实验：组织分离法制备食用菌母种
食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项
食用菌菌种分离的方法和操作步骤以及注意事项食用菌菌种分离的方法和操作步骤菌种分离即是进行食用菌菌丝纯化的过程，它是制种工作的重要环节，通俗地讲就是把食用菌菌丝从自然中单独分离出来进行纯培养，从而获得纯食用菌菌丝的过程。
菌种分离是一项重要而又细致的工作，每个环节都必须严格按照无菌操作规程进行。
食用菌的分离方法很多，常用的有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法三种。
1.组织分离法组织分离法是将食用菌的部分组织移接到斜面培养基上获得纯培养的方法。
其特点：一是属于无性繁殖，能够保持原有菌种的优良特性，是生产中获得纯菌种的常用方法，且简单易行，取材广泛，菌丝萌发快。
二是组织分离操作简便，又不易带入杂菌，容易获得纯菌种。
但对银耳、黑木耳等胶质菌因其子实体种菌丝极少，如用组织分离培养，则往往不易成功。
1.1子实体分离种菇要选择朵大盖厚、柄短、八九分成熟的优良品种。
切去菇体基部，在超净工作台用75%的酒精棉球进行擦拭菌盖与菌柄两次，进行表面消毒。
接种时，只要将种菇撕开，用消毒后的小刀在菌柄与菌盖的交界处切取一小块组织，再用接种针将组织块放入PDA培养基的试管斜面中间。
置于24℃温度下培养3-5天就可以看到组织块上产生白色绒毛状菌丝，转管扩大即得到菌种。
如香菇、平菇等可以使用此方法。
1.2菌核组织分离茯苓、猪苓、雷丸等食用菌的子实体不易采集。
而常见的是它储藏营养的菌核。
用菌核分离，同样可以获得菌种。
方法是将菌核表面洗净，用酒精消毒，切开菌核，取中间组织一小块，约黄豆大小，接种在PDA培养基斜面上，在24℃下培养，产生菌丝后进行分离纯化。
应注意的是，菌核是储藏器官，大部分是多糖类杂质，只有少量的菌丝，因此挑选的组织块要大一些，如果组织块过小，则不易分离出菌种。
1.3菌索分离法菌索分离常用于蜜环菌分离。
方法是选新鲜的活菌索，用75%酒精棉球将菌索表面消毒后，去掉菌鞘，把白色菌髓部分用无菌剪刀切成小段，接入PDA斜面培养基上，在24℃下培养，有白色菌丝长出且无污染，即表明分离成功。
食用菌母种分离
一、实验目标：
1、掌握组织分离法制备母种的方法。 2、掌握组织分离接种技术。 3、会使用超净工作台和培养箱。
二、实验原理：
组织分离法是利用子实体组织来分离获得纯培 养菌丝的方法。
是一种无性繁殖，双亲的染色体没有经过重组， 因此组织分离基本上可保持亲本的生物学特 性。
三、仪器设备与材料
接种孢子
用接种环 蘸孢子液或孢子粉
涂布于平板上
七、菌种质量的鉴定
鉴定 项目
形态特征、生理特性、 栽培性状、经济效益等
一般从菌种的纯度、长势、颜色、菌龄、 、
均匀度和出菇快慢等6个方面进行鉴定。
好母种
退化母种
出菇试验
栽培
出菇快 产量高 品质好 抗逆性强
菌种种类 品种名称 菌种级别 代 时 生产厂家 接种日期
10、贴标签
写明菌种名称，接种日期，姓名，学号，专业， 随后放入培养箱中，置适宜温度下培养，待 组织块长出菌丝无污染即为纯种。
培养3~5天，就可以看到组织上产生白色绒毛状 菌丝，转管扩大即得到菌种。
十、结果
1、记录你制作的母种的生长状态； 2、是否有杂菌污染，如有分析其原因。
械及种菇表面消毒；
（3）0.1%KMnO4：一般用于用具、器皿消毒；
4、菌种培养没备
（1）培养箱 培养少量菌种的恒温电器（20~40℃）
（2）培养室
六、菌种分离的方法
菌种分离：将有价值的子实体的局部组织、孢 子或基内菌丝移接到斜面试管培养基上，获得 纯培养菌丝的操作称为菌种分离。
必 备
1、组织分离：采用食用菌子实体或菌核、菌索 的任何一部分组织培养成纯菌丝体的方法。
无
0.25%新洁尔灭浸2~3min 无菌纱布吸干表面水分
食用菌栽培实验报告
食用菌栽培实验报告一、实验目的1.学习和掌握食用菌的组织分离法制作食用菌母种；2.掌握食用菌培养基的配置原理；3.通过平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法和栽培管理技术。
二、实验原理（一）食用菌母种的制作食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
（二）平菇、秀珍菇、金针菇、鸡腿菇、香菇、榆黄菇的栽培实验1.食用菌的营养物质食用菌在生活时需要多种多样的营养物质，除水和氧气外，还要碳、氮、钾、磷、硫、镁、铁等大量元素和一些微量元素。
各种食用菌对营养物质的要求各不相同，有的要求不严格，有的要求严格。
[1]碳源：能利用自单糖到纤维素等各种复杂的碳水化合物，如：纤维素、葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、半乳糖、糊精、淀粉、半纤维素、木质素、有机酸、某些醇类等。
[2]氮素：是食用菌合成蛋白质和核酸必不可少的主要原料。
主要有蛋白质、氨基酸、尿素、氨、铵盐和硝酸盐等。
蛋白质必须经蛋白酶分解成氨基酸后才能被吸收；其他小分子氮素化合物菌丝体可直接吸收。
[3]碳氮比:一般认为食用菌在营养生长阶段碳氮比（C/N）以20 : 1为好，而在生殖生长阶段碳氮比以30 : 1～40 : 1为好。
[4]无机盐类，如：磷酸二氢钾、硫酸钙、硫酸镁、氯化钠、硫酸锌、氯化锰等。
这些无机盐中的金属元素磷、钾、镁为最重要，适宜浓度是每升培养基加100—500毫克，而铁、钴、锰、锌、钼等微量元素，每升培养基只需1／4毫克。
这些金属元素在普通水（河水、自来水）中都有，一般培养料不再添加。
[5]各种维生素和生长素，量很微，但必不可少。
[6]栽培原料:广泛采用棉籽壳。
棉籽壳含粗蛋白73％，粗脂肪3.45％，粗纤维36.99％，无氮浸出物73.99%。
其物理性能良好，能使水分和空气的矛盾得到解决，以满足菌丝生长的要求，棉籽壳的表面密布的一层棉纤维，在合适的水分、空气和温度的条件下首先分解，加之壳内残存的棉籽碎屑，也易分解利用；经过试验，1斤干棉籽壳能产1斤左右的鲜平菇，最高达4斤左右。
食用菌的制种(母种的分离和培养)
食用菌的制种（母种的分离和培养）()---食用菌菌种质量的优劣，直接影响到栽培的成败和产量的高低，只有优良的菌种，才能获得优质高产的食用菌。
因此食用菌的制种，是生产中一项极其重要的工艺。
食用菌的菌种按培养阶段和来源的不同，可分母种、原种和栽培种三种。
从食用菌的孢子分离培养或从组织分离培养、基内菌丝分离培养所得到的第一代菌丝体，称为母种。
从母种扩大培养的菌丝体，称为原种。
从原种扩大培养直接用于生产上播种的菌丝体；称为栽培种。
一、母种的分离和培养（一）母种培养基的配制1.母种培养基的种类母种是菌种生产的关键，要求纯度高，不能混生杂菌，同时母种的菌丝体较为纤细，分解培养料的能力较弱。
因此，母种菌丝体需要培养在营养丰富，易被吸收，表面光滑易于鉴别有无杂菌感染的琼脂培养基上。
适合母种菌丝生长的琼脂培养基种类很多，常用的有下列几种：（1）马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基马铃薯（去皮） 200克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（2）麦芽汁——葡萄糖——琼脂培养基干麦芽 250克琼脂 15～20克葡萄糖（或蔗糖） 10克水 1000毫升（3）胡萝卜——葡萄糖——琼脂培养基胡萝卜 100克琼脂 20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（4）蘑菇汁——葡萄糖一一琼脂培养基（适用于蘑菇）鲜蘑菇 250克琼脂20克葡萄糖（或蔗糖） 20克水 1000毫升（5）蛋白胨——葡萄糖——琼脂培养基蛋白胨 2克葡萄糖 20克磷酸氢二钾 2克维生素B1（硫胺素） 0.5毫克磷酸二氢钾 0.5克琼脂 18克硫酸镁 0.5克水l000毫升2.母种培养基的制法兹以最常用的马铃薯——葡萄糖——琼脂培养基的制法为例介绍如下：先将马铃薯去皮，洗涤，切成小块，加水1000毫升，煮沸15～20 分钟，取双层纱布过滤，取其滤液，加入琼脂和葡萄糖（或蔗糖），用文火加热使其溶化，最后补足水分，使其容量仍为1000毫升。
趁热分装于试管中，装量约为试管长度的1/5左右，装管时要注意不使培养基沾污试管壁和试管口。
实验7 食用菌母种的制作与转管技术
实验注意事项
（1）组织块分离法对于胶质的耳类及菇体较小较薄的菇类，如金 针菇等不太适宜。 （2） 此法应严格遵循无菌操作。 （3）纯化菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。 （4）控制菌龄菌丝即将长满斜面（一般7～10天）终止培养。分 别用于菌种保藏或繁衍原种。 （5）出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。看产量、 质量、形态、长势、抗性如何，鉴定为优质菌种后，才可供生产 使用。
应用：此法适宜多数食用菌，是野外工作者和种菇专 业户必须掌握的一种方法。
实验原理
2.钩悬法 是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离
法。
实验原理
3.孢子印分离法 取成熟子实体经表面消毒
后，切去菌柄，在20～ 24℃静置一天，大量孢子 落下形成孢子印。 接种环沾少量孢子在试管 培养基上划线培养。
（0.3～0.4立方厘米）大组织，放入斜面培养基上。迅速 塞上棉塞。
如已开伞的种菇、则选菌盖与菌柄交界处的菌肉。 如种菇已受雨淋，吸水较多，应取菌褶作为接种材料。
母种分离视频
实 验 步骤
5. 培养 取接组织的斜面试管放置于
25℃的培养箱中培养。 6. 转管
在菌丝长满斜面之前，菌丝生 长最旺盛时，挑取菌丝进行转管扩 繁。
结果与思考题
1.如何避免因污染而造成的组织分离的失败？ 2.判断你所分离的母钟是否标准？ 3.孢子分离的母种为何一定要做出菇试验？
实验材料
材料：平菇、香菇、杏鲍菇较成熟的子实体 用具：培养皿；试管斜面培养基；酒精灯，接种刀，
75%酒精，消毒液；冰箱；培养箱等。 培养基：PDA斜面培养基
实 验 步骤
1. PDA培养基的配置 配方： 马铃薯浸粉； 5.0g /L；葡萄糖20.0g /L；琼脂 20.0g /L ；
菌种母种的分离培养
菌种母种的分离培养在自然界里，食用菌都不是单独存在的，而是和许多细菌、放射菌、霉菌等生活在一起的。
所谓菌种分离，就是把这些和食用菌一起生活的杂菌分离出来，通过培养，获得纯的优良菌种。
菌种分母种、原种、栽培种。
母种的分离培养食用菌母种的分离，可分为孢子分离法、组织分离法以及基内菌丝分离等。
1.孢子分离法孢子分离法，是用食用菌的有性孢子或无性孢子萌发成菌丝，培养成菌种的方法。
这种菌种生活力较强，但孢子个体之间有差异，且自然分化现象较严重，变异大，需经出菇试验才能在生产上应用。
（l）单孢分离法：是每次或每支试管只取一个担孢子，让它萌发成菌丝体来获得纯菌种的方法。
蘑菇和草菇用单孢分离得到的菌丝，有结实能力，可采用此法分离生产纯菌种。
单孢分离生产上较少采用，而且技术复杂，一般采用多孢分离法。
（2）多孢分离法：就是把许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配来获得食用菌纯菌种的一种方法。
具体操作方法，有以下几种：①种菇孢子弹射法：选择个体健壮、朵形圆正，无病虫害、出菇均匀、高产稳产，适应性强的八九分成熟的种菇，切去大部分，菌柄用无菌水冲洗数遍后再用已灭菌的纱布或脱脂棉、滤纸吸干表面水分。
在接种箱或无菌室内，把种菇的菌褶朝下用铁丝倒挂在玻璃漏斗下面，漏斗倒盖在培养皿上面；上端小孔用棉花塞住。
培养皿放在一个铺有纱布的搪瓷盘上，静置12～20小时，菌褶上的孢子就会散落在培养皿内。
形成一层粉末状孢子印（平菇极淡紫色，蘑菇、草菇为褐色，香菇、金针菇孢子印白色）。
用接种针沾取少量孢子在试管中的琼脂外面或培养皿上划线接种。
待孢子萌发，生成菌落时，选孢子萌发早、长势好的菌落进行试管培养。
还可用孢子采集器收集孢子。
方法是选好种菇后，按上述程序，轻轻掀开玻璃钟罩，将种菇柄朝下插在孢子采收器的钢丝架上，放在培养皿正中央。
随即盖好玻璃罩，用纱布将钟掌周围塞好。
并在纱布上倒少许升汞或无菌水。
移入20℃左右恒温箱培养。
②褶上涂抹法：按无菌操作分离时；应选择成熟的种菇，用接种针直接插入褶片之间，轻轻抹取褶片表面子实体尚未弹射的孢子，再在培养基上划线接种。
食用菌生产技术 实验多孢分离育种技术
实验一、平菇多孢分离育种技术（一）（二）一、实验目的1.了解多孢分离制作母种与组织分离制母种的区别及意义2.掌握平菇多孢分离技术二、实验原理食用菌子实体生长健壮，八成熟时，可散发大量有性孢子，这些孢子在一定条件下，可相互配合，形成双核菌丝体，从而制取母种。
多孢子分离技术是有性繁殖过程。
通过这种方式可以选育出优良菌种，有时还可使退化的菌种复壮。
三、实验步骤（一）制备培养基马铃薯200g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，VB1微量，琼脂18g，水1000mL，pH 值自然。
按常规方法制试管斜面或三角瓶底面0.5㎝厚的琼脂板。
（二）选择种菇选取生长健壮，八成熟，无病虫害的平菇一朵待用。
（三）收集有性担孢子在无菌条件下，拨出斜面试管口或瓶口的棉塞，在菌褶（猴头菇用菌刺）前端的五分之二处剪取约1.5～2㎝2的菌褶，用镊子挑取一片菌褶，贴附在已灭菌的斜面培养基正上方，迅速塞好棉塞。
于24－26℃条件下恒温培养6-24小时后取出。
（四）孢子萌发培养及菌丝体纯化在酒精灯火焰附近去掉棉塞，用消毒小钩钩出管内的小片菇种，将棉塞连同试管口在火焰上灼烧后，迅速塞上棉塞，于24～26℃恒温培养1周，待孢子萌发，井长成成片菌丝后，切取生长迅速、无杂菌污染的菌丝团转管纯化，待菌丝长满管后便可扩大繁殖备用。
四、作业1.多孢分离育种操作应注意什么？（种菇选择及整个过程无菌操作）2.多孢分离制作母种与组织分离制母种各自有什么优缺点？（多孢子分离制作母种优点：是有性繁殖过程，通过这种方式可以选育出优良菌种。
其缺点操作繁琐，成功率低。
组织分离制母种优点：是无性繁殖过程，操作简单，成功率高。
缺点：多次组织分离制得的菌种易退化。
）。
食用菌母种的分离
孢子收集器示意图
3、母种转管接种与培养。
母种的接种必须在严格的无菌条件下进行。 否则将会造成严重污染，给生产造成造成巨大损失。 然后将所有试管及接种器具放入接种箱里进行消毒 灭菌，力求灭菌彻底。在点燃酒精灯火焰上进行操 作，将菌种试管和接种用斜面培养基放在火焰旁。 拨去棉塞，把消毒灭菌的接种针伸入菌种试管内， 挑小块菌种放入斜面培养基中（见下图）
3.工艺流程：
称量→煮制→分装→灭菌 → 排斜面→无菌检验
培养基的分装及排斜面示意图
（二）、母种的接种与培养
1．组织分离法制母种（无性繁殖） 将子实体、菌核、菌索等一小块组织放
于斜面培养基上，使其萌发为纯菌丝的方法， 称为组织分离。该法具有简便、易成功、能 保持原菌种性状等优点，但重复多，易退化， 应与孢子分离交替进行。组织分离法适用于 绝大多数食用菌
② 棉子壳培养基：棉子壳99.5%，石膏 0.3%，水适量。适用于培养平菇、猴头、金 针菇、鸡腿菇。
3.培养料的配制 ⑴ 木屑、棉籽壳培养料的拌料配制
木屑、棉籽壳培养料按配方称量后，堆制 混和，加水拌料，配方中的糖也可先溶于水 中再拌入。拌料时要控制料的含水量在60﹪ 左右 。
⑵ 谷粒培养料的配制
菌柄与菌盖交界处取组织块
用解剖刀或鲜剖剪蘸酒精进行火焰消毒，冷却后把自己消毒 的种菇纵切开，然后用菌盖笔菌柄交界处，切取长宽的 0.3~0.5厘米的菌肉组织块，用接种针移到斜面培养基上，置 24℃恒温箱中培养。
检查选
每天检查试管斜面菌落生长情况，如从分离的菌肉组织块上 长出正常的白色菌丝，即分离成功，及时将生长出来的菌丝 转移新的试管斜面。若在组织块附近或其他地方出现其他颜 色杂菌生长应予以淘汰。
谷粒因其营养较丰富，制作的菌种具有菌 丝萌发早、吃料快、抗衰老能力强、产量高 等优点，在生产中应用较多。一般是采用浸 泡法或煮熟法，也可用石灰水浸泡。
食用菌母种制作-实验一讲解
食用菌母种制作-实验一讲解实验一食用菌母种制作一、目的要求：1、了解母种培养基制作过程，理解灭菌原理；2、掌握母种培养基的制备方法；3、了解无菌操作基本原理，掌握母种的无菌接种培养方法。
4、了解和掌握食用菌组织分离法的方法步骤；5、熟练分离出栽培用菌种。
二、主要仪器设备及药品材料：灭菌锅、超净工作台、酒精灯、电炉、铝锅、漏斗、纱布、菜刀、砧板、烧杯、捆扎绳、硅胶试管塞、试管（18x180mm）、手术刀、镊子、75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、平菇子实体。
三、实验步骤与方法:①培养基的制作1 PDA培养基配方马铃薯200克,葡萄糖20克,琼脂20克,水1000毫升.2. 母种培养基的配制(1)熬制。
马铃薯洗净，挖芽去皮。
称取200克，切成玉米大小颗粒或薄片。
量筒量取1000毫升水，铝锅中煮沸后记时30分钟。
四层纱布过滤于量杯中。
滤液倒入锅中文火加热，加入葡萄糖和琼脂，不断搅拌，直到琼脂溶化。
补足水量至1000毫升。
(2)分装试管。
将熬制的培养基用小漏斗趁热分装。
培养基高度为试管长度的1/5左右，注意避免培养基沾于试管口外。
分装完成后，盖紧硅胶塞。
（3）捆把。
7支试管为一捆，用牛皮纸包裹试管口，用捆扎绳扎紧。
贴上标签，准备灭菌。
（4）灭菌。
注意加足水量和排气，灭菌完成后降压不能太快。
（5）摆斜面，培养基长度约为试管长度的1/2。
斜面试管上覆盖洁净的厚毛巾或几层纱布，防止试管内产生过多的冷凝水。
①菌种分离与培养（1）种菇选择。
选取无杂菌感染，无病虫害，出菇均匀，适应性强的子实体，要求个体健壮，朵大肉厚，外形规整，出菇早，约七八成熟的新鲜子实体。
子实体采收后切去大部分菌柄，放入干净器皿内备用。
（2）母种分离（组织分离法）。
在分离前用75%的酒精棉球擦菇体进行表面消毒，在超净工作台内将子实体撕开，用消毒刀片在菌盖与菌柄交接处的组织上取一小块（绿豆大小）移至试管斜面培养基的适当位置，迅速塞上硅胶塞。
将分离的试管放在室内避光培养7-8天，检查菌丝生长情况。
食用菌原种的筛选与扩繁的实验报告
食用菌原种的筛选与扩繁的实验报告一、实验目的深入理解食用菌母种的含义、重要性和生产上的作用。
学会常用母种培养基的配制方法，掌握母种转管继代培养技术，了解食用菌母种制作的工艺流程和制作母种的基本技能。
二、实验原理食用菌母种是指从大自然首次分离得到的纯菌丝体，多通过孢子分离法、组织分离法和菇木分离法获得纯菌丝体。
因其在试管里培养而成，并且是菌种生产的第一步骤，因此又被称为试管种或一级种。
纯菌丝体在试管斜面上再次扩大繁殖后，则形成再生母种。
它既可以繁殖原种，又适于菌种保藏。
母种的扩大培养是从一支母种转接、培养、扩繁成若千支母种的过程，整个过程期间，须在无菌环境条件下，进行母种菌的转接、培养与扩繁。
三、实验所需1、菌种：平菇、杏鲍菇、金针菇、灰树花等。
2、材料试剂：马铃薯、葡萄糖、琼脂、酵母膏、75%酒精等。
3、仪器用具：天平、电炉、熬制锅、刀砧、小刀、玻棒、纱布、漏斗架、漏斗（套接橡胶管和)、止水夹、试管(18×180mm左右)、棉花、橡皮筋、牛皮纸(报纸)、棉线、铁筐、高压灭菌锅、超净工作台、酒精棉瓶、长柄镊子、接种具（钩、锄等）、酒精灯、火柴、垫架、标签、笔等。
四、实验内容(一)母种培养基配制(1)培养基配方常用培养基PDA：马铃薯(去皮去芽眼)200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml、酵母膏2.5g。
(2)培养基配制将马铃薯去皮洗净、挖去芽眼，称取200g，用刀砧切碎，放入熬制锅(内壁有容积刻度)中，加入清水，电炉加热煮沸后调小火力，维持约20min，煮至软而不烂为止。
用双层湿沙布过滤，得过滤薯液，再向过滤液中加入琼脂20g继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖20g及酵母膏2.5g，补足水分至1000ml，搅拌均匀煮沸溶化后准备装管。
(3)分装试管培养基配制后应趁热分装。
装入培养基占试管的1/4-2/5处，装管时控制好止水夹头，对培养基流向、流速、流量进行控制，勿使管内外壁沾上培养液，以免浸湿棉塞，易受杂菌污染。
组织分离法制备母种
1.菌丝未萌发
• ①组织块太小； • ②烫伤严重； • ③培养条件，如温度不适宜。
2.有杂菌污染
① 培养基灭菌不彻底； ② 培养基成分适宜杂菌生长； ③ 环境、用具消毒不严格； ④ 菇体耳体消毒不严格； ⑤ 接种操作控制不当，要无菌操作。
常见的杂菌观察
• 常见的杂菌主要有细菌、放线菌；
青霉、黑曲霉
杏鲍菇：Pleurotu seryngii
榆黄蘑：Pleurotus citrinipileatus
榆黄蘑：Pleurotus citrinipileatus
白灵菇：Pleurotus eryngii
白灵菇：Pleurotus eryngii
红菇：Russula lepida
子囊菌纲食用菌
羊肚菌
羊肚菌
Morchella esculenta
子囊菌纲食用菌
冬虫夏草
冬虫夏草
冬虫夏草的蛹、成虫、虫卵 冬虫夏草的蛹
冬虫夏草的虫卵
三、PDA培养基制作及灭菌
PDA培养基配方：
马铃薯 葡萄糖或蔗糖 琼脂 水 pH 30 g 3 g 2.7-3 g 150 ml 自然
每组150ml。每人分装1支试管。 包扎。灭菌
灰树花
担子菌纲食用菌
长根菇
牛肝菌
担子菌纲食用菌
茶新菇
茶树菇
茶树菇 Agrocybe aegerita
茶树菇 Agrocybe aegerita
鸡腿菇
鸡腿菇
Coprinus comatus
担子菌纲食用菌
真姬菇
担子菌纲食用菌
虎掌菌：Sarcodon imbricatus
猪苓菌：Grifola umbellata
如何用组织分离法制备灵芝母种
母种2023-11-05contents •组织分离法介绍•准备工具和材料•具体操作步骤•注意事项•总结目录01组织分离法介绍•组织分离法是一种常用的微生物分离方法，它通过从灵芝子实体或菌褶中切取一小块组织，然后将其接种到选择性培养基上，以获得纯培养的灵芝母种。
组织分离法的定义•组织分离法适用于从自然界中分离和纯化各种微生物，包括细菌、真菌、病毒等。
它是一种非常实用的方法，尤其适用于从子实体或菌褶中获得纯培养的真菌，如灵芝等。
组织分离法的应用范围组织分离法的优缺点优点1. 操作简单易行，不需要复杂的设备和仪器。
2. 可以获得纯培养的微生物，避免了其他杂菌的污染。
•对于一些难以通过其他方法分离的微生物，组织分离法是一种有效的手段。
组织分离法的优缺点组织分离法的优缺点缺点1. 有些微生物在组织分离过程中可能会受到损伤，影响其生长和繁殖。
2. 有些微生物在组织分离过程中可能需要特定的培养条件才能生长，否则会影响其分离效果。
3. 组织分离法获得的母种可能存在一定的遗传差异，需要经过进一步的筛选和鉴定才能获得理想的菌株。
02准备工具和材料酒精灯电子天平用于消毒器械，需准备镊子、解剖刀、接种针等。
用于称量药品和材料。
培养皿恒温箱用于接种和培养灵芝组织块。
用于控制培养温度和湿度。
三角瓶超净工作台用于培养灵芝菌丝体。
提供无菌环境，用于接种和培养操作。
工具准备选择健康、无病虫害的灵芝作为分离材料。
材料准备新鲜灵芝用于诱导灵芝组织块萌发菌丝体。
PDA培养基提供营养，促进菌丝体生长。
葡萄糖提供营养，促进灵芝生长。
麦麸使培养基凝固，便于接种和培养。
琼脂制备培养基和培养灵芝所需的水源。
水03具体操作步骤总结词选择遗传性状优良、产量高、质量好的灵芝菌种。
详细描述从具有优良性状的灵芝中选取组织块，遗传性状优良的菌种可以确保后代遗传优势，提高产量和质量。
选择优良菌种总结词对选取的菌种进行表面消毒，以减少杂菌污染。
详细描述将选取的菌种表面用70%酒精棉球擦拭消毒，以减少杂菌污染，提高组织分离成功率。
平菇的组织分离及培养
平菇的组织分离和培养一、实验目的1、了解食用菌的基础知识。
2、了解、掌握食用菌培养基的配置原理。
3、通过平菇栽培实验，掌握食用菌代料栽培的一般方法。
二、实验原理（食用菌的组织分离法）食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离，是获得母种最简便的方法。
三、实验材料1、原种制作实验材料（1）食用菌：平菇。
（2）培养基：PDA培养基斜面。
（3）仪器或其他用具： 75%酒精棉球、接种针记号笔等。
2、食用菌的组织离2、食用菌的组织分离（1）试剂：棉籽壳、麸皮、蔗糖、CaCO3（2）仪器或其他用具：平菇菌种、香菇菌种、金针菇菌种、姬菇菌种、茶树菌种、台秤、盆子、聚丙烯塑料袋、颈圈、封口膜、橡皮筋、高压蒸气灭菌锅、pH试纸（pH 5.5—9.0）、记号笔、麻绳等四、实验步骤平菇组织分离的方法和步骤一、种菇选择：一般选择在适宜出菇期出菇早、出菇整齐、特征典型、无病虫害、产量高的栽培袋，从中选择菌肉肥厚、大小适中、颜色正常、尚未散孢、长至七八分成熟的优质菇作种菇二、种菇消毒：用0.1%升汞溶液或75%酒精浸泡或擦拭，无菌水冲洗，吸干表面的水分。
三、切块接种：将分离种菇沿菌柄中心纵向掰成两半，用解剖刀在菌盖和菌柄交界处划成田字形，取黄豆粒大一小块菌肉组织，接在PDA培养基上。
四、培养纯化：温度控制在22℃~25℃之间，培养1~2天，长出白色绒毛状菌丝体，4~5天通过筛选，挑出菌丝洁白、清晰、生长整齐、健壮的试管母种继续培养，将有杂菌、长势纤弱的淘汰。
7~10天菌丝长满斜面。
五、注意事项1、在整个操作过程中都要注意无菌操作，一切用具都要消毒。
2、要等刀片冷却后再切取组织块。
3、栽培种在培养过程中，应经常检查，污染袋要及时检查出处理掉。
经过30—40天的培养，菌丝长满袋后即可使用。
若菌袋内长出原基，说明菌种已经老化。
若有黄、绿、黑等杂色斑点或连成片时，说明菌种已经污染，不可使用。
食用菌组织分离法实验报告
食用菌母种的制作——组织分离法实验报告实验目的:学习和掌握食用菌的组织分离法；实验原理:食用菌的母种一般是采用孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物。
利用食用菌子实体内部组织进行分离, 是获得母种最简便的方法。
实验器材:1.食用菌：香菇、平菇。
2.培养基：PDA培养基斜面。
3.仪器或其他用具：75%酒精棉球、接种针记号笔等。
实验方法:1.选择种菇: 选择肥壮菇体作种菇；2.种菇消毒: 取1张菇片, 用70%的酒精轻擦表面进行消毒；3.菇肉接种：将菇片纵向撕开, 在每个裂面靠近菇柄与菌盖的交界处取一米粒大小的菇肉组织接于PDA试管斜面上；4.培养：将试管斜面置于15～30℃下培养；五、注意事项1. 在整个操作过程中都要注意无菌操作, 一切用具都要消毒。
2. 要等刀片冷却后再切取组织块。
六、实验结果与记录第一次实验: 10月16日上午进行接种, 两试管都以肥壮的双孢菇为种菇, 10月13日观察培养基杂菌没有菌落产生结果分析：本次实验全班只有一人成功，大部分都被杂菌污染，最有可能的原因就是制作的PDA培养基本身受到污染，但是又有培养基根本没有菌落产生，那么一方面可以看做是空白对照，得到培养基本身没有问题而是我们操作都有问题，没有做到避免污染，规范的无菌操作，另一方面也有可能是在接种过程，接种针，试验刀酒精灯上灼烧后未冷却直接接触种菇，使待接种的菌块高温致死。
第二次实验: 10月30日上午进行接种, 记号笔标记的两支试管为双孢菇, 标签纸标记的两只试管为香菇进行实验, 10月9日观察实验基本成功，试管下端有少部分红棕色杂菌实验成功，无杂菌，斜面上均为雪白的菌丝结果分析：培养基本身无污染，接种香菇菌块的过程中可能由于接种针和实验刀未完全冷却导致目的菌块高温致死，培养基上无菌落产生。
接种双孢菇菌块过程中基本做到了无菌操作，实验较为成功。
实验感想：本实验原理目的简单，操作过程方法在微生物学中也有接触，但是容易杂菌污染，第一次实验结果几乎全军覆没，几乎所有培养基都受到了污染，第二次实验在总结前一次的基础上，大部分做到了无菌操作，看到了培养基中雪白的菌落。
组织分离制食用菌母种PPT课件
复习上一节 母种培养基的配制步骤
• 1.按配方称量：见下面的配方 • 2.煮制 • 3.分装 • 4.灭菌 • 5.排斜面
母种培养基配方：
1.土豆200g、糖20g、琼脂20g、水1000ml
2.去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、 水1000ml、PH值自然，另外添加：麸皮20g、 玉米面5g或黄豆粉5g、磷酸二氢钾2g，硫酸 镁2g，VB11片（10mg）。 此配方适用于大多数菌种，金针菇、黑木耳、 灵芝生长尤其茁壮。 可作黑木耳、香菇的复壮培养基，效果显著。
2.记录你制作的母种的生长状态; 3.是否有杂菌污染,如有分析其原因.
再见!
写在最后
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
37
谢谢聆听
·学习就是为了达到一定目的而努力去干, 是为一个目标去 战胜各种困难的过程,这个过程会充满压力、痛苦和挫折
人操作； 第二大组可在无菌室内操作；
第一大组采用菌盖与菌柄交界处组织进 行分离，第二大组采用菌盖带菌褶部分 进行组织分离，作对比观察。
分组辅导
注意同学们的操作； 及时纠正不规范动作。 接种操作完毕，收集试管进行培养。
数显式恒温培养训第三大部分
结果观察
培养基的高压灭菌
使用高压蒸汽灭菌锅应注意的事项？ （提问同学） (1)锅内装物品不应过紧； (2)注意排出冷气，否则不能保证灭菌效果； (3)加热排冷气后，使温度达到121.3℃，压
力在0.1－0.15 MPa之间维持30 min； (4)不耐高热高压之物品，不能用此法灭菌。
（四）组织分离操作的主要步骤：
实验：组织分离法制备食用菌母种
组织分离法制备食用菌母种（8学时）一、实验的目的和要求1、学会母种培养基的配制方法。
2、掌握组织分离的方法和技术。
3、掌握母种转管继代培养技术。
4、掌握无菌操作技术。
二、实验内容或原理（1）母种培养基配制。
工艺流程：培养基配方培养基的配制灭菌摆斜面（2）菌种分离与培养（本实验以组织分离为例）。
工艺流程：种菇的选择与消毒组织块的切取菌丝培养三、实验材料仪器：超净工作台、高压灭菌锅、电炉、天平、试管、试管架、解剖刀、漏斗、漏斗架、橡皮管、玻璃管、止水、牛角勺、棉花、纱布、酒精灯。
试剂：75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等。
四、实验步骤（1）母种培养基配制A、培养基配方：以PDA培养基为例，马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。
B、培养基配制：首先将马铃薯去皮、洗净、挖去芽眼、切成薄片，称取200 g，放入铝锅中用1000ml清水加热煮沸，维持20min左右，煮至软而不烂为止。
用双层湿沙布过滤，然后取滤液并补足蒸发损失的水分。
再加入琼脂继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖及其它成分，搅拌均匀后准备装管。
C、分装试管：培养基配制后应趁热分装。
装管时勿使管内外壁沾上溶液，以免浸湿棉塞，污染杂菌。
装管后塞上棉塞。
棉塞的大小、松紧度应适宜，以用手提棉塞、试管不脱落为准。
然后每10支度试管扎成一捆，棉塞上方用牛皮纸包好，避免灭菌时被水蒸汽浸湿。
D、灭菌：灭菌前将水加至锅内水位标记高度。
将试管放入锅内，盖上锅盖，对角旋紧锅上螺旋，并闭排气阀，开始加热,当锅内蒸汽大量排出时再继续排汽3-5 min,关闭放气阀.当压力表指针指到0.15 Kg/cm2时(灭菌所需压强)开始计时,继续维持该压强30min。
灭菌结束持压力表指针自然回到”0”位时打开放汽阀,排出锅内剩余蒸汽后,打开锅盖.注意切忌在压力表未到”0”位时就放汽,以免试管内的培养基向上冲浸湿棉塞,造成以后菌种的污染.E、摆斜面：当培养基的温度降到60℃时，将试管斜面放在木棒上，使呈斜面，斜面的长度以占试管长度的1/2为宜。
实验7 食用菌母种的制作与转管技术
食用菌母种制作与转管技术
实验目 的
掌握了解食用菌组织分离的方法和实际操 作技术；
明确食用菌组织分离在食用菌生产中的重 要性。
实验原理
母种
原种
栽培种
实验原理
1.组织分离法：用子实体的某一部 分来分离菌种的方法。
优势：方法简便，后代不易发生变 异，是食用菌栽培中防止品性退化， 保持优良品种特性常用的一种手段。
121℃高压灭菌15min。
实 验 步骤
2.种菇的选择 选择无病虫害、典型、八成成熟的食用菌子实体。
3. 环境和种菇消毒 在接种箱内，用镊子夹着燃烧的酒精棉球迅速擦拭菇
体。 或选用的子实体用0.1％开汞水或70％酒精表面消毒，
用无菌水冲洗并用无菌纱布擦去表面水分。
实 验 步骤
4.取接组织 将菇体撕开，用无菌尖头镊在柄盖交界处取绿豆粒
应用：此法适宜多数食用菌，是野外工作者和种菇专 业户必须掌握的一种方法。
实验原理
2.钩悬法 是一种特别适用于耳类，也适用于伞菌类的多孢分离
法。
实验原理
3.孢子印分离法 取成熟子实体经表面消毒
后，切去菌柄，在20～ 24℃静置一天，大量孢子 落下形成孢子印。 接种环沾少量孢子在试管 培养基上划线培养。
母种转管视频
实验注意事项
（1）组织块分离法对于胶质的耳类及菇体较小较薄的菇类，如金 针菇等不太适宜。 （2） 此法应严格遵循无菌操作。 （3）纯化菌丝长至斜面1/2时，挑尖丝转管，培养成再生母种。 （4）控制菌龄菌丝即将长满斜面（一般7～10天）终止培养。分 别用于菌种保藏或繁衍原种。 （5）出菇试验将再生母种扩成原种、栽培种，使其出菇。看产量、 质量、形态、长势、抗性如何，鉴定为优质菌种后，才可供生产 使用。
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组织分离法制备食用菌母种（8学时）
一、实验的目的和要求
1、学会母种培养基的配制方法。
2、掌握组织分离的方法和技术。
3、掌握母种转管继代培养技术。
4、掌握无菌操作技术。
二、实验内容或原理
（1）母种培养基配制。
工艺流程：培养基配方培养基的配制灭菌
摆斜面
（2）菌种分离与培养（本实验以组织分离为例）。
工艺流程：种菇的选择与消毒组织块的切取菌丝培养
三、实验材料
仪器：超净工作台、高压灭菌锅、电炉、天平、试管、试管架、解剖刀、漏斗、漏斗架、橡皮管、玻璃管、止水、牛角勺、棉花、纱布、酒精灯。
试剂：75%酒精、马铃薯、葡萄糖、琼脂、磷酸二氢钾、硫酸镁、维生素B1等。
四、实验步骤
（1）母种培养基配制
A、培养基配方：以PDA培养基为例，马铃薯（去皮）200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000ml。
B、培养基配制：首先将马铃薯去皮、洗净、挖去芽眼、切成薄片，称取200 g，放入铝锅中用1000ml清水加热煮沸，维持20min左右，煮至软而不烂为止。
用双层湿沙布过滤，然后取滤液并补足蒸发损失的水分。
再加入琼脂继续加热，待琼脂溶化后，添加葡萄糖及其它成分，搅拌均匀后准备装管。
C、分装试管：培养基配制后应趁热分装。
装管时勿使管内外壁沾上溶液，以免浸湿棉塞，污染杂菌。
装管后塞上棉塞。
棉塞的大小、松紧度应适宜，以用手提棉塞、试管不脱落为准。
然后每10支度试管扎成一捆，棉塞上方用牛皮纸包好，避免灭菌时被水蒸汽浸湿。
D、灭菌：灭菌前将水加至锅内水位标记高度。
将试管放入锅内，盖上锅盖，对角旋紧锅上螺旋，并闭排气阀，开始加热,当锅内蒸汽大量排出时再继续排汽3-5 min,关闭放气阀.当压力表指针指到0.15 Kg/cm2时(灭菌所需压强)开始计时,继续维持该压强30min。
灭菌结束持压力表指针自然回到”0”位时打开放汽阀,排出锅内剩余蒸汽后,打开锅盖.注意切忌在压力表未到”0”位时就放汽,以免试管内的培养基向上冲浸湿棉塞,造成以后菌种的污染.
E、摆斜面：当培养基的温度降到60℃时，将试管斜面放在木棒上，使呈斜面，斜面的长度以占试管长度的1/2为宜。
冷却后即成斜面培养基。
(2)菌种的分离与培养（本实验以组织分离为例）
种菇的选择与消毒：选择出菇早，菇形正，菇盖肥厚，具有该品种特征，无病虫害、无杂菌污染，子实体八九分成熟的作为种菇。
种菇选定后，用75%酒精进行表面消毒。
组织块的切取：将斜面培养基放进超净工作台内，用紫外灯（或化学药品）进行消毒0.5h以上,关闭紫外灯后20min后,再开始进入接种室内进行接种。
接种是一项技术性很强的工作，需要在无菌的环境中以无菌操作方法进行接种，才能减少污染。
无菌操作是接种过程中最基本的操作方法，要求操作熟练，动作迅速。
用无菌刀在菇柄或菇盖中部纵切一刀，然后用手将菇体掰成两面三刀半，在菌柄和菌盖交界处用刀切取0.3-0.5cm2的小方块组织,将其移接到试管内培养基的中央，将其移接到试管内培养基的中央。
菌丝培养：接种后置于25℃恒温箱中培养,2-3天后可见组织块周围发生白色绒毛状菌丝,此时每天要检查杂菌污染情况.培养7-10天后,菌丝即可长满斜面。
菌丝长满试管即为一级种（母种）。
（可进行母种转管继代培养。
）
思考题：
1、组织分离获得菌种的理论依据是什么？
2、用组织分离方法获得的母种，为什么要进行出菇试验后才能用于生产？。