微卫星荧光标记基因组扫描

文章编号:1007-7847(2000)S0-0018-06

微卫星荧光标记基因组扫描

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邓 昊,何云贵,夏家辉(湖南医科大学医学遗传学国家重点实验室,中国湖南长沙 410078)

摘 要:微卫星荧光标记基因组扫描为20世纪90年代发展起来的一项分子生物学技术,在基

因定位、个体识别等方面有广泛的应用.文中对其原理、策略、分析方法及应用作了论述,并探讨

了它的发展前景.

关键词:微卫星;荧光标记基因组扫描;基因定位;分析方法

中图分类号:Q78 文献标识码:A

Fluorecence -based Genescan with Microsatellite Markers

DENG Hao,HE Yun -gui XIA Jia -hui

(National Laboratory of Medical Genetics,Hunan Medical University ,Changsha 410078,Hunan,China)

Abstract:Fluorescence -based genescan with microsatllite markers is a molecular -biology technique which developed in 1990p s.It is used widely in the field such as gene mapping,personal identifica -tion.Here we demonstrate its principle,research stra te gy,analysis methods,applications and discuss the developing prospec t.

Key words:microsatellite;fluorescence based genescan;gene mapping;analysis method

人类基因组计划已开展了近10年,1999年12月1日美、日等国科学家宣布,人类22号染色体的测序工作业已完成,其余染色体的大规模测序工作在近3年也已将完成.运用大规模测序的大量数据,将cDNA 与致病基因一一对应起来,将疾病定位到染色体某一位置后进行突变检测,不失为基因克隆的一条捷径.微卫星(Microsatellite)DNA 标记是简单重复的DNA 片段,每个重复单位一般1~6个碱基(bp),重复次数10~20次左右,广泛存在于真核生物中[1].由于其种类多,高度多态,基本上呈平均分布并可用PC R 检测,具有共显性遗传特征,因而广泛用于遗传作图.近年来绝大部分基因定位和克隆都运用了微卫星荧光标记的基因组扫描分析技术.

1 原理与策略

微卫星DNA 在人基因组中平均每30kb 存在1个,人类基因组中以(CA/GT)n 重复序列 第4卷 第2期(专辑)2000年6月 生命科学研究Life Science Research

Vol 14 No 12(Suppl.)Jun 12000 X 收稿日期:2000-06-12

基金项目:国家杰出青年基金资助项目(39525012);国家自然科学基金重大项目(39896200)

作者简介:邓昊(1973-),男,湖南长沙人,硕士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;何云贵(1970-),男,湖南湘乡人,博士研究生,从事细胞遗传学和分子遗传学研究;夏家辉(1937-),男,湖南医科大学教授,中国工程院院士,博士生导师.

最多,简称(C A)n,重复次数约15~16次[2,3],CA 重复在人类基因组中超过50000个.三核苷酸重复和四核苷酸重复也较常见,但杂合度往往不及二核苷酸重复高.尽管人类基因数目相同,但不同种族,甚至不同个体之间许多位点的微卫星却千差万别,故可应用微卫星标记进行基因分型(genotyping),即用荧光标记PCR 一条引物的5c -端,将扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳,根据分离片段大小进行基因型分析.基因型分析后,通过一些计算即能判断某一微卫星等位片段是否与疾病存在连锁(如Lod 值),或存在传递不平衡(TDT).目前许多生物试剂公司都推出了基因组扫描试剂盒,包括推出商业化的微卫星荧光标记)))半自动基因分型引物,如Research Genetics 的Weber human linkage screening set version 6,医学遗传中心的Marshfield screening set 等.Perkin Elmer 公司首先推出ABI Prism T M Linkage Mapping Set Ver -sion 110,包括325个微卫星位点,分子量内标TAMRE 标记,接着又推出包含400个微卫星位点的ABI Prism Linkage Mapping Set Version 2,包含了28个Panel,每个Panel 由10多个位点的引物组成,分子量内标为ROX 标记.最近又推出间隔5c M 的高密度试剂盒.同一Panel 中的同一荧光标记引物扩增片段大小不重叠,相隔15bp 以上,这样多个位点可进行基因分型.这些引物分别由3种不同颜色(6-FAM,HEX,NED,其中FAM 荧光强度为HEX 、NED 的2倍)荧光标记引物5c 端.可将每对引物分别按其最优条件扩增混合上样,也可将多对引物混合,采用Touchdown 反应程序.该程序通过每个循环逐步降低退火温度,以便使每对引物均能在PC R 过程中达到最佳退火温度扩增出产物并使产物具有较高的特异性,同时取法国人CEPH -02作为阳性对照样品.PCR 产物在测序仪上进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,收集软件,Gene Scan 软件和Genotyper 软件收集和分析,如确定等位片段大小,基因分型等.还可以用一系列相关软件如Genobase 和Genopedigree 进行后续工作处理.

2 基因组扫描结果分析方法

无论是单基因病还是多基因病的定位研究中,都可应用微卫星多态标记.目前分析方法可分为参数分析方法(对数优势记分法Log odds of score method,Lods 法)和非参数分析方法(等位基因法,群体相关性分析),或分为家系连锁分析(Lods 法,等位基因法)和群体相关性分析.

1)对数优势记分法:在假定有单个主基因存在的前提下,可运用Lods 法.Lod 值即两位点呈连锁的机率与不呈连锁的机率比的对数值,Lod 值等于3代表连锁的机率是不连锁的机率的1000倍.连锁分析是基于标志位点和疾病位点是否存在共分离,主要是根据生殖细胞减数分裂时染色体发生交换和重组的原理,如果多态标记与待定基因位于不同染色体上或同一染色体的较远位置,则它们向子代传递过程中将出现非连锁,即/连锁平衡0,反之,如果该标记与待定基因位于同一染色体且相距较近,则它们在传递过程中就不会自由分离,而呈现/共分离0(consegre gation),即/连锁不平衡0.两基因连锁程度以它们之间的遗传距离(重组百分率)表示.人类1c M 代表1%重组率,相当于106bp.家系连锁分析方法通过假定遗传模式来决定标记位点是否与疾病位点连锁.目前最常用的是Lods 法,即对数优势计分法,一般认为,Lods>1支持连锁,Lods<-2否定连锁,Lods>3肯定连锁,Lods 介于-2与3之间需增加家系材料.而最近Zhao 等[4]指出,GENESCAN 如果涉及一个少量减数分裂的大量标记,建议用Lods>316.用Monte Cale 假设方法,Monte 实验示Ñ类错误随染色体长度、标记数和标本数变化.在通常50个有信息的减数分裂中,当50个标记均匀分散在一条染色体上19 第2期(专辑) 邓 昊等:微卫星荧光标记基因组扫描