鼠李糖脂在生态农业中的应用

鼠李糖脂在生态农业中的应用

一、鼠李糖脂简介

1.1 鼠李糖脂的来源

鼠李糖脂通常是由铜绿假单胞菌在一定培养条件下，通过生物发酵的方法产生的具有表面活性的糖脂类产物[1]。1949年，Jarvis和Johnson最早对使用铜绿假单胞菌（Pseudomonas spp.）生产鼠李糖脂进行了报道[2]。目前，人们通常采用假单胞菌（Pseudomonas spp.）发酵生产鼠李糖脂。发酵法的关键是首先筛选出性能优良的高产菌株，然后再进行培养条件的优化来提高产量、降低成本。培养基中的碳源是决定生物表面活性剂产量和结构的重要因素。鼠李糖脂在菌株培养中生产的限制条件是发酵过程中累积的次级代谢产物，这些限制条件不包括碳源，而氮源和磷则会限制鼠李糖脂的生产[3]。鼠李糖脂发酵的关键首先是能筛选或者构建出鼠李糖脂产量高的菌株，然后再对合适的生产菌株的发酵的各种条件进行优化，从而达到高产量低成本的目标。条件优化主要从碳源、氮源、无机盐离子以及pH、温度等方面来进行[4]。

目前主要通过代谢工程和基因工程方法来提高鼠李糖脂产量，这些策略的主要目的是：(a)不使用化学消泡剂获得高浓度的鼠李糖脂；(b)利用可再生资源生产鼠李糖脂，降低生产底物成本；(c)控制生产过程中的其他产物，获得单一的鼠李糖脂而不是混合物；(d)建立鼠李糖脂的非致病性生产菌株；(e)寻常基础材料生物催化鼠李糖脂的生产[5]。实际工业生产中，鼠李糖脂生产条件的优化主要是通过添加脂肪酸、生产菌株随机突变、控制发酵pH值、控制底物摄取量和运用Tween-80及Triton X-100提高鼠李糖脂的产量。之前有研究者将鼠李糖基转移酶复合物I(Rh1AB)在相对较安全的生产宿主恶臭假单胞菌KT2440中异源表达，但是产量提高的很少[6]。可以通过构建工程菌株提高鼠李糖脂产量，之前有研究证明自转运酯酶参与了细胞膜的形成和运动，也参与了脂类的运输，当敲除自转运酯酶基因，鼠李糖脂产量明显降低，由此可知，自转运酯酶也参与了鼠李糖脂的形成，过量表达自转运酯酶EstA[7]和鼠李糖基转移酶复合物I(Rh1AB)提高鼠李糖脂产量[8]。

1.2 鼠李糖脂的结构

鼠李糖脂结构主要包括两部分，由鼠李糖和具有不同碳链长度的饱和或不饱和脂肪酸构成。鼠李糖脂的分子结构中既有极性基团又有非极性基团，是一类中性两极分子。亲水基团是非离子形式的单或双鼠李糖，疏水基团是由带羟基的脂肪酸组成。在生物合成过程汇总，这些基团之间可能相互衔接而生成多种结构相近的同系物，并且不同的菌株和发酵条件所得到的鼠李糖脂同系物组成不同。研究表明[9]，铜绿假单胞菌产生的鼠李糖脂主要有四种结构，如图1所示[10]，分别是RL1、RL2、RL3和RL4，其中RL1和RL3 为单鼠李糖脂；RL2和RL4为双鼠李糖脂。随着现代分析手段的应用，发酵产物中大量不同的鼠李糖族同系物被发现，而且它们分别连着不同的脂肪酸链，鼠李糖环也各不相同。

图1 铜绿假单胞菌产生的4种不同结构的鼠李糖脂

1.3鼠李糖脂的理化性质及优点

鼠李糖脂是一种阴离子表面活性剂，是表面活性剂家族中的后起之秀，它是由微生物所产生的一类具有表面活性的生物大分子物质。它不仅溶于甲醇、氯仿和乙醚，在碱性水溶液中也表现出良好的溶解特性，与化学合成的表面活性剂相比，生物表面活性剂除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫等相同作用外，由于生物表面活性剂来自微生物的代谢活动，还具有一般化学合成的表面活性剂无法比拟的特征和优点：

（1）高效性：生物表面活性剂的化学结构要比化学合成的表面活性剂复杂和庞大得多。单个分子要占据更大的空间，因而表面活性要强于化学表面活性剂，具有更多的活性基团，可以更好地吸附于油水界面，改善油水界面性状，因而在

降低水-气及油-水界面张力方面更加有效。

（2）耐温性：有些生物表面活性剂可耐受高温，如由地衣芽孢杆菌产生的脂肽在75℃时至少可耐热140h而保持很好的表面性能。

（3）耐盐性：生物表面活性剂在10%的盐溶液中仍不沉降或析出，而化学合成表面活性剂在2～3%的盐溶液中就会失活。

（4）可生化降解性：生物表面活性剂在水体或土壤中都能很快被微生物100%降解。

（5）环境友好性：生物表面活性剂产品本身低毒或无毒，生产的原料天然，工艺简单，使用中用量少，选择性好，对环境友好。

（6）可原位合成性：因而有可能大大降低其使用成本。另外，通过微生物的生物方法可以在分子中引进化学方法难以合成的复杂基团，使得生物表面活性剂化学结构具有多样性，从而可能使其具有某种特殊功能。

鼠李糖脂是目前生物表面活性剂中最重要、应用最广泛的一类，它属于水溶性阴离子生物表面活性剂，具有降低界面张力、增溶、乳化、渗透、润湿等多种功能，同时它又具有较好的热稳定性和化学稳定性，在90℃时仍具有很好的表面性能，并且能被微生物100%降解，是典型的环保型绿色产品。

1.4 鼠李糖脂生物表面活性剂已获得的绿色认证

（1）急性经口毒性试验LD50＞5000mg/kg·Bw，属实际无毒。

（2）2004年，美国环保署即通过了鼠李糖脂作为生物农药的备案（PC Code 110029）。

（3）纽约州环境保护部固体和危险材料农药管理局，新的活性成分鼠李糖脂登记农药新产品的注册文件（EPA注册编号72431-1）。

（4）鼠李糖脂作为一种新的活性成分，申请登记生物杀菌剂的联邦登记公告。2003年5月7日（68 FR 24456）。

（5）美国环保署（EPA），关于鼠李糖脂生物表面活性剂在食品中、农药化学品中的容许量申请及批复。（68 FR 25026和68 FR 16796）

1.5 鼠李糖脂生物表面活性剂在绿色农业上的应用方向

（1）添加于肥料中提高肥料利用率，增强肥效；

（2）直接作为生物农药或添加于农药产品中，增强药效；

（3）用于土壤调节，增强土壤活力；

（4）用于果蔬保鲜。

二、鼠李糖脂在生物农药方面的应用

2.1 鼠李糖脂的防治机理

2.1.1鼠李糖脂对于孢子类植物病原菌的生物合成有抑制作用

鼠李糖脂可破坏真菌的细胞膜，使孢子丧失移动性并快速水解，进而抑制真菌孢子萌发和菌丝生长。Stanghellini等［11］研究发现浓度为30μg/mL鼠李糖脂能使辣椒疫霉病和黄瓜腐霉病孢子在1min内全部完全水解。鼠李糖脂瓦解真菌孢子细胞壁，促使植物病菌死亡，在葡萄灰霉病、大豆疫霉菌、辣椒炭疽病上也同样发现鼠李糖脂有溶解真菌细胞壁的作用［12-14］。真菌细胞壁主要由几丁质和β-1，3-葡聚糖组成，几丁质在细胞壁内部，葡聚糖在细胞壁内外部均有。鼠李糖脂处理被真菌病害侵染的植物之后，植物体内几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶增加，病原菌细胞壁被水解酶破坏，菌丝细胞壁变薄，破碎，最终死亡［11，13］。

此外，鼠李糖脂能阻止病菌孢子的移动，降低病菌对植株的侵染率［12,14,15］。鼠李糖脂在土壤中有很好的溶解性和分散性，高浓度的鼠李糖脂在土壤中能有效阻止孢子移动，降低其对植物的侵染，从而达到预防植物病害的目的。

2.1.2诱导抗性

植物与病原体协同进化过程中，逐渐形成了一系列的高效保护机制来抵御病原物的侵害。植物免疫系统分两个层次，第一个层次是由病原相关分子模式（PAMPs）触发的免疫反应（PTI）；第二个层次是触发性免疫（ETI）；PTI和ETI 都属于免疫信号，但PTI比ETI更加强烈和持久［16-18］。

茉莉酸、水杨酸和乙烯在植物PTI和ETI信息网络中起着关键的作用。鼠李糖脂可促使拟南芥防御基因PR-1（水杨酸标记基因），PDF1.2（茉莉酸/乙烯标记基因）和PR-4（乙烯标记基因）表达，触发拟南芥的防御反应［19］。在西瓜、葡萄、小麦和烟草中，鼠李糖脂诱导植物免疫反应也有报道［13,20,21］。鼠李糖脂能激活PTI，预防葡萄灰霉病的发生，用0.025 mg/mL鼠李糖脂处理灰霉病感染的葡萄叶片，与对照相比几丁质酶基因表达高达320倍［13］。几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶属于水解酶类的病程相关蛋白（PRS）也属于防御产物，与植物系统诱导性抗性（ISR）密切相关。鼠李糖脂能在室温条件下通过诱导植物抗性反应来