近红外分光光度法指导原则

近红外分光光度法指导原则一、背景介绍近红外（Near Infrared，简称NIR）光是指介于可见光与中红外之间的电磁波，谱区范围是780~2526nm(12820~3959cm-1)，通常又将此波长范围划分为近红外短波区（780~1100 nm）和近红外长波区（1100~2526 nm）。

与中红外相比，该区域主要是O-H，N-H，C-H，S-H等含氢基团振动光谱的倍频及合频汲取，谱带宽，重叠较严峻，而且汲取信号弱，信息解析简单，所以尽管该谱区被发觉较早，但分析价值始终未能得到足够的重视。

近年来，由于计算机与化学统计学软件的进展，特殊是化学计量学的深化讨论和广发应用，使近红外成为进展最快、最引人注目的光谱技术。

与传统的分析方法比较，近红外光谱分析技术拥有很多独到之处。

但和其它析方法一样，近红外分析方法也存在不足之处。

首先，它是一种间接的分析技术，需要通过收集大量具有代表性的标准样品，通过严格细致的化学分析测出必要的数据，再通过计算机建立数学模型，才能猜测未知样品的结果。

而模型的建立需耗用大量的人力、物力和财力；其次，由于NIR谱区为分子倍频与合频的振动光谱，信号弱，谱峰重叠严峻，所以目前还仅能用于常量分析，被测定组分的量一般应大于样品重量的0.1%；此外，在进行近红外光谱分析时，应考虑样品的特征、分析试验的设计及数据处理等多方面的问题，才能取得正确的分析结果，建立牢靠的校正模型是利用近红外实现胜利分析的关键。

二、原理及分析方法由于一张近红外光谱既可以给出活性成分、辅料的化学结构信息、还可以给出活性成分的工艺信息（如晶型、旋光度、密度等）以及制剂的工艺特征信息（如制粒的大小、硬度等）和部分包装材料的结构信息，所以利用近红外光谱，我们既可以做定性分析也可以做定量分析，但与常规的分析方法不同，近红外光谱技术不是通过观看供试品或测量供试品谱图参数直接进行定性或定量分析，而是首先通过测定样品校正集的光谱、组成或性质数据（组成或性质数据需通过其他认可的标准方法测定），采纳合适的化学计量学方法建立校正模型，再利用建立的校正模型与未知样品进行比较，从而实现定性或定量分析。

1．定性分析近红外光谱谱带较宽，特征性不强，因此很少像其他光谱（如紫外和红外光谱）那样用于化合物基团的识别及结构的鉴定。

近红外光谱的定性分析一般是用于被分析样品在已知样品集中的位置。

常用的方法包括：（1）判别分析法：分析是经典的定性识别方法，其基本思路是相同样品在相同波长下具有相近的光谱汲取，这种光谱间的比较可以是原始光谱也可以是经过处理的光谱。

（2）主成分分析（Principal Component Analysis PCA）法：利用PCA方法将多种波长下的光谱数据压缩到有限的几个因子空间内，再通过样品在各个因子空间的得分确定其归属类别，但PCA对样本与校正集间的准确位置缺乏定量的解释。

其缺点是当真药与劣药的含量相当接近时此法简单判错。

（3）马氏距离（Mahalanobis Distance MD）法：该方法的核心是通过多波长下的光谱距离定量描述出测量样本离校正集样本的位置，因而在光谱匹配、特别点检测和模型外推方面都很有用。

但应用该方法时，波长位置的选择特别重要，波长点过少，光谱得不到合理得描述；波长点过多，计算量大，为此，也有人提出将PCA与马氏距离相结合解决模型得适用性问题，可以充分利用PCA对大量光谱数据进行降维处理，也较好地解决了马氏距离计算时波长点的选择问题，避开了大量光谱数据直接进行马氏距离计算消失的共线性或计算量大等问题，且克服了采纳PCA自身进行推断界限不易量化的问题。

2．定量分析近红外光谱测量时一般不需对样品进行预处理，但测定的光谱可能受到各种干扰因素的影响。

利用单一波长下获得的光谱数据很难获得精确的定量分析结果。

NIR光谱结构简单，谱图重叠较多，所以在进行定量分析时，一般采纳多波长下获得的数据并进行肯定的数据处理才能获得精确牢靠的分析结果。

常用如下：（1）主成分回归（Principal Component，PCR）；原理与PCR在解释光谱数据时起着重要作用，从主成分权重中能够确定主成分与哪个组份有关，但准确而全面地解释每个主成分代表什么含义迄今仍是最难解决的问题。

（2）偏最小二乘法（Partial Least Square，PLS）：该法是一种全光谱分析方法，充分利用多个波长下的有用信息，无需刻意的选择波长，并能滤去原始数据噪音，提高信噪比，解决交互影响的非线性问题，很适合在NIR中使用。

试验证明，PLS法同近红外漫反射光谱法结合，直接分析许多固态药品如磺胺甲基异唑、安体舒通、安乃近、磺胺脒等是可行的。

（3）人工神经网络法（Artificial Neural Networks，ANN）：近年来兴起的ANN法讨论，依据样品各组分的光谱数据建立人工神经网络模型，猜测未知样品并争论影响网络的各参数。

采纳ANN法的最大优点是其抗干扰、抗噪音及强大的非线性转换力量，对于某些特别状况ANN会得到更小的校正误差和猜测误差，并且它的猜测结果要稍优于PLS（t检验无显著差异）。

这可能是由于ANN法具有更强的非线性处理力量所致。

此外还有多元线性回归（Multiple Linear Regression，MLR）、拓扑（Topology，TP）等方法也在近红外光谱分析中得到应用。

三、采样原理与技术近红外光谱分析的采样技术具有相当大的选择弹性，可依不同样品性质或环境而转变。

一般近红外光谱仪主要有三种采样方式（图1）。

其中以漫反射式较为常用。

如图2所示，当光束入射到粉末状的晶粒层时，一部分光会在各晶粒面产生镜面反射，另一部分会折射入表层晶粒内部，经部分汲取后射至内部晶粒界面，再发生反射，折射汲取，如此反复多次，最终由粉末表层朝各个方向辐射出来，此辐射光称为漫反射光。

四、应用范围近红外分光光度法具有快速、精确、对样品无破坏的检测特性，不仅可用于对"离线'供试品的检验，还能直接对"在线'样品进行检测，可广泛地应用于药品的理化分析。

（一）化学分析1．定性分析可对药品的活性成分、辅料、制剂、中间产物、化学原料以及包装材料进行鉴别。

2．定量分析可定量测定药品的活性成分和辅料；测定某些脂肪类化合物的化学值，如羟值、碘值和酸值等，水分的测定，羟基化程度测定以及溶剂量的掌握。

3．过程掌握（二）物理分析1．晶型和结晶性、多晶性、假多晶性和粒度测定。

2．溶出行为、崩解模式、硬度测定。

3．薄膜包衣性质检测。

4．制剂过程掌握，如对混合和制粒过程的监测。

五、溶剂除了2.7~3.0m区域外大多数溶剂都可以在近红外区使用，几种代表性溶剂的光谱区如图6.2所示，同时附有最佳使用光程。

由于分子间键合作用存在，近红外光谱带受溶剂影响很大，因此在进行未知物分析时，标准物与样品必需使用同一种溶剂。

六、仪器和仪器性能指标的掌握（一）仪器近红外分光光度计的记录波长范围为780~2500nm（按波数计算为12800~4000 cm-1）。

全部近红外光谱的测定分为透射和反射两种类型。

近红外分光光度计由光源、单色器（或干涉仪）、检测器、数据处理和评价系统等组成。

常用的单色器有声光可调型、光栅型和棱镜型。

高强度的光源石英壳钨灯，如石英卤素钨灯光源较为稳定。

检测器常用的材料有硅、硫化铅、砷化铟、铟镓、汞镉碲和氘代硫酸三甘肽。

常规的一般样品池、光纤探头，液体透射池、积分球是一些常用的采样装置。

需依据供试品的类型选择合适的检测器和采样系统。

（二）仪器性能指标的掌握1．波长使用在780~2500nm （按波数计算为12800~4000 cm-1）范围内具有特征汲取的合适的标准物质（例如含镝、钬、铒等稀土氧化物）进行波长的校验，在校验的波长范围内至少需检查三个波长。

对于傅立叶变换型的仪器，可以使用一个已被证明过的标准物质的狭窄谱线进行验证。

可接受的波长不确定度为：1200nm1nm(830 cm-18 cm-1),1600 nm1nm(6250 cm-14 cm-1), 2000 nm1.5nm(5000cm-14 cm-1)。

2．光线度性用一组透光率或反射率已知标准物质检查分光光度计的线性。

使用标准物质检查仪器相应值的稳定性。

3．仪器的辨别率近红外光谱仪的辨别率是指仪器对于紧密相邻的峰可以辨别的最小波长间隔，表示仪器实际分开相邻两的力量，它是最重要的仪器指标之一，也是仪器质量的综合反映。

仪器的辨别率主要取决于仪器分光系统的性能，对于色散型仪器而言，其辨别率取决于分光后狭缝截取的波段精度，狭缝越小截取的波段越窄，辨别率越高。

但随之而来的是能量急剧下降，灵敏度不断降低，为了兼顾检出灵敏度，就不能让狭缝无限制的缩小来提高辨别率，因此，要让色散型的仪器辨别率达到0.1 cm-1，又能得到一张质量良好的谱图是很困难的事。

而对于傅立叶型的近红外光谱仪，有多路通过的特点，无狭缝的限制，仪器的辨别率仅仅取决于干涉采样数据点的多少，即取决去动镜移动的距离，而动静的移动由激光掌握，因此可以很轻松的得到一张高质量，高辨别的谱图。

4．波长精确度波长的精确度是指仪器所显示的波长值和分光系统实际输出单色光的波长值之间相符的程度。

波长精确度可用波长误差，即上述两值之差来表示。

保证波长精确度是近红外光谱仪器能够精确测试样品的前提，是保证分析结果精确的前提。

近红外分析结果是通过用已知化学值的标准样品的建立的模型来分析待测样品，假如波长精确度不能保证，整组数据就会因波长的移动（即X轴发生了平移）而使每个数据产生偏差，造成分析结果的误差。

同时，模型传递也会受到影响。

波长精确度主要取决于光学系统的结构，此外还受到温度的影响。

傅立叶近红外光谱仪因内部装有波长校正系统，仪器的光学结构简洁，干涉仪只有一个动镜是运动部件，且运动速度又受到高稳定的氦－氖干涉系统的监视，加之在傅立叶仪器中使用了单色性能极好的氦－氖干涉系统作为采样标尺，因此测量的重复性和精确度都特别高。

而色散型仪器和滤光片型的仪器需要使用已知波长且性质稳定的标准物质常常进行校正，因此波长精确度较低。

5．波长精密度波长精密度又被称为波长重复性，是指对同一样品进行多次扫描，光谱峰位置间的差异程度或重复性，通常用多次测量某一谱峰所得波长的标准差来表示。

波长精密度是体现仪器稳定的一个重要指标，取决于光学系统的结构，与波长精确度一样，也会影响分析结果的精确性。

仪器的光学系统可动部件越少则仪器的波长精密度越高。

6．信噪比信噪比就是样品吸光度与仪器吸光度噪声的比值。

仪器吸光度噪声是指在肯定的测试条件下，在确定的波长范围内对样品进行多次测量，得到光谱吸光度的标准差，仪器的噪声只要取决于仪器光源的稳定性、电子系统的噪声、检测器产生的噪音以及环境产生的噪声，比如电子系统设计不良、仪器接地不良、外界电磁干扰等因素都会使仪器的噪声增大。