl/孔Lipo fectamine2000(使用前轻轻摇匀)，用50μl Opti-MEM I ReducedSerum Medium稀释。
轻轻混和后在室温孵育5 min ;c.取2μl荧光-siRNA，用50μl Opti-MEM I Reduced Serum Medium稀释，轻轻混和均匀;d.稀释的Lipofectamine2000(步骤b)经过5min的孵育后，与稀释荧光-siRNA(步骤c)轻轻混和，室温静置20min，以形成荧光-siRNA-转染试剂混和物，如果溶液出现浑浊，属于正常现象，不会影响转染效果。
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siRNA转染常见问题解答
SiRNA导入细胞有以下几种方法：化学转染技术、电穿孔法、磷酸钙共沉淀技术、显微注射和载体导入技术。
选择时应该依据实验条件考虑以下因素：细胞对转入方式的承受能力、细胞对病毒侵染的易感性、细胞的生长特性等。
其中，化学转染技术是目前最为常用的方法，由于电转的方法对细胞损伤比较大，一般不建议选择电转。
针对最常见的化学转染技术，有几种常见的问题以及解决方法。
一、哪种转染试剂效果好？
在选择转染试剂时，一般要考虑的是结合特定的细胞株，而不是被导入细胞中的物质。
选择细胞毒性小，转染效率高的转染试剂。
脂质体试剂的毒性较大，建议选择非脂质体的转染试剂，如BIODAI的RFect系列纳米材料转染试剂。
二、转染后出现细胞死亡是什么原因？如何优化转染条件？
转染后细胞死亡，原因也是多样的，如脂质体毒性，转染浓度过高，转染前的细胞状态不佳等都可能导致转染后细胞死亡的情况发生，这种情况下就需要适当优化转染条件；在优化转染条件时需要考虑以下因素：转染试剂和细胞特有的自身条件。
例如：siRNA与转染试剂的比例、转染时间、细胞传代数和细胞密度等。
一般说，转染试剂毒性小，转染时所需的细胞密度就小，如RFect系列siRNA转染试剂一般要求30-50%细胞密度，而lipo2000转染时所需的细胞密度一般在70%左右。
如果经优化后细胞死亡仍很多，应及时考虑更换转染试剂。
三、如何优化siRNA与转染试剂的比例？
SiRNA的量与转染试剂的比例需要进行优化，一般选择24孔板进行优化，比较节省各
种试剂。
可以在10-100nM之间设定几个siRNA的浓度水平，如30nM，50nM，80nM，100nM。
转染试剂根据说明书推荐的剂量上下浮动各3个浓度。
之后siRNA的量与转染试剂的量进行
两两组合，从中选择转染效率最高的组合用于接下来的实验。
如果通过荧光显微镜观察荧光
判断转染效率的话，siRNA的最低终浓度不要低于10nM，一般推荐的siRNA终浓度多在
50-100nM。
这里需要说明的是，以荧光信号的强弱判断siRNA转染效果并不准确，最好采
用荧光定量PCR来判断转染效果。
因为siRNA转染成功最客观的标志就是基因表达量的减
少，另外，细胞本身会吸附荧光染料，会出现非特异性吸附。
四、关于用于稀释siRNA与转染试剂的无血清培养基
这里是推荐thermo公司的opti-MEM培养基的。
能够提高细胞的转染效率的，尤其是在进行脂质体转染的时候是会很大程度上较少细胞毒性作用。
五、siRNA转染基因敲除效率的测定方法以及注意事项
1.PCR检测mRNA水平的沉默效果，一般推荐在48h到72h检测，48h比较理想，需要具体的摸索时间。
PCR检测沉默效果时，在设计引物的时候最好是将引物设计在沉默位点的两侧，而不是在同侧。
这个是由于RNAi引起的沉默是先进行mRNA的切割之后造成mRNA 的降解。
另外，即使设计在两侧，也不要离沉默位点太远的地方，不然可能会造成对沉默效果的低估。
2.WB检测蛋白蛋白水平的检测，一般在转染后48h到92h间提蛋白检测蛋白水平的沉默效果，检测时间跟你的蛋白的半衰期有关系，具体的时间需要设计时间梯度，一般理想的是在72h最明显。