WB实验步骤
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting（简称WB）是一种常用的蛋白质检测技术，通过将蛋白质分离、转移和检测，可以用来确定特定蛋白质的存在和表达水平。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者了解该技术的操作流程。
1. 细胞培养和蛋白提取。
首先，需要培养细胞并收集细胞样本。
将细胞样本离心，去除培养基，然后用PBS洗涤细胞。
接下来，加入细胞裂解液并振荡离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
2. 蛋白质浓度测定。
使用BCA或Bradford方法测定蛋白提取物的浓度，以确保后续实验中使用的蛋白质量一致。
3. SDS-PAGE凝胶电泳。
将蛋白提取物加入蛋白负载缓冲液，然后加入SDS-PAGE凝胶槽中。
进行电泳分离蛋白质，根据蛋白质大小和电荷不同，蛋白质会在凝胶中形成不同的条带。
4. 蛋白质转印。
将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到膜上，通常使用半湿式或全湿式转印。
将蛋白质从凝胶转移到膜上，使得蛋白质可以与抗体结合。
5. 阻塞。
将膜放入含有蛋白质的溶液中，如5%脱脂奶粉或蛋白质阻塞缓冲液中，阻塞非特异性结合位点。
6. 一抗孵育。
加入第一抗体，孵育过夜。
第一抗体与目标蛋白结合，形成抗原-抗体复合物。
7. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的抗体。
8. 二抗孵育。
加入HRP标记的二抗，孵育1小时。
二抗与第一抗体结合，形成复合物。
9. 洗涤。
用TBST或PBS洗膜，去除未结合的二抗。
10. 显色。
加入ECL显色液，使得膜上的蛋白质产生发光反应。
将膜放入暗室中，用X光片曝光，然后用显影液显影。
11. 图像获取和分析。
将X光片放入X光片扫描仪中，获取蛋白质条带的图像。
使用图像分析软件，如ImageJ，分析蛋白质的相对表达水平。
以上就是WB实验的详细步骤，每一步都至关重要，需要严格按照操作规程进行。
希望本文能够帮助读者更好地理解WB实验的操作流程，并在实验中取得准确、可靠的结果。
WB实验步骤
Western Blotting操作步骤一、蛋白样品制备（1）细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，PBS洗涤一次，用细胞刮刀或胰酶消化细胞后转移至1.5ml EP管中（悬浮细胞直接转移至EP管），1000r离心5min收集细胞，PBS洗涤两次。
2、加入200ul（25cm2培养瓶）含蛋白酶抑制剂的细胞蛋白裂解液（M-PER），置于冰上间歇反复吹打30min，必要时可以超声破碎。
（整个操作尽量在冰上进行，保持低温。
）3、4℃下12000rpm离心15min。
（提前开离心机预冷）4、收集离心后的上清，分装于-80℃保存。
（2）组织总蛋白的提取：1、称取适量组织块置于1～2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
2、200ul含蛋白酶抑制剂的组织蛋白裂解液（T-PER），冰上间歇匀浆30min，使组织尽量碾碎至无明显组织碎块。
3、将混合液移至1.5ml离心管中，4℃下12000rpm离心15min，取上清分装，-80℃保存。
二、蛋白含量的测定1、取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（20mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液，-200C可长期保存。
2、取25mg/ml蛋白标准，用0.9%NaCl或PBS稀释至终浓度0.5mg/ml，-200C可长期保存。
3、按50:1的比例混匀BCA试剂A和B制成BCA工作液，工作液24h内稳定。
4、将标准品按0、1、2、4、8、12、16、20ul加到96孔板中，加标准品稀释液补至20ul。
5、加适当体积待测样品到96孔板中，加标准品稀释液至20ul。
6、各孔加入200ul BCA工作液，370C孵育20—30min或室温放置2h。
7、酶标仪测定A562（540-595nm也可行），根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
三、SDS－PAGE电泳（1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁剂或肥皂用试管刷轻轻擦洗（注意切勿让试管刷的金属把手刮花玻璃板，尽量不要使用洗衣粉，因其含固体颗粒容易损伤玻璃板）。
wb实验原理及步骤
wb实验原理及步骤
WB实验是WesternBlot实验的缩写，是一种常用的蛋白质检测方法。
该实验可以通过检测目标蛋白在蛋白样本中的存在和数量来确定其表达水平。
以下是WB实验的原理及步骤：
一、实验原理
WB实验基于蛋白质的电泳分离和免疫学检测。
首先将蛋白质样本通过SDS-PAGE电泳分离，然后将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
接着使用一种特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过酶标记的二抗和显色底物来检测目标蛋白。
二、实验步骤
1. 样品制备：将待检测的蛋白样本加入SDS-PAGE凝胶中进行电泳分离。
2. 转移：将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
3. 阻断：将聚丙烯酰胺凝胶膜与含有蛋白质的阻断液进行接触，以防止非特异性结合。
4. 抗体反应：将目标蛋白结合的特异性抗体添加到聚丙烯酰胺凝胶膜中，并在室温下或4℃下进行孵育。
5. 二级抗体反应：添加酶标记的二级抗体，与特异性抗体结合。
6. 显色检测：加入显色底物，通过显色反应确定目标蛋白在样品中的存在和数量。
以上是WB实验的原理及步骤，该实验在生物医学研究中广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有力的支持。
wb实验步骤
一、培养的贴壁动物细胞的蛋白质抽提步骤1、从贴壁细胞培养瓶中小心倾去培养液。
2、预冷的PBS清洗贴壁的细胞2次，小心倾去PBS。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。
4、细胞瓶中加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂），轻轻摇动5分钟。
5、用一预冷的橡胶和塑料细胞刮将培养瓶壁上贴壁细胞刮下来，转移细胞悬浮液到离心管中，冰浴下摇动15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
二、培养的悬浮动物细胞的蛋白质抽提步骤1、2500xg离心10分钟沉淀悬浮的细胞，弃去上清液2、预冷的PBS悬浮沉淀细胞，2500xg离心10分钟沉淀细胞，去上清。
3、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5 μl磷酸酶混合液）。
4、加入含抑制剂的预冷蛋白质抽提试剂（107个细胞中加入1ml抽提试剂；5×106个细胞中加入0.5ml抽提试剂）5、轻轻摇动混和15分钟进行裂解。
6、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
弃去沉淀，上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
三、哺乳动物组织的蛋白质抽提步骤1、组织称重，切小块放入管中。
2、配置含抑制剂的蛋白质抽提试剂（1ml抽提试剂中加入5 μl蛋白酶抑制剂混合液，5 μl PMSF和5ul磷酸酶混合液）。
3、加入预冷的含抑制剂的蛋白质抽提试剂（250mg组织中加入1ml抽提试剂）。
4、用匀浆器每次30秒低速匀浆，每次匀浆间隔冰浴1分钟，至组织完全裂解。
5、裂解液于预冷的离心机中14，000xg离心15分钟。
上清液立刻转移入新的离心管中保存待用。
WB实验步骤
WB实验步骤WB实验是一种分离和检测蛋白质的常用实验技术。
以下是WB实验的详细步骤，共分为六个主要步骤。
步骤一：蛋白质提取1.1收集实验所需样本，例如细胞或组织。
如果是细胞样本，可以通过细胞培养离心将细胞沉淀下来。
如果是组织样本，可以通过切割及别的方法收集组织样本。
1.2加入合适的蛋白质提取缓冲液，如RIPA缓冲液，同时加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂，以保护蛋白质的完整性。
1.3震荡或旋转混合样本，使细胞或组织彻底裂解。
1.4将样本在低温下离心，以去除细胞残渣和细胞核等。
1.5收集上清液，其中含有溶解的蛋白质。
步骤二：蛋白质浓度测定2.1 使用BCA蛋白质定量试剂盒或Bradford蛋白质定量试剂盒等试剂，根据试剂盒说明书，测定蛋白质的浓度。
2.2根据蛋白质的浓度调整提取的蛋白质样本的浓度，以保证后续实验的准确性。
步骤三：SDS-电泳3.1准备一定比例的分离凝胶和浓缩凝胶。
通常使用8%-12%的聚丙烯酰胺凝胶。
3.2预运行凝胶，将上清液和蛋白质样本与蛋白负载缓冲液混合，使其达到相同的体积分数，并加入还原剂和SDS。
3.3将混合样品加载到凝胶孔中，根据需要分别加载蛋白质标准，以便确定蛋白质样品的分子量。
3.4设置合适的电泳电压，使蛋白质在凝胶中进行电泳，直至蛋白质通过凝胶前进行分离。
3.5 可以通过染料（如Coomassie blue G-250染色）或银染等方法，可视化分离的蛋白质带。
步骤四：蛋白质转移4.1准备一块聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维膜（NC）作为蛋白质的转移载体，并根据凝胶大小和所需的转移时间切割。
4.2将预运行的蛋白质凝胶和转移载体置于转移装置中，确保凝胶和载体之间没有气泡。
4.3加入冷却的转移缓冲液，确保完全润湿载体，并移除空气泡。
4.4设置合适的转移电流和时间，以将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
4.5转移结束后，将膜从转移装置中取出，并立即进行后续处理。
步骤五：免疫检测5.1将膜与阻塞缓冲液溶液处理，以防止非特异性结合。
WB实验步骤详细情况总结
WB实验步骤详细情况总结蛋⽩提取（所有操作在冰上进⾏）1.裂解1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前⼀天4℃解冻）取2ml裂解液，加20µl PMSF混匀2)称取30mg组织，切碎放⼊标记好的AP管中，加⼊600µl上述1中液体（加⼊液体与组织⽐例为20：1），冰上静置10min2.匀浆先⽤超纯⽔润洗⼀下匀浆机的钢头，（同时进⾏⼏组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在⽣化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min3.离⼼（在基础4楼416室）1)⾃带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离⼼管（①，②两个标记，③加少量超纯⽔，③号是为了离⼼平衡，对称放置）2)将离⼼机预冷⾄4℃为⽌，以1200×10r/min离⼼15min3)⽤移液枪将上层清液取出放⼊①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）将样品转移⾄2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100℃变性10min仪器屏幕：5.保存变性结束后，打开AP管盖放⼀下⽓，然后4℃保存，点样是取出即可⽤WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风⼲，将玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶1)准备：1ml枪（蓝⾊枪头），200µl枪（黄⾊枪头）10µl（⽩⾊枪头）2)10%分离胶的配置：（⽤50ml烧杯。
1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上⾓缓慢匀速加⼊分离胶（⽤1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防⽌⽓泡）保持液⾯平稳上升⾄上⽅绿⾊线为⽌4.⽔封⽴即⽤1ml超纯⽔进⾏⽔封（利⽤重⼒把胶压平），如有⽓泡则⽤针头吸出防⽌影响电泳效果，等待20-30min5.浓缩胶的配制（5%）6. 电泳（电泳液最多使⽤两次）1)安装电泳装置低板对内，上⽅夹住，往两板中加⼊电泳液⾄⿊线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳⼦（注意两⼿平衡拔出防⽌拔歪）2) 点样（不易时间过长，防⽌样品条带扩散）3)连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：⿊对⿊，红对红电永池的两个电极插⼊电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压⾄70mV ，跑约20min 。
WB实验步骤
WB 实验步骤1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。
配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同911. 按1:1的比例配置发光试剂，并发光注意电泳时电压可适当更改，根据个人时间安排及经验我们有2种膜，PVDF和NC膜，大家可根据需要选用，另外膜的孔径也有差异，0.22um的适合检测分子量较小的蛋白，0.45um的适合检测分子量较大的蛋白抗体分为兔抗，羊抗，鼠抗等，大家看清楚，抗体通常用5%的牛奶配制转膜时盒子里面要有冰袋，外面要有冰，尽量保持低温，提高转膜效率发光液最好现配现用曝光时不要过曝或者用过曝的图片，可能会掩盖差异。
WB实验基本步骤
WB实验基本步骤WB实验是一种用于检测和分离目标蛋白质的常用技术，它结合了SDS-和免疫学技术。
以下是WB实验的基本步骤：1.样品制备：首先，需要从细胞，组织或培养物中提取目标蛋白质。
提取方法根据样品的性质而异，可以利用细胞裂解和离心来获取细胞和组织提取物，或者将培养物离心并用PBS洗涤来获取培养物提取物。
提取的样品通常需要加入蛋白酶抑制剂和磷酸盐缓冲液以保持目标蛋白质的完整性。
2. 蛋白质浓度测定：使用BCA、 Lowry或Bradford等标准浓度测定方法，测量目标蛋白质在样品中的浓度。
这是为了确保在加载样品到SDS-胶上时，每个样品都包含相等的蛋白质量。
3. SDS-电泳：将样品加入含有SDS和还原剂的Laemmli试剂，然后通过堆积凝胶（通常是12%）和分离凝胶（通常是4-20%梯度凝胶）分离蛋白质。
SDS在SDS-中提供负电荷，使蛋白质带有均等的负电荷，并且还原剂将蛋白质中的二硫键还原为单硫键，使其线性化。
加载的样品和分子量标尺（如预制的蛋白质标尺）通过电流进行电泳，直到达到所需的分离程度。
4.蛋白转移：将胶上的蛋白质转移到聚丙烯酰胺(PVDF)或硝酸纤维素（NC）膜或其他适用于蛋白质转移的膜上。
通常使用半湿式转移方法，其中将凝胶的胶异型架和转移膜浸泡在转移缓冲液中，并将电流应用于构成电泳腔的两侧。
电流通过凝胶和蛋白质，使蛋白质转移到膜上。
5. 蛋白质定位：使用染色方法（如Ponceau S染色或Coomassie蓝染色）将膜上的蛋白质定位。
这个步骤是为了检查蛋白转移的效果以及加载的标尺和样品之间的分离效果。
染色后，可以测量标尺和目标蛋白质的迁移距离，以及标尺和样品之间的大小分离。
6.阻塞膜：将转移膜浸泡在阻塞缓冲液中，通常是在蛋白质标识位点不与抗体结合的蛋白质（如牛血清白蛋白（BSA）或脱脂奶粉）中。
阻塞的目的是防止未结合的抗体与非特异性蛋白质位点结合。
7.一抗孵育：将目标蛋白质的特异性抗体孵育于阻塞转移膜的缓冲液中。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验（Western Blotting）是一种用于检测和鉴定蛋白质的实验技术。
在WB实验中，通常将目标蛋白质从混合蛋白样本中分离出来，然后通过电泳将其分离在聚丙烯酰胺凝胶上，并利用蛋白质转印技术将蛋白质迁移到膜上。
最后，使用特异性抗体进行免疫染色来检测目标蛋白质。
下面是WB实验的详细步骤：1.提取蛋白质：首先，从细胞、组织样本中提取蛋白质。
这个步骤可以使用不同的方法，例如细胞裂解、组织切碎和离心等。
提取的蛋白质可以用于整个WB实验的下一步。
2.蛋白质电泳分离：将提取的蛋白质样本与样品缓冲液混合，然后加载到聚丙烯酰胺凝胶上。
通常使用的凝胶是SDS-（聚丙烯酰胺凝胶电泳），该凝胶根据蛋白质的分子量将其分离开来。
样品加载完毕后，通电进行电泳分离。
较小的蛋白质会迁移到凝胶的上部，较大的蛋白质会停留在凝胶的下部。
3.转印：将电泳分离后的蛋白质转移到膜上。
通常使用的膜是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
在转印之前，通常将凝胶浸泡在转移缓冲液中以增强转印效果。
然后，将凝胶与膜、滤纸层堆叠在一起，将其放置在转印装置中，施加电流进行蛋白质转印。
4.阻断：将转印完成的膜孔洞中的非特异性结合位点进行阻断。
阻断是为了防止以后的抗原-抗体反应受到非特异性结合的干扰。
最常用的阻断剂是1%-5%的非脂牛奶粉或5%-10%的牛血清蛋白。
5.抗体孵育：使用特异性的抗体来检测目标蛋白质。
首先将抗体稀释在主抗体稀释液中，然后将其加到阻断后的膜上进行孵育。
通常在4℃下过夜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
选择合适的抗体对于获得准确的结果非常重要。
6.辅助抗体孵育：将特异性抗体之外的次级抗体添加到膜上，用于识别已结合的主抗体。
这些次级抗体通常与酶（如辣根过氧化物酶）或荧光染料标记进行共轭，以便于标记的抗体的检测。
次级抗体与主抗体结合形成复合物。
7.检测：使用特定的检测方法来显示已结合的抗体。
这些方法可以使用酶标法（如辣根过氧化物酶反应和色素显色）或荧光技术（如荧光染料）。
wb的简化步骤
wb的简化步骤
WB即Western blot，是一种综合性的免疫学检测技术。
其简化步骤如下：
1. 提取膜蛋白或者总蛋白（主要使用RIPA蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，低温操作）。
2. 制胶（玻璃要洗干净，缓慢铺胶）。
3. 跑电泳（电泳液可以使用干粉直接加双蒸水的，也可以使用SDS、甘氨酸和Tris配制。
上层胶80V+30min，下层胶120V+90min）。
4. 转膜（转膜使用的纤维膜价格较贵，一般分为0.22um、0.47um两种。
小分子蛋白要求孔径小一些，一般300mA+70min，但若发现蛋白在胶上有残留，可适当延长时间）。
5. 封闭（2h BSA或者5%脱脂奶粉，用PBST或TBST配制）。
6. 孵育抗体（4°C过夜，一抗二抗，二抗2h）。
7. 显影（使用ECL）。
WB操作复杂，实验过程中需要严格按照操作步骤进行，同时注意细节和条件的优化，以确保实验结果的准确性。
如果有需要更详细的步骤，可以查询相关的实验手册或者咨询相关的实验技术人员。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解WB实验是一种常用的生化实验方法，用于检测和分析蛋白质的表达水平和相互作用。
下面将详细介绍WB实验的步骤。
1.细胞裂解首先，将感兴趣的细胞收集并放入细胞裂解缓冲液中，通过机械剪切或超声波处理使细胞完全破裂，并释放细胞内的蛋白质。
常用的细胞裂解缓冲液包括RIPA缓冲液或NP-40缓冲液。
2.蛋白质提取将裂解后的细胞溶液离心，将上清液转移到新的离心管中。
通过离心去除细胞碎片等固体物质。
上清液中含有溶解的蛋白质，可以用于后续的分析。
3.电泳分离制备SDS-凝胶，将蛋白质样品加入凝胶孔中。
电泳分离过程中，蛋白质会按照其分子量大小在凝胶中移动。
较小的蛋白质移动较快，较大的蛋白质移动较慢。
4.转膜将分离后的蛋白质从凝胶上转移到聚合物膜上，一般使用半湿式或干转膜法。
湿式转膜使用蛋白质转移缓冲液进行转膜，在电场作用下将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
干转膜则是将分离后的凝胶与膜一同放在压力箱中，在应用压力的同时进行转膜。
5.封闭在转膜后的聚合物膜上加入封闭缓冲液，使膜表面被封闭，防止非特异性结合。
6.第一次抗体孵育将感兴趣的蛋白质的抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中孵育。
第一次抗体与目标蛋白质特异性结合。
7.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的一次抗体。
8.第二次抗体孵育将与目标蛋白质结合的一次抗体加入孵育缓冲液中，并将聚合物膜放入缓冲液中进行孵育。
第二次抗体能够识别一次抗体，并与之特异性结合。
9.洗脱孵育后，使用洗涤缓冲液洗去未结合的第二次抗体。
10.显色将显色试剂加入滤膜中，使蛋白质与试剂反应发生染色反应。
常用的显色试剂有染色剂DAB（二氨基联苯酚）或ECL（增强型化学发光）试剂。
11.影像获取使用实验室常用的成像设备，如X光片胶片、化学发光成像设备或荧光成像设备，将染色后的滤膜拍摄下来或记录下来。
可以通过影像获取软件进行蛋白质带的密度分析。
12.数据分析使用数据分析软件，对得到的数据进行定量分析和比较。
WB实验技术步骤
WB实验技术步骤⼀、提取总蛋⽩1.将⽫中上清吸光后，⽤外⽤PBS将⽫洗3遍，最后⼀遍将⽫内液体吸光（否则会降低蛋⽩浓度）。
配制裂解液:1ml RIPA裂解液（4度冰箱棕瓶）(0.5M Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1% N P40, 0.5% 去氧胆酸钠, 0.1%SDS)加⼊5µl PMSF（苯甲基磺酰氟, -20度冰柜内矩形盒⼩管内）(蛋⽩酶抑制剂，防蛋⽩降解).根据⽫中细胞团块⼤⼩加⼊100-300µl裂解液, 4℃摇床30min2.⽫中液体吸⾄1.5mlEP管，离⼼机预冷后， 4℃，12000×g（RCF），离⼼15min后取上清(装于500µlEP管)（可分装后-20℃保存）。
⼆、BCA蛋⽩浓度测定1.按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA⼯作液，充分混匀；2.完全溶解蛋⽩标准品（存于-20℃冰箱第⼀抽屉），取10微升稀释⾄100微升，使终浓度为0.5mg/ml；3.将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升加到96孔板的标准品孔中，⽤专⽤⽣理盐⽔补⾜到20微升;4.加1µL样品到96孔板的样品空中，加⽣理盐⽔19微升;5.各孔加⼊200微升BCA⼯作液，37℃孵箱放置30分钟;6. 570nm波长测定蛋⽩。
根据标准曲线计算出蛋⽩浓度EXCEL详细过程：标曲：上⼀⾏吸光度，下⼀⾏浓度（0，0.5，1，2，4，6，8，10），以此作标曲，标曲相关系数须达两个9，以这次的样品为例，算得两样品浓度分别为4.09和5.26 因为须上样100µg，所以算得须上样的蛋⽩体积=100/4.09=24.5µL所以上样须补⽔30-24.5=5.5µL及βme：SDS（2：3）为10µL现此样品蛋⽩体积⾜够煮10份，即按照245µL蛋⽩样品+55µL⽔+100µLβme：SDS（2：3）来配注意：SDS很粘，须涡旋再低速离⼼，使⽤枪时须慢吸三、煮蛋⽩：加样配制: 总体积:40µL（含蛋⽩液与dH2O混合物30µL+β-meSDS10µL）1.β-巯基⼄醇（β-me）：6×SDS（2：3）样品缓冲液10µL2.蛋⽩取量取⼀组蛋⽩中,样品蛋⽩加的体积=蛋⽩浓度最低的浓度*30µL/每个样品浓度3.剩余的体积即30µL-样品蛋⽩加的体积，即为各管需补加⽔的体积4.多加⼀点防煮时蒸发部分混和后file22-start100℃煮沸5 min。
wb实验流程及注意事项
wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。
2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。
3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。
4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。
5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。
6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。
9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。
10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。
经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。
11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。
注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。
2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。
3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。
4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。
5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。
WB实验步骤
1.蛋白提取1.细胞转移至生化室，PBS洗两遍，倒去PBS；2.离心机4℃预冷3.配置裂解液SDS+PMSF(100：1)，大瓶：80uL，中瓶：60uL，小瓶：40uL；4.Z字形滴加裂解液，4℃存放20min5.刮取裂解细胞，移至EP管中（冰盒上操作）；6.激光打碎细胞；7.4℃，10000转/min离心30min；8.将上清移至另一EP管，记录体积；9.配置BCA液200uL，A液:B液=50:110.取2个比色杯：23uL ddH2O+2uL上清+200uL BCA液；11.比色杯置37℃温箱30min，570nm测OD值；12.剩余上清加5*SDS混匀，上清：SDS=4:1，水开后，开锅煮10min；13.室温冷却，置-20℃冰箱备用OD值=0.0011x+0.3657蛋白浓度=x/1000*12.5 ug/ul上样量=20/蛋白浓度2.SDS-PAGE电泳1)配胶A.物品准备：选择1mm制胶玻璃板、间隔片、梳子等物品，洗净晾干，确保灌胶时不产生气泡（多备一块板），夹板，底部用封口胶封闭；B.制备分离胶：在小瓶内配置适当浓度的分离胶10ml，将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中并为浓缩胶留有足够空间（绿色横隔下缘），加入异丙醇隔离空气，静置40min聚合；C.制备浓缩胶：分离胶聚合后倾倒出上层异丙醇，滤纸吸干，按需配置5%浓缩胶，最后加TEMED，注入浓缩胶，并插上梳子静置40min，应小心避免气泡；2)样品处理：在收集的蛋白样品中加入适量5*SDS上样缓冲液，沸水加热3-5分钟，以充分变性蛋白；3)上样：将100ml 5*电泳缓冲液自来水稀释成500ml，加至电泳槽，浸过玻璃板，吹散上层泡沫，用微量加样器吸取样品，缓慢加入样品（上样量一般不超过20uL），样品两侧加入3.5uL Marker（不要吸进气泡）4)电泳：插入电击，注意正负极（红对红，黑对黑），打开电泳仪开关，设置参数，S1：70V，0.04A，30min；S2：110V，0.02A，1h；电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止电泳。
WB实验步骤
【WB实验步骤】1.配胶:(1) 根据所需检测蛋白分子量的大小, 配制合适浓度的凝胶。
P53=53KD (1:1000), P21=21KD, Bcl2=28KD, Caspase3=17KD (1:1000)，GAPDH=36kDa (1:5000), β-actin=43kDa50KD以下的分子量选用12%的分离胶(15ml)分离胶加至薄玻板下方约1cm, 分离胶的上方轻轻地来回均匀加蒸馏水，有助于将分离胶压平，1小时后将蒸馏水倒去，用滤纸吸干，准备加浓缩胶(积成胶)。
聚丙烯酰胺浓缩胶(6ml):(2)(3)等待胶凝固的过程中煮蛋白：在提取的蛋白质样品中加入5×SDS上样缓冲液（5×SDS上样缓冲液:蛋白上清液=1:4），100℃煮6min，瞬离，冰上静置备用，保存于-20℃。
2.电泳：向泳道中加入上述已加热变性的蛋白样品50μg, 同时在合适的泳道加入蛋白Marker。
80V稳压运行40min后,再用120V 稳压电泳至蛋白Loading Buffer移动到凝胶下缘(约55min)。
要用大电泳仪，可以从80V浓缩胶自动转到120V跑分离胶。
放板子的时候，高的厚玻璃板要放在外面一侧。
3.转膜：将转膜缓冲液置于-20°C冰箱预冷1小时，PVDF膜放入甲醇中浸泡30s后去离子水洗涤干净，转入转膜缓冲液中平衡5min。
从黑面开始按照海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、海绵按正确顺序装入转膜夹后，将整个转膜系统置于冰上，100V稳压转膜1.5h (注意电流不要超过300mA，以免发热过度)。
4.封闭：转膜结束后，取出PVDF膜。
正面朝上，将其放入PBST配制的5%的脱脂牛奶中，置于摇床上封闭1h。
封闭之前，可根据分子量大小将膜切开：在实验台上铺一层保鲜膜，包住PVDF 膜，用尺对齐，然后将PVDF膜切开。
5.一抗孵育：按照抗体说明书，用5%的PBST配制的脱脂牛奶稀释抗体至所需浓度。
WB试验步骤详细情况总结
蛋白提取（所有操作在冰上进行）1.裂解1）配裂解液：PMSF=100 : 1，（裂解液和PMSF在-20 C保存，提前一天4C解冻）取2ml裂解液，加20 M PMSF混匀2）称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600讪上述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10mi n2.匀浆先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s,两次（间隔5s），冰上静置30min3.离心（在基础4楼416室）1）自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个 1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）2）将离心机预冷至4 C为止，以1200X10r/min离心15min3）用移液枪将上层清液取出放入①②号管中4.变性（上样缓冲液：样品=4: 1）将样品转移至2~3个0.5mlAP管中加上样缓冲液，100 C变性10mi n仪器屏幕：温度「C）时间（时：分钟）5.保存变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4C保存，点样是取出即可用WB实验步骤1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
2.配制分离胶1）准备：1ml枪（蓝色枪头），200讪枪（黄色枪头）10讪（白色枪头）2）10%分离胶的配置：（用 50ml烧杯。
1.0mm板配1.5块胶，1.5mm板配2块板）3.灌胶沿玻璃板右上角缓慢匀速加入分离胶（用1ml移液枪，不要将移液管内液体完全打出防止气泡）保持液面平稳上升至上方绿色线为止4.水封立即用1ml超纯水进行水封（利用重力把胶压平），如有气泡则用针头吸出防止影响电泳效果，等待20-30mi n5.浓缩胶的配制（5% ）6.电泳（电泳液最多使用两次）1）安装电泳装置低板对内，上方夹住，往两板中加入电泳液至黑线并观察是否漏液，缓慢拔掉梳子（注意两手平衡拔岀防止拔歪）2）点样（不易时间过长，防止样品条带扩散）组数少时尽量靠中间点样，边缘易跑歪3）连接电泳仪电泳池与电泳盖连接：黑对黑，红对红电永池的两个电极插入电极盖孔内，打开开关恒压电泳先调电压至70mV，跑约20min。
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蛋白电泳（制胶、SDS -PAGE 电泳）
实验材料：
SDS-PAGE 凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker 、SDS-PAGE Loading Buffer （还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材：
蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml 离心管、5ml 移液器、微量移液器、1.5ml 离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液：
● 配制10%APS 溶液：-20度保存
0.5g APS + 5ml 蒸馏水、2.5g APS + 25ml 蒸馏水
● 配制200 ml 电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS （ph8.3,10×）
20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ● 配制1 ml loading buffer ：
200 ul 5×loading buffer +800 ul 蒸馏水 实验步骤： 一．制胶：
1. 参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。
2. 根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。
3. 配制
10%分离胶：
将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。
加入10%APS 和TEMED ，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。
静置40分钟至
1小时。
5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。
6.配制5%浓缩胶：
7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。
注意：灌胶速度要快，防止凝胶。
8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。
静置20分钟，等待浓缩胶聚合。
9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。
赶走气泡。
二．SDS-PAGE电泳:
1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。
2. 制备样品：
1）蛋白样品：
根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。
蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。
制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
4. 电泳：浓缩胶80V，约20分钟，分离胶100V，约1小时。
一、考马斯亮蓝染色
注：将提取的植物蛋白进行电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色。
全细胞裂解液电泳后，进行western blot检测。
1. 将电泳后的PAGE 胶取出放入容器中，加入适量蒸馏水（以充分覆盖PAGE 胶为
宜），加热至沸腾后5分钟，弃去蒸馏水；
2. 加入适量考马斯亮蓝染色液（液面覆盖凝胶即可）加热至沸腾后5分钟，弃染色液；
3. 加入适量蒸馏水，加热至沸腾后5分钟，弃蒸馏水，重复此步骤至背景清晰。
4. 观察拍照。
Western Blot
溶液配制：
●配制500 ml 1×TBST溶液：
50 ml TBST（ph8.3,10×）+ 450 ml 蒸馏水
●配制100 ml 5%牛奶封闭液：4度保存
5克脱脂奶粉+ 100 ml 1×TBST
●配制100 ml转膜缓冲液（甲醇）：CW0044 Tris-Glycine（ph8.3,10×）
10 ml Tris-Glycine + 20 ml 甲醇+ 70 ml 蒸馏水（4度保存）
一．转膜及染色
实验材料：NC膜、滤纸、转膜缓冲液、丽春红染色试剂、水平摇床
实验仪器、耗材：转膜仪
实验步骤：
1. 电泳完成后，小心打开玻璃板，去除浓缩胶，将分离胶剥离后，放入转膜缓冲液中平衡。
2. 用剪刀剪相同大小的NC膜及滤纸，放入转膜缓冲液中平衡。
3. 转膜：（半干转）
1）将平衡好的3层滤纸平铺于转膜槽底部。
滴加转膜液润湿。
2）将胶平铺在滤纸上，赶平去气泡。
3）将平衡好的NC膜平铺在胶上，用玻璃棒赶平，确保膜与胶之间没有气泡。
4）再将3层滤纸平铺于膜上，赶平。
5）盖好转膜槽上盖，压紧。
插上电极，50mA/膜，转膜1小时。
转膜：（湿转）
150mA/膜，转膜1.5小时
4. 丽春红染色
1）将转移后的膜完全浸入丽春红染色液中，摇动3-5分钟。
2）蒸馏水漂洗膜2-3次，直至膜上出现清晰条带。
3）再次用蒸馏水漂洗，去除染料。
二．封闭
实验材料：5%脱脂奶封闭液
实验步骤：用封闭液将膜室温封闭1小时
三．抗体检测：检测β-actin，分子量43KDa
实验材料：5%脱脂奶封闭液、抗β-actin鼠单克隆抗体、山羊抗鼠IgG（H+L）HRP、TBST 实验步骤：
1. 在6 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl抗β-actin鼠单克隆抗体（稀释度为1:3000）。
2. 将膜浸入到一抗稀释液中，室温孵育1小时，或者4℃ 孵育过夜。
3. TBST漂洗7次，每次5分钟。
4. 在10 ml 5%的脱脂奶中加入2 μl山羊抗鼠IgG（H+L）HRP（稀释度为1:5000）。
5. 将膜浸入到二抗稀释液中，室温孵育1小时。
6. TBST漂洗7次，每次5分钟。
四．显影
实验材料：DAB显色液
实验步骤：
1. 将试剂A和B以1:19的体积比混匀后即为DAB显色工作液。
2. 将配制好的DAB工作液滴加到印迹膜上，孵育1-5分钟，显色。
3. 将膜放入蒸馏水中，终止反应。