荧光素标记探针的原位杂交示意图
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荧光染色原位杂交 原理及软件参数设置
中国健康促进基金会
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世 纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上 发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技 术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精 细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿 瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
模版 3 A 5
寡核苷酸探针：
+ =
A
3’端接有荧光素（红圈）， 5’端接有淬灭基团（红点）
有特异核酸SNP位点的模板
未杂交时，成自身环状，不 发出荧光。
3
Q
T
G
5 杂交后，探针打开，淬灭基 团原理荧光素，发出荧光
用荧光检测仪和荧光染色原位杂交，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实现SNP分型的原理
仪器原理：
探针和模版结合，发出荧光 通过内置CCD探头，接收荧光信号 通过软件分析处理，给出待检基因位点基因 型
**荧光原位杂交的特点： 1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。 **FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质：（1）间接标记：生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子 （2）直接标记：荧光素
荧光素标记探针的原位杂交示意图
杂交所用的探针大致可以分类三类： 1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探 针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位 结合紧密，杂交信号强，易于检测； 2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体 或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可 由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得； 3）特异性位置探针，开展个体化药学服务，就使用特异 性位置探针，检测特定的SNP位点。
（2）由于A1与A2均可结合模板B，因此，形成的A1B和A2B的杂交荧光信号都足够强。
（3）但，在这种条件下，反应速率常速C1大于C2，形成A1B的速度大于A2B，因此，达 到一定强度的杂交信号的A1B的时间会快于A2B。
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
1、模板与A1完全互补（A1配对碱基 的纯合子），与A2不完全互补。达到 特定信号强度的时间，STA1小于STA2。
即：探针间竞争结合模板时，通过一阶导（斜率）阈值，来判断杂交的阴阳性。
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
C1 A1（探针1）+B （模板） C2 A1B （杂交分子）
A2（探针2）+B （模板）
A2B （杂交分子
（1）当体系中只有二个以上的模板分子B，A1和A2探针各有一条时，模板足够多，不会 发生竞争，A1与A2均可结合B。
荧 光 强 度
1 A1 A2
检测时间
荧 光 强 度
2、模板与A1、A2探针都完全互 补（A1、A2配对碱基的杂合子） 。达到特定信号强度的时间， STA1与STA2很接近。 2 A1 A2
ST A1
ST A2
ST A1 ST A2
荧 光 强 度
检测时间
A2
3
3、模板与A2完全互补（A2配对碱基 的纯合子），与A1不完全互补。达到 特定信号强度的时间，STA1大于STA2
100%
Tm2 Tm1
50% 55℃ 56℃ 57℃ 58℃
解链温度
1：当探针数大于待测基因拷贝数时：
探针间竞争结合模板
A1（探针1）+B （模板） A2（探针2）+B （模板） A1B （杂交分子） A2B （杂交分子
（1）当体系中只有一个模板分子B，A1和A2探针各有一条时。A1与A2竞争结合B。 （2）当体系温度为Tm1时，A1B有50%时间处于解链状态，此时，B与A1分离，B有机会 与A2形成杂交体。但A2B杂交体的形成时间会少很多。 （3）表现在出现杂交荧光信号上，A1B的杂交信号，会比A2B杂交信号，强很多。
A1
ST A2
ST A1
检测时间
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
由于获取信号的时间ST的差值体现了两条探针与模板的相互关系，因此，可 以有以下情况：
Delta ST= STA1-STA2
（1）模板与A1完全互补（A1配对碱基的纯合子），与A2不完全互补时： Delta ST1= -7
（2）模板与A1、A2探针都完全互补（A1、A2配对碱基的杂合子）时： Delta ST2=1 （3）模板与A2完全互补（A2配对碱基的纯合子），与A1不完全互补时： Delta ST3=8
探针与模板的结合，符合一级动力学方程： A1（探针1）+B （模板） A2（探针2）+B （模板） A1B （杂交分子） A2B （杂交分子
A1为与模板完全互补的探针（假定长15mer），其Tm1值较高。 A2为与模板不完全互补的探针，与模板SNP不互补，假定长14mer，其Tm2值较低。
探针与模板 聚合度
1：当探针数大于待测基因拷贝数时：
即： （1）当探针多，模板少时，探针间竞争与模板结合。 （2）完全互补配对的探针结合力强，形成的杂交荧光信号强。 （3）一个碱基不互补配对的探针结合力较弱，形成的杂交信号较弱。
图中，蓝色为强杂交荧光信号，绿色为弱杂交荧光信号 此时，通过（1）设定荧光信号的阈值，或（2）设定信号曲线的斜率阈值 （一阶导），即可将低于阈值的信号，视为本底，判定为杂交阴性。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针 ，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列 ，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的 基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交 相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特 异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传 学领域受到普遍关注。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 1）间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后 用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同 时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光 信号进行放大。 2）直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸 戊糖骨架共价结合。直接标记法在检测时步骤简单， 可以直接检测荧光信号。开展个体化药学服务，即采 用荧光直接标记法。
荧光染色原位杂交 原理及软件参数设置
中国健康促进基金会
荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization FISH）是一门新兴的分子细胞遗传学技术，是20世 纪80年代末期在原有的放射性原位杂交技术的基础上 发展起来的一种非放射性原位杂交技术。目前这项技 术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精 细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿 瘤遗传学和基因组进化研究待许多领域。
模版 3 A 5
寡核苷酸探针：
+ =
A
3’端接有荧光素（红圈）， 5’端接有淬灭基团（红点）
有特异核酸SNP位点的模板
未杂交时，成自身环状，不 发出荧光。
3
Q
T
G
5 杂交后，探针打开，淬灭基 团原理荧光素，发出荧光
用荧光检测仪和荧光染色原位杂交，
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
实现SNP分型的原理
仪器原理：
探针和模版结合，发出荧光 通过内置CCD探头，接收荧光信号 通过软件分析处理，给出待检基因位点基因 型
**荧光原位杂交的特点： 1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。 **FISH有上述优点的原因： 使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统 标记探针的物质：（1）间接标记：生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子 （2）直接标记：荧光素
荧光素标记探针的原位杂交示意图
杂交所用的探针大致可以分类三类： 1）染色体特异重复序列探针，例如α卫星、卫星III类的探 针，其杂交靶位常大于1Mb，不含散在重复序列，与靶位 结合紧密，杂交信号强，易于检测； 2）全染色体或染色体区域特异性探针，其由一条染色体 或染色体上某一区段上极端不同的核苷酸片段所组成，可 由克隆到噬菌体和质粒中的染色体特异大片段获得； 3）特异性位置探针，开展个体化药学服务，就使用特异 性位置探针，检测特定的SNP位点。
（2）由于A1与A2均可结合模板B，因此，形成的A1B和A2B的杂交荧光信号都足够强。
（3）但，在这种条件下，反应速率常速C1大于C2，形成A1B的速度大于A2B，因此，达 到一定强度的杂交信号的A1B的时间会快于A2B。
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
1、模板与A1完全互补（A1配对碱基 的纯合子），与A2不完全互补。达到 特定信号强度的时间，STA1小于STA2。
即：探针间竞争结合模板时，通过一阶导（斜率）阈值，来判断杂交的阴阳性。
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
C1 A1（探针1）+B （模板） C2 A1B （杂交分子）
A2（探针2）+B （模板）
A2B （杂交分子
（1）当体系中只有二个以上的模板分子B，A1和A2探针各有一条时，模板足够多，不会 发生竞争，A1与A2均可结合B。
荧 光 强 度
1 A1 A2
检测时间
荧 光 强 度
2、模板与A1、A2探针都完全互 补（A1、A2配对碱基的杂合子） 。达到特定信号强度的时间， STA1与STA2很接近。 2 A1 A2
ST A1
ST A2
ST A1 ST A2
荧 光 强 度
检测时间
A2
3
3、模板与A2完全互补（A2配对碱基 的纯合子），与A1不完全互补。达到 特定信号强度的时间，STA1大于STA2
100%
Tm2 Tm1
50% 55℃ 56℃ 57℃ 58℃
解链温度
1：当探针数大于待测基因拷贝数时：
探针间竞争结合模板
A1（探针1）+B （模板） A2（探针2）+B （模板） A1B （杂交分子） A2B （杂交分子
（1）当体系中只有一个模板分子B，A1和A2探针各有一条时。A1与A2竞争结合B。 （2）当体系温度为Tm1时，A1B有50%时间处于解链状态，此时，B与A1分离，B有机会 与A2形成杂交体。但A2B杂交体的形成时间会少很多。 （3）表现在出现杂交荧光信号上，A1B的杂交信号，会比A2B杂交信号，强很多。
A1
ST A2
ST A1
检测时间
2：当探针数小于待测基因拷贝数时：
由于获取信号的时间ST的差值体现了两条探针与模板的相互关系，因此，可 以有以下情况：
Delta ST= STA1-STA2
（1）模板与A1完全互补（A1配对碱基的纯合子），与A2不完全互补时： Delta ST1= -7
（2）模板与A1、A2探针都完全互补（A1、A2配对碱基的杂合子）时： Delta ST2=1 （3）模板与A2完全互补（A2配对碱基的纯合子），与A1不完全互补时： Delta ST3=8
探针与模板的结合，符合一级动力学方程： A1（探针1）+B （模板） A2（探针2）+B （模板） A1B （杂交分子） A2B （杂交分子
A1为与模板完全互补的探针（假定长15mer），其Tm1值较高。 A2为与模板不完全互补的探针，与模板SNP不互补，假定长14mer，其Tm2值较低。
探针与模板 聚合度
1：当探针数大于待测基因拷贝数时：
即： （1）当探针多，模板少时，探针间竞争与模板结合。 （2）完全互补配对的探针结合力强，形成的杂交荧光信号强。 （3）一个碱基不互补配对的探针结合力较弱，形成的杂交信号较弱。
图中，蓝色为强杂交荧光信号，绿色为弱杂交荧光信号 此时，通过（1）设定荧光信号的阈值，或（2）设定信号曲线的斜率阈值 （一阶导），即可将低于阈值的信号，视为本底，判定为杂交阴性。
FISH的基本原理是用已知的标记单链核酸为探针 ，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核 酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由 于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列 ，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的 基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交 相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特 异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传 学领域受到普遍关注。
探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。 1）间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后 用藕联有荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同 时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光 信号进行放大。 2）直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸 戊糖骨架共价结合。直接标记法在检测时步骤简单， 可以直接检测荧光信号。开展个体化药学服务，即采 用荧光直接标记法。