微卫星荧光标记基因组扫描

文章编号:1007-7847(2000)S0-0018-06微卫星荧光标记基因组扫描X邓 昊,何云贵,夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,中国湖南长沙 410078)摘 要:微卫星荧光标记基因组扫描为20世纪90年代发展起来的一项分子生物学技术,在基因定位、个体识别等方面有广泛的应用.文中对其原理、策略、分析方法及应用作了论述,并探讨了它的发展前景.关键词:微卫星;荧光标记基因组扫描;基因定位;分析方法中图分类号:Q78 文献标识码:AFluorecence -based Genescan with Microsatellite MarkersDENG Hao,HE Yun -gui XIA Jia -hui(National Laboratory of Medical Genetics,Hunan Medical University ,Changsha 410078,Hunan,China)Abstract:Fluorescence -based genescan with microsatllite markers is a molecular -biology technique which developed in 1990p s.It is used widely in the field such as gene mapping,personal identifica -tion.Here we demonstrate its principle,research stra te gy,analysis methods,applications and discuss the developing prospec t.Key words:microsatellite;fluorescence based genescan;gene mapping;analysis method人类基因组计划已开展了近10年,1999年12月1日美、日等国科学家宣布,人类22号染色体的测序工作业已完成,其余染色体的大规模测序工作在近3年也已将完成.运用大规模测序的大量数据,将cDNA 与致病基因一一对应起来,将疾病定位到染色体某一位置后进行突变检测,不失为基因克隆的一条捷径.微卫星(Microsatellite)DNA 标记是简单重复的DNA 片段,每个重复单位一般1~6个碱基(bp),重复次数10~20次左右,广泛存在于真核生物中[1].由于其种类多,高度多态,基本上呈平均分布并可用PC R 检测,具有共显性遗传特征,因而广泛用于遗传作图.近年来绝大部分基因定位和克隆都运用了微卫星荧光标记的基因组扫描分析技术.1 原理与策略微卫星DNA 在人基因组中平均每30kb 存在1个,人类基因组中以(CA/GT)n 重复序列 第4卷 第2期(专辑)2000年6月 生命科学研究Life Science ResearchVol 14 No 12(Suppl.)Jun 12000 X 收稿日期:2000-06-12基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39525012);国家自然科学基金重大项目(39896200)作者简介:邓昊(1973-),男,湖南长沙人,硕士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;何云贵(1970-),男,湖南湘乡人,博士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;夏家辉(1937-),男,湖南医科大学教授,中国工程院院士,博士生导师.最多,简称(C A)n,重复次数约15~16次[2,3],CA 重复在人类基因组中超过50000个.三核苷酸重复和四核苷酸重复也较常见,但杂合度往往不及二核苷酸重复高.尽管人类基因数目相同,但不同种族,甚至不同个体之间许多位点的微卫星却千差万别,故可应用微卫星标记进行基因分型(genotyping),即用荧光标记PCR 一条引物的5c -端,将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据分离片段大小进行基因型分析.基因型分析后,通过一些计算即能判断某一微卫星等位片段是否与疾病存在连锁(如Lod 值),或存在传递不平衡(TDT).目前许多生物试剂公司都推出了基因组扫描试剂盒,包括推出商业化的微卫星荧光标记)))半自动基因分型引物,如Research Genetics 的Weber human linkage screening set version 6,医学遗传中心的Marshfield screening set 等.Perkin Elmer 公司首先推出ABI Prism T M Linkage Mapping Set Ver -sion 110,包括325个微卫星位点,分子量内标TAMRE 标记,接着又推出包含400个微卫星位点的ABI Prism Linkage Mapping Set Version 2,包含了28个Panel,每个Panel 由10多个位点的引物组成,分子量内标为ROX 标记.最近又推出间隔5c M 的高密度试剂盒.同一Panel 中的同一荧光标记引物扩增片段大小不重叠,相隔15bp 以上,这样多个位点可进行基因分型.这些引物分别由3种不同颜色(6-FAM,HEX,NED,其中FAM 荧光强度为HEX 、NED 的2倍)荧光标记引物5c 端.可将每对引物分别按其最优条件扩增混合上样,也可将多对引物混合,采用Touchdown 反应程序.该程序通过每个循环逐步降低退火温度,以便使每对引物均能在PC R 过程中达到最佳退火温度扩增出产物并使产物具有较高的特异性,同时取法国人CEPH -02作为阳性对照样品.PCR 产物在测序仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,收集软件,Gene Scan 软件和Genotyper 软件收集和分析,如确定等位片段大小,基因分型等.还可以用一系列相关软件如Genobase 和Genopedigree 进行后续工作处理.2 基因组扫描结果分析方法无论是单基因病还是多基因病的定位研究中,都可应用微卫星多态标记.目前分析方法可分为参数分析方法(对数优势记分法Log odds of score method,Lods 法)和非参数分析方法(等位基因法,群体相关性分析),或分为家系连锁分析(Lods 法,等位基因法)和群体相关性分析.1)对数优势记分法:在假定有单个主基因存在的前提下,可运用Lods 法.Lod 值即两位点呈连锁的机率与不呈连锁的机率比的对数值,Lod 值等于3代表连锁的机率是不连锁的机率的1000倍.连锁分析是基于标志位点和疾病位点是否存在共分离,主要是根据生殖细胞减数分裂时染色体发生交换和重组的原理,如果多态标记与待定基因位于不同染色体上或同一染色体的较远位置,则它们向子代传递过程中将出现非连锁,即/连锁平衡0,反之,如果该标记与待定基因位于同一染色体且相距较近,则它们在传递过程中就不会自由分离,而呈现/共分离0(consegre gation),即/连锁不平衡0.两基因连锁程度以它们之间的遗传距离(重组百分率)表示.人类1c M 代表1%重组率,相当于106bp.家系连锁分析方法通过假定遗传模式来决定标记位点是否与疾病位点连锁.目前最常用的是Lods 法,即对数优势计分法,一般认为,Lods>1支持连锁,Lods<-2否定连锁,Lods>3肯定连锁,Lods 介于-2与3之间需增加家系材料.而最近Zhao 等[4]指出,GENESCAN 如果涉及一个少量减数分裂的大量标记,建议用Lods>316.用Monte Cale 假设方法,Monte 实验示Ñ类错误随染色体长度、标记数和标本数变化.在通常50个有信息的减数分裂中,当50个标记均匀分散在一条染色体上19 第2期(专辑) 邓 昊等:微卫星荧光标记基因组扫描20生命科学研究2000年(150c M为一条染色体平均长度),应用Lod值310估计染色体范围I类错误率为0100574,然而,对于更多的样本和更短的染色体,支持连锁的Lod值建议在310~316,这是基于接近I 型错误的基础上的.家系连锁分析优点是对连锁的判断能力强,能确定连锁程度,即遗传距离.缺点是需要完整的系谱材料,分析结果受遗传模型设定的影响,对遗传参数如基因频率,基因传递率,及外显率等的依赖性较强.2)等位基因法:也称受累亲属对(Affected Relative Pairs)连锁分析.它与家系连锁分析不同,是一种非参数遗传统计方法(nonpara metric linkage,NPL).NPL测试只用到了受累的个体,相对的测试力差一些,但不要求特定的遗传模式[5].传统的家系研究的连锁分析方法如Lods 法,需要确定性状或疾病的遗传方式,基因频率以及外显率,以便进行参数统计分析.受累亲属对设计运用非参数模型,它不需要了解疾病的遗传方式,基因频率以及外显率,就能进行关联或连锁分析.假如家庭中有两个以上生物学上有关的亲属,则收集所有受累成员的生物材料和有关信息.造成相同基因非随机同时存在的原因可以是后裔一致性(identical by de-scent,IB D)法或是状态一致性(identical by state,IBS).受累同胞对(affected sib-pair)法是基于如果两个子代或同胞都有同样的疾病,则它们一定遗传了位于疾病基因附近的相同标记等位基因;如果一个多态性位点不与疾病位点连锁,则对子之间分享0,1,2个等位基因的概率分别是0125,015和0125,若存在连锁,则分享0个等位基因的对子数大为减少.此法需要获得配对患者的基因型,所以此法抽样对象为受累同胞对时,致力寻找受累同胞对中出现概率超过1/4的共享遗传标记.有时样本数不够,还可用受累亲属对补充:如祖孙、叔侄等.受累亲属对方法是对传统家系调查所采用的优势对数法有力补充.一般来说,等位基因共占法对系谱材料要求低,只需一代或二代的家系成员,可以在多基因病遗传方式不明确的情况下进行非参数连锁分析,得到错误连锁可能较少.统计学上认为可能有效检测到微效基因的作用,是一种新型特殊类型的关联研究,应用前景广泛.其弱点是对连锁的判断效能弱于家系连锁分析,不能计算重组分数,不能估算遗传距离.3)群体相关性分析:也称连锁不平衡分析,是在一定人群中寻找设置患者组和对照组,研究某一标记在两组中分配的不同,发现连锁不平衡.该法简单可行,不需设定遗传模式,能帮助确定候选基因在遗传病中的可能作用,适合在一些人口流动性小,相对同源的人群(如边远的山村、小岛).上述人群在遗传学上可看成隔离群,遗传背景和环境相同,患者亲源关系远(较家系连锁分析而言),因此,连锁不平衡作用大,定位基因所需遗传标记及研究的患者数较一般的人群相关性分析少.目前有Linkage和LIPED等软件可进行两点和多点连锁分析.计算程序有Linkage[6], ME NDE L,MapMaker.多点连锁分析中,有两种基本的算法[7]:一是Elston-Stewart(ES)算法[8].在一个家系内,计算化的效应随个体数线性增加;二是Lunder-Green(LG)算法[9].在此算法中,效应是随标记的位点数指数化增长的.ES算法通过LFPED程序完成,在Linagke中更完善,而Fastlink则是一个快的Linkage版本.这用于大家系和少数量的环,然而,只能同时分析少量标记(5~6个).一个极有效的程序是VITESSE[10],但只能用于无环家系分析.ME NDEL 程序与LINKAGE/FastLI NK类似,优点在于熟练处理有环家系,在参数选择上有更多选择项目以致ME NDE L比FastLI NK需更多的计算资料.LG算法有GENE HUNTE R,MapMakerCRI-MAP和GE NEH UNTER,能同时分析一条染色体上所有标记,然而家系大小限制在约12个非奠基者.MapMaker是为标记定位设计的,CRI-MAP 类似MapMaker 但被修订允许有限的疾病基因作图.ES 算法对于大家系少遗传位点有效而LG 算法用于大量位点小家系,目前无对大家系和大量位点的程序.遗传方式不明确可用非参数分析,目前有S 1A 1G 1E 软件包的SIBPAL 和ANALYZE.由Haseman -Elston 制作的特殊程序可用同胞对分析,受累同胞对和不平衡分析,并能进行一定量的多个标记分析[11].虽然LINKAGE 和MENDEL 有新的版本可计算两个疾病位点的情况.我们可以分析两种不同遗传模式选Lod 值高的一种,这样能最小增加I 类错误而检测到真正的连锁[12].3 应用1995年Findlay 等[13]设计荧光引物是多样化的6个四核苷酸微卫星,通过釉质基因用来诊断性别.CE TR 区的引物被用来决定囊性纤维变性(C F)状态,通过用DNA 测序仪分析,这种技术可用于产前和移植前诊断.小的或退化性样本的亲子鉴定,污染来源的检测.能估计单个单倍体精子和其他细胞的情况,所以在移植诊断中能检测二倍体和单倍体污染.越来越多的单基因病被定位和克隆,目前已定位1632种疾病,其中克隆954种(至1999年11月28日).虽然一部分通过特殊病例将疾病通过FISH 等方法进行基因定位[14],然而绝大多数基因定位都采用了微卫星荧光标记基因组扫描[15,16].McEvoy 等[17]应用PE373DNA 测序仪检测片段大小230bp~215kb 微卫星等位片段.用非变性聚丙酰胺胶和荧光标记dUTP 的PCR 产物,小片段的标准有+/-014bp 标准差,大片段有+/-37bp 的标准差.在同一胶和不同胶上特别是片段超过2kb,有较大误差,这种片段标准差异由PC R 荧光标记方法,荧光染料类型和掺与比例决定.Idury 等[18]用简单的试验发现208个中有大于80%的标记能进行精确分析,大约20%需要实验条件的特别处理.并讨论了不同标记的特性,包括PCR 产物大小不同和不确定重复长度,从实验水平对大规模基因组扫描可行性进行了摸索.Kay 等[19]报道一种在至少包括一个受累同胞对约481个家系中用两步基因组扫描法扫描骨关节炎易感位点.首先在297个家系中用覆盖23条染色体的跨距约12c M 的277个微卫星,在P <0.05情况下,连锁分析同16个标记有关,进入第二阶段,在其余184个家系对这16个标记进行扫描,结果证实在11q 条染色体上的标记有连锁证据,对这一区的精细扫描发现,在D11S901有最大的两点连锁2140(P =01004).在D11S1338和D11S35之间有最大多点Lod 值3115,对481家系196对受累姊妹对中,在D11S901有一个Lod 值为2154(P =01003)约在此标记近侧有12c M 范围内,而男性受累同胞对与11号染色体有连锁证据,这样将女性骨关节炎易感基因定位在11q.这种两步扫描法,对搜寻大量小家系的易感位点很有帮助.Gschwend 等[20]用纯合子定位法研究23个范科尼贫血(一种有遗传异质性的隐性遗传病)家系,他们检测了引起贫血的一靠近D16S520(16q2413)的位点,虽然约65%的家系与D16S520连锁,但该小组也发现了有强的遗传异质性(P =01013),在D3S3050有最大NPL 值3146.隐性遗传病的基因定位往往需要多个近亲婚配,Peter 等[21]用一个6代阿拉伯以色列多个近亲结婚的家系,将脊椎肋骨成骨不全基因定位在19q13约8.5cM 范围内,他们采用的是纯合子定位法,同时也应用了Pooling 方法.Pooling 方法在基因组扫描中也有应用,这个方法利用似然性原理,即血缘家系中受累个体分享从共同祖先遗传的同一染色体区[22].而Shaw 等[23]将DNA 样本混合,进行引物标记荧光PC R 后电泳,再通过等位片段的峰高确定基因频率.Peter 等[24]则以纯合子定位法对19个芬21 第2期(专辑) 邓 昊等:微卫星荧光标记基因组扫描22生命科学研究2000年兰家系研究,将脑白质病定位在3q27约7c M范围内.Curtis强调,当一个受累后代为纯合子,而父母中一个为杂合子时,TDT(transmission disequilibrium test)得出偏斜结论.Ikeda等[25]在16个家族性(颈动脉)中烟雾阴影病中进行基因组扫描,假定不知道该病遗传模式,发现该病定位在3p2612-p26.高血压、心血管、颅血管和肾疾病影响了1/4的美国人的健康,每年花费300亿美元.虽然在一些稀有高血压中发现遗传突变,包括liddle综合征,大量怀疑的候选基因和潜在的环境因素使大量原发性高血压复杂化.Xu等[26]用367个多态标记对常染色体进行扫描,研究的人群为20万,包括少数高影响的同胞对(207个不一致,258个高一致性,99个低一致性)和所有这些同胞的一个父母.最大Lod值大于210(非修订P<01001),这些区域包括5个标记位点.性别和囊性纤维变性在单细胞水平就可诊断,在单个细胞变异中,污染不能完全排除,特别是单细胞水平,DNA指纹能评价污染风险.单细胞高敏感性和高特异性,可能鉴别出扩增的细胞的来源高度.4展望人类基因组计划测序工作正在进行,同时通过全面的cDNA文库增加基因数量.最近完成的啤酒酵母和线虫测序工程最多的问题是到底有多少测序资料能提供我们有用的信息,通过基因组扫描,对于单基因疾病定位如果家系较大已不成太大问题,用该技术进行多基因疾病定位已成为当前主流.疾病基因定位后,充分利用大规模测序结果进行分析和突变检测,不失为基因克隆的捷径.随着DNA测序仪自动化增高,基因组扫描将有更广泛的应用市场.至少有10个软件包用于动植物,利用标记检测和定位有数量线性关系的位点,其中6个软件是植物遗传学家发明或有他们参与发明的.Map Manger QT是一种通过回交、自交和重组系定位数量线性关系,Map Manger QT是map Manger Classic的升级版,用于定位孟德尔遗传疾病[27].针对复杂遗传模式的更完善和全面的软件包也在不断开发[28],目前对复杂疾病研究的两方面进展,一是候选基因相关性研究,二是单倍型分享或通过IBD作图.自动化程度增高和遗传标记的精确和有效性是高产出的荧光基因分型的保证.国内况少青等[29]也对多重PCR微卫星标记)))半自动基因组扫描进行了摸索,不少公安厅已将该技术应用于法医学个体识别.微卫星荧光标记半自动基因扫描由于其检测位点广,日趋成熟的多重PCR可大量节省费用,将广泛用于基因定位、种源学研究、亲子鉴定、污染控制等.若特异荧光引物与基因扫描技术结合,将在微生物分型[30]、突变检测[31]、定量PCR[32,33]等方面有更大的发展空间.参考文献:[1]TANTZ D.Hyperriability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers[J].NucleicAcids Research,1989,17:6763-6771.[2]ChIEN C,BARTEL PL,STENLAN R,et al.The t wo-hybrid system:A method to identify and clone genes for pro-teins that interact with a protein of i nterest[J].Proc Natl Acad Sci USA,1991,88:9578.[3]MA J,PTASHNE M.A new class of yeast transcriptional activators[J].Cell,1987,51;113-119.[4]ZHAO L,PRENTICE R,SHEN F,et al.On the assessment of statistical significance in desease-gene discovery[J].Am J Hu m Genet,1999,64(6):1739-1753.[5]KRUGLYAK L,DALY M J,REEVE-DALY M P,et al.Parametric nonparametic linkage analysis:a uni fied 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