液相色谱-质谱联用技术及应用

高效液相色谱-质谱（多级）联用技术及应用

任三香

（中山大学测试中心广州 510275）

众所周知，色谱是一种分离复杂混合物的很好手段,而气相色谱-质谱联用仪由于它集分离与定性快速一气呵成及价廉的优点在应用范围广泛的分析检测行业中占质谱拥有量的50% 以上。但是，气-质联用对样品的要求是来样必须在色谱柱能承受的温度下汽化，对于热不稳定的化合物及汽化不了的样品就得依靠其它分析手段来完成。在攻克液相色谱与质谱联机接口技术后，应运生产的高效液相色谱-质谱（多级）联用仪作为90年代推出的商品仪器已逐步进入质谱界，并得到迅速发展，成为科研和诸多分析行业的有力工具，扩展了质谱仪分析化合物的范围，可谓当今质谱界最为新颖及活跃的领域。本文将简要介绍高效液相色谱-质谱（high performance liquid chromatography-mass spectrometry简称HPLC/MS）（包括多级即MS n）联机新技术及应用。

1 高效液相色谱-质谱（多级）联用技术

高效液相色谱-质谱（多级）联用仪的在线使用首先要解决的问题是真空的匹配。质谱工作需在高真空下完成，要与常压下工作的高效液相色谱（即大量流动相的涌入）-质谱接口相匹配并维持足够的真空，只能采取增大真空泵的抽速，分段、多级抽真空的方法，形成真空梯度来满足接口和质谱正常工作的要求。现有的商品仪器多采用该方法。

在此主要介绍以下二种电离方式：

1．电喷雾(Electrospray Ionisation简称 ESI)：其电离过程是“离子雾化”。当样品溶液流出毛细管的瞬间，在加热温度、雾化气（N2）和强电场（3-5kV）的作用下溶剂迅速雾化并产生高电荷液滴。随着液滴的挥发，电场增强，离子向表面移动并从表面挥发，产生单电荷或多电荷离子。通常小分子得到[M+H]+或[M-H]-单电荷离子。而生物大分子产生Z>1的多电荷离子。由于质谱仪测量的是质量电荷比（m/Z）。因此质量范围只有几千质量数的质谱仪能够检测质量数十几万的生物大分子。

ESI 属于最软的电离技术。其特点是通常只产生高丰度的准分子离子峰。因此可测定不稳定的极性化合物，并可直接分析混合物；多电荷离子的形成可分析大分子量化合物，如蛋白质和寡核苷酸。（对蛋白质的离子化效率接近100%）；通过调节离子源参数可控制离子的断裂，从而给出结构信息有助于化合物的定性分析（也称源内CID）。

ESI可供选择的离子化模式有ESI（+）或ESI（-）。

2．大气压化学电离（Atmospheric Pressure Chemical Ionisation简称APCl）：用于HPLC/MS的APCl技术与传统的化学电离不同，它并不采用诸如甲烷一类的反应气体，而是借助电晕放电（corona discharge）启动一系列气相反应来完成离子化过程。与ESI接口区别在于增加了一根电晕放电针，其功能为发射自由电子首先轰击空气中O2、N2、H2O产生如O2+、N2+、NO+、H2+O等初级离子，再由这些初级离子与溶液中样品流出毛细管时被氮气流雾化到加热管中被挥发的样品分子进行质子或电子交换而使其离子化形成[M+H]+或[M-H]-离子，而后聚焦，进入分析器。

APCl也属于软电离技术。其特点是只产生单电荷的准分子离子峰。适用于分析弱极性的小分子化合物；快速地分析流动相含水量高或低的样品，适合做梯度洗脱；具有通过调节接口内锥孔上的电压来控制分子离子在离子源内的断裂程度（源内CID），来获得结构信息。

APCl可供选择的离子化模式有APCl（+）或APCl（-）。

无论选ESI或APCl模式，都是一次进样就可同时检测正、负离子。

HPLC/MS仪器所用的质量分析器有四极杆（如ABI公司的API3000、2000； Agilent公司的 HP1100LC-MS；Finnigan公司的TSQ7000、LCQ DUO和 Micromass公司的 Quattro LC 及II等。具有二组四极杆的能做MS/MS）、离子阱（如Finnigan公司的 LCQ DECA XP；BRUKER 公司的esquire3000等能做多次串联MS分析）、四极与飞行共存：MS1采用四极分离器，MS2采用OA-Tof（如Micromass的 Q-Tof,做MS/MS）等。由于HPLC/MS（多级）仪器的新颖及不菲的价格，目前广东省的拥有量估计不>10台。

HPLC/MS（多级）仪器的检测器系统采用光电倍增器或高能打拿极/电子倍增器。

HPLC系统可添置PDA（二极管阵列检测器），做到在获得定量数据的同时，采集光谱信息有助于一些特定的定性分析。

由于HPLC/MS仪采用的是软电离技术，只给出样品的准分子离子峰，且流动相的组成和接口温度又不可能做到完全一致，因此HPLC/MS（多级）目前无标准谱图库可供检索。

2 液相色谱-质谱（多级）联用仪的应用

将液相的分析方法用于HPLC/MS（多级）联用时需要考虑以下几方面：1/分析目标化合物的离子化能力，2/流动相的混溶性，3/流速与柱子的匹配性等。

对于可以接受质子的碱性样品（如含NH2、N、NH、CO、COOR ），采用正离子化模式；反之对于易丢失质子的，有较多强负电性基团（如样品含-COOH、–SH、–NO2、-Cl、-Br和多个羟基时）可尝试使用负离子化模式。有些酸碱性并不明确的化合物则要进行预试方可确定。此时也可优先考虑选用APCl（+）进行测定，对于热不稳定的化合物则优先考虑选用ESI。

对样品的一般要求是：力求干净，不含显著量的杂质；不含高浓度的难挥发性酸（如硫酸，磷酸等）及其盐，因这些酸及其盐的侵入会引起很强的噪声，严重时还会造成仪器喷口处放电；样品粘度不能过大，以防堵塞柱子、喷口及毛细管入口。因此，样品的制备或前处理在HPLC/MS（多级）分析中同样是必要的。

HPLC/MS（多级）商品仪器的设计所达到的重现性和线性范围指标均能满足一般的定量分析精度要求。但由于其分析的样品来源广泛，本底复杂，因此HPLC/MS（多级）定量中要解决的主要问题是化学基质和生物学基质的干扰。

应用范围：热不稳定大分子化合物（如生物药品，重组产物，医药学方面的药物及体内药物分析、药物降解、药物动力学、临床医学、中药分析）；生物化学领域的肽、蛋白质、寡核苷酸、糖等；环境化学分析方面（如有机污染物，土壤与水质分析）；农药兽药残留量分析（如检测蔬菜，水果及肉类食品中的农残和药残）；法医学方面的滥用药物、爆炸物和兴奋剂检测；合成化学方面的有机金属化合物、有机合成物及表面活性剂、天然产物、复杂混合物分析等等。总之，只有无法离子化的样品质谱才不能检测。与GC/MS相比LC/MS灵敏度更高。

质谱仪从其最基本的功能上而言，主要是一种定性分析工具。采用LC与MS联机的操作方式，可充分发挥液相色谱的分离功能和质谱仪的高灵敏度及高选择性（如单离子检测、中性丢失等），来获取一些混合物中单一组分的结构信息。选用混合编程扫描技术，进行多级质谱方式（MS/MS或MS n）可同时检测（准）分子离子和若干碎片离子，进一步获取相关化合物的结构信息。