第六章 蛋白质工程在医药工业中的应用
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PCR技术; 免疫球蛋白Fab片段在大肠杆菌中的成功表达; 噬菌体表面展示文库技术。
初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA， 反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建 立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。
噬菌体抗体库技术
它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。 其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌 体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助 噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体 分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端 或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子 进行筛选。
第一节 医用抗体的蛋白质工程(续)
• II. 从抗血清到重组抗体 • III. 抗体工程 1). 鼠-人嵌合抗体 2).来自鼠抗体可变结构域骨架区可被人源化 3). 抗体的三维结构可在计算机上建模
1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)
人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。
3 小分子抗体
小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或 酶标抗体等。
单区抗体
噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简 单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及 免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一 增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际 应用上具有很大意义。
6 转人Ig基因小鼠
获取人Ig基因：构建人Ig的YAC文库及筛选 小鼠胚胎干细胞培养
小鼠内源性Ig基因的敲除 获得完整人Ig-YACs克隆 Ig-YACs克隆小ES细胞的导入 含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎 含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合
CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的 可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗 体，也就是人源化抗体。
经过CDR移植，抗体的免疫原性极低， 而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原 及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改 形抗体都已有报道，到现在已有数百种人 源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性 单抗中多数是改型抗体）
所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比, 除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中 的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应 细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是 肿瘤治疗的新突破。
5 抗体库技术
抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的 全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核 载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。
在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一 条单链，得到ScFv，即单链抗体。
连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长 或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特 点。常用的连接肽是(GGGGS)3。
单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全 人工合成法;
在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点 突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合 成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;
构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可 变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因 及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择 标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤 细胞、CHO细胞)中表达。
构建重组表达载体
克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分 离，也可用PCR技术分离。
人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会 带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产 生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效 应。
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
(3)单域抗体
即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构 域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所 降低，但仍保持着原单抗的特异性。
VH
(4)最小识别单位
约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR 构成，它也保持着抗体的特异性。
CDR
4 双特异抗体和多价抗体
双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于 1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下 Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的 活性。
(2)Fv 或 ScFv
Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
Fv
连接肽
ScFv
Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故 Fv不稳定。
噬菌体表面Leabharlann Baidu示系统(phage surface display system )
1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系 统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3 的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利 用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基 因的筛选工作带来了革命性的变革。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)
➢含527个氨基酸残基的丝氨酸蛋白 ➢内源性t-PA由血管内皮产生 ➢对血栓部位有一定的选择性
对循环血液中纤溶酶原作用弱．对与 纤维蛋白结合的纤溶酶原作用则强数 百倍
第三节 基于蛋白质结构的小分 子药物设计
• I. 用DOCK 发现先导化合物
• II. Haloperidol衍生物对HIV-1 PR的抑制
为加强特异性以减少出血并发症，并延长半 衰期，采用生物工程学方法研制开发高效而 特异的新纤溶药的工作正在进行。
链激酶(streptokinase，SK)
C组β溶血性链球菌产生分子量为47kDa的 蛋白质
能与纤溶酶原结合，形成SK-纤溶酶原复合 物，促使纤溶酶原转变成纤溶酶，溶解纤维 蛋白。
因人体内常有链球菌抗体，尤其是近期有 链球菌感染者含量更多，可中和链激酶，故 首次剂量宜大以中和抗体。
筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，
使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体 片段，经过纯化即可获得目的抗体。
该项技术的优点:
将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如 激素、酶、药物、随机多肽等的生产。
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降 低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种 抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。
2 鼠单抗可变区的人源化
尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时 它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗 体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和 顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为 Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。
噬菌体表面展示文库技术的要点: 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段
随机克隆入相应载体形成组合文库
将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或 g8 的先导系列的紧靠下游
外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、 方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗 体噬菌体库。
Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区 基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过 短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组 嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链 抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反 子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特 异性抗体。
纯合小鼠的产生和鉴定 纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体
第二节 组织纤维蛋白溶酶原激 活因子的蛋白质工程
• I. 有关重组t-PA • II. 产生t-PA突变体的基本原理 • III. t-PA蛋白质工程的几个方面 1). 减慢清除的t-PA变体 2). 血纤维特异性
第三节 纤维蛋白溶解药
(fibrinolytic drugs)
使纤溶酶原从Arg560-Val561之间断裂成纤溶 酶而促进纤溶，溶解血栓，也称溶栓药 (thrombo1ytic drugs)
治疗急性血栓栓塞性疾病
对形成已久并已机化的血栓难已发挥作用
目前应用的纤溶药主要缺点是对纤维蛋白 的作用无特异性，溶解血栓同时可诱发严重 出血。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型纤 溶酶原激活物(cu-PA)有一定程度的特异性， 但人体应用仍有出血并发症，半衰期又短。
人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。
全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的 CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链 分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的 粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火， 然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中， 进一步即可用于构建和表达改形抗体。
双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是 指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关 抗原。另1种为对应效应成分。
即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效 应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟 天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效 应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。
如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方 法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。
单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种 方式:
一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高， 可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性， 使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;
二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗 体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔 和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产 量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产 量仅在数毫克左右。
第六章 蛋白质工程在医药工业中的应用
第一节 医用抗体的蛋白质工程 第二节 组织纤维蛋白溶酶原激活因子
的蛋白质工程 第三节 基于蛋白质结构的小分子药物设计
第一节 医用抗体的蛋白质工程
• I. 抗体的产生和抗体的结构简介 1). 多肽组件的随机组合产生大量不同抗体 2). 抗原结合的特异性由超可变结构域决定 3). 恒定区的作用是稳定抗体分子 4). 稳定区介导效应器功能
静脉或冠脉内注射可使急性心肌梗死面积 减少，梗死血管重建血流。
对深静脉血栓、肺栓塞，眼底血管栓塞均有 疗效。
须早期用药．血栓形成不超过6h疗效最佳。
尿激酶(urokinase，UK)
由人肾细胞合成，无抗原性。 肝、肾灭活。 临床应用同SK，用于脑栓塞疗效明显。 因价格昂贵，仅用于SK过敏或耐药者。 不良反应为出血及发热，较SK少。 禁忌证同SK。
初期的抗体库技术是从淋巴细胞中提取总RNA， 反转录成cDNA或直接用总DNA为模板，用PCR技术建 立轻、重链文库，在大肠杆菌中表达后筛选。
噬菌体抗体库技术
它是在PCR技术和Phage Display的基础上实现的。 其过程是把用PCR法得到的抗体基因插入丝状噬菌 体的DNA，与噬菌体外壳蛋白的基因相连，在辅助 噬菌体的帮助下，噬菌粒包装成丝状噬菌体，抗体 分子通过与P Ⅲ或PⅧ相连，在噬菌体表面的一端 或分散分布，然后可直接对噬菌体表面的抗体分子 进行筛选。
第一节 医用抗体的蛋白质工程(续)
• II. 从抗血清到重组抗体 • III. 抗体工程 1). 鼠-人嵌合抗体 2).来自鼠抗体可变结构域骨架区可被人源化 3). 抗体的三维结构可在计算机上建模
1 人一鼠嵌合抗体(Chimeric Antibodies)
人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒 定区融合而得到的抗体。
3 小分子抗体
小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最 小识别单位等几种。
小分子抗体有很多优点:
可以用细菌发酵生产，成本低; 分子小，穿透力强; 不含Fc，没有Fc带来的效应; 在体内循环的半衰期短，易清除，利于解毒排出; 易于与毒素或酶基因连接，便于直接获得免疫毒素或 酶标抗体等。
单区抗体
噬菌体抗体库技术的发展具有很大优越性。它简 单易行，筛选容量大，效率高，绕过了细胞融合及 免疫等步骤，而且在表型一基因型的统一和识别一 增殖过程上模拟了B细胞的成熟过程，从而在实际 应用上具有很大意义。
6 转人Ig基因小鼠
获取人Ig基因：构建人Ig的YAC文库及筛选 小鼠胚胎干细胞培养
小鼠内源性Ig基因的敲除 获得完整人Ig-YACs克隆 Ig-YACs克隆小ES细胞的导入 含人Ig-YACs的ES细胞移入小鼠胚胎 含人Ig-YACs的ES细胞的小鼠胚胎向小鼠体内送还嵌合
CDR移植即把鼠抗体的CDR序列移植到人抗体的 可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗 体，也就是人源化抗体。
经过CDR移植，抗体的免疫原性极低， 而其抗原结合能力保持不变，结合半抗原 及全抗原(如细胞表面受体、病毒等)的改 形抗体都已有报道，到现在已有数百种人 源化抗体。（美国正式上市的11种治疗性 单抗中多数是改型抗体）
所以双特异性抗体与既往肿瘤免疫治疗相比, 除了能特异性识别肿瘤细胞外,还能将循环血液中 的免疫效应细胞再导向至肿瘤细胞处,从而使效应 细胞的抗肿瘤活性增强,发挥免疫导向作用,这是 肿瘤治疗的新突破。
5 抗体库技术
抗体库技术是用基因工程方法把人或其他动物的 全部抗体的轻、重链可变区基因克隆出来，在原核 载体上表达，然后筛选出所需的特异基因和抗体。
在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一 条单链，得到ScFv，即单链抗体。
连接肽的长度在10-15个氨基酸左右，不宜太长 或太短，它应具有柔软性，侧链少，抗原性弱等特 点。常用的连接肽是(GGGGS)3。
单链抗体的构建在已知亲本DNA序列时可用完全 人工合成法;
在具备亲本单抗可变区的cDNA克隆时，可用定点 突变法在其两端造成适当的内切酶位点，与人工合 成的连接肽编码序列连接，组装到表达载体中;
构建嵌合抗体的大致过程是，将鼠源单抗的可 变区基因克隆出来，连到包含有人抗体恒定区基因 及表达所需的其它元件(如启动子、增强子、选择 标记等)的表达载体上，在哺乳动物细胞(如骨髓瘤 细胞、CHO细胞)中表达。
构建重组表达载体
克隆鼠单抗的可变区基因，可从基因组文库中分 离，也可用PCR技术分离。
人抗体恒定区可根据需要选择，不同的恒定区会 带给嵌合抗体不同功能。为避免人抗体的恒定区产 生不需要的副作用，可通过点突变来修饰调整其效 应。
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
(3)单域抗体
即为VH，约为完整分子的1/12。它只由一个结构 域构成，故称单域抗体。单域抗体尽管亲和力有所 降低，但仍保持着原单抗的特异性。
VH
(4)最小识别单位
约为完整分子的1/80-1/70大小，一般由一个CDR 构成，它也保持着抗体的特异性。
CDR
4 双特异抗体和多价抗体
双链抗体 （Diabody）一词最早由Hollinger等于 1993年创造。乃是一种小分子的双价双特异性抗体片段。
Fab
最小识别单位
Fv
ScFv
(1)Fab
由完整的轻链和Fd组成，大小为完整分子的1/3。 把Fab与细菌的前导肽相连，在前导肽的作用下 Fab进入质周腔，装配折叠后，它具有结合抗原的 活性。
(2)Fv 或 ScFv
Fv、ScFv的大小约为全分子的1/6。
Fv
连接肽
ScFv
Fv由VH与VL构成，由于其结合是非共价结合，故 Fv不稳定。
噬菌体表面Leabharlann Baidu示系统(phage surface display system )
1990年Mc Cafferty等成功地建立了噬菌体表面展示系 统，通过将抗溶菌酶单链抗体基因克隆于fd噬菌体基因3 的下游，使ScFv以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，利 用亲和层析，两轮富集达106倍。该技术的成功给抗体基 因的筛选工作带来了革命性的变革。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)
➢含527个氨基酸残基的丝氨酸蛋白 ➢内源性t-PA由血管内皮产生 ➢对血栓部位有一定的选择性
对循环血液中纤溶酶原作用弱．对与 纤维蛋白结合的纤溶酶原作用则强数 百倍
第三节 基于蛋白质结构的小分 子药物设计
• I. 用DOCK 发现先导化合物
• II. Haloperidol衍生物对HIV-1 PR的抑制
为加强特异性以减少出血并发症，并延长半 衰期，采用生物工程学方法研制开发高效而 特异的新纤溶药的工作正在进行。
链激酶(streptokinase，SK)
C组β溶血性链球菌产生分子量为47kDa的 蛋白质
能与纤溶酶原结合，形成SK-纤溶酶原复合 物，促使纤溶酶原转变成纤溶酶，溶解纤维 蛋白。
因人体内常有链球菌抗体，尤其是近期有 链球菌感染者含量更多，可中和链激酶，故 首次剂量宜大以中和抗体。
筛选到的噬菌体再将基因g3或g8切除后，转入大肠杆菌，
使翻译出的抗体分泌到细菌的质周腔内，形成游离的抗体 片段，经过纯化即可获得目的抗体。
该项技术的优点:
将抗体的基因型和表型紧密联系起来; 可绕过杂交瘤技术，不需要复杂的基因工程技术; 抗体基因筛选的范围广; 技术稳定、可靠、生产周期短;可规模化生产; 适用范围广，既可用于抗体制备，也适用于其它蛋白如 激素、酶、药物、随机多肽等的生产。
定点突变法是将人的可变区基因克隆，根据鼠抗 体的CDR 序列合成几种突变引物，用定点突变的方 法将人的可变区基因的CDR序列变为鼠抗体的CDR序 列，然后表达出改型抗体。
研究表明，在构建改形抗体时，简单地进行CDR 替换并不能保证抗体具有好的亲和力，因此在构建 时还必需包括对影响抗原结合位点的空间结构的框 架序列进行操作。
人一鼠嵌合抗体与鼠单抗相比，免疫原性大大降 低，利于在人体内应用，所以目前已制备出上百种 抗各种抗原(包括肿瘤相关抗原)的嵌合抗体。
2 鼠单抗可变区的人源化
尽管嵌合抗体的免疫原性已降低很多，但有时 它仍可能引发较强的免疫反应。为了进一步降低抗 体的鼠源成分，发展出CDR移植技术。 CDR即互补决定区。Ig超变区氨基酸残基的种类和 顺序特别多变，这些部位与识别抗原直接相关，为 Ig分子的抗原结合部位，故称为互补决定区。
噬菌体表面展示文库技术的要点: 从免疫或未被免疫的B细胞中PCR扩增抗体全套基因片段
随机克隆入相应载体形成组合文库
将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因 g3或 g8 的先导系列的紧靠下游
外源基因表达多肽以融合蛋白形式展示在外壳蛋白N端
用固相化抗原经“亲和结合一洗脱一扩增”数个循环直接、 方便、简捷、高效地筛选出表达特异性好、亲和力强的抗 体噬菌体库。
Hollinger等巧妙地将Ａ抗原抗体的轻链可变区 基因(VLA)与抗Ｂ抗原抗体的重链可变区(VHB)通过 短肽连接子连接;同样地,将VHA与VLB连接,将两组 嵌合基因置于双顺反子的表达质粒中,构建成双链 抗体的表达质粒,目前报道的表达质粒均为双顺反 子。表达后,VLA VHB与VHA VLB交叉连结,形成双特 异性抗体。
纯合小鼠的产生和鉴定 纯合小鼠制备特异性完全人源化抗体
第二节 组织纤维蛋白溶酶原激 活因子的蛋白质工程
• I. 有关重组t-PA • II. 产生t-PA突变体的基本原理 • III. t-PA蛋白质工程的几个方面 1). 减慢清除的t-PA变体 2). 血纤维特异性
第三节 纤维蛋白溶解药
(fibrinolytic drugs)
使纤溶酶原从Arg560-Val561之间断裂成纤溶 酶而促进纤溶，溶解血栓，也称溶栓药 (thrombo1ytic drugs)
治疗急性血栓栓塞性疾病
对形成已久并已机化的血栓难已发挥作用
目前应用的纤溶药主要缺点是对纤维蛋白 的作用无特异性，溶解血栓同时可诱发严重 出血。
组织型纤溶酶原激活物(t-PA)、尿激酶型纤 溶酶原激活物(cu-PA)有一定程度的特异性， 但人体应用仍有出血并发症，半衰期又短。
人源化抗体的构建可用全合成法或定点突变法。
全合成法是以人抗体序列为骨架，以鼠抗体的 CDR置换人抗体的CDR，将整个可变区序列的两条链 分解成若干片段，并使相邻的片段具有彼此互补的 粘性末端。合成所有DNA片段，每组片段分别退火， 然后逐组连接成完整的可变区基因，插入质粒中， 进一步即可用于构建和表达改形抗体。
双特异性抗体(bispecific antibody,BSAb)是 指能同时识别2种抗原的抗体。1种为对应肿瘤相关 抗原。另1种为对应效应成分。
即能结合靶肿瘤细胞又能结合高细胞毒性的效 应细胞,将效应细胞富集在肿瘤周围,而且可以模拟 天然配体的作用,与细胞表面引发分子结合,激活效 应细胞,实现对肿瘤细胞的杀伤和裂解。
如果从杂交瘤细胞系构建单链抗体，可用PCR方 法扩增可变区基因，再组装到适当的表达载体上。
单链抗体最常用的表达体系是大肠杆菌，有2种 方式:
一是表达为包涵或非包涵体的不溶蛋白。产量高， 可达细菌蛋白总量的5%-20%，但需进行变性复性， 使其形成正确的立体结构，恢复抗体活性;
二是分泌型表达，将细菌的信号肽序列与单链抗 体的氨基端相连，单链抗体分子就可分泌到质周腔 和细菌体外，进行折叠后成为有活性的分子。但产 量不及前者，一般实验室培养条件下每升细菌的产 量仅在数毫克左右。
第六章 蛋白质工程在医药工业中的应用
第一节 医用抗体的蛋白质工程 第二节 组织纤维蛋白溶酶原激活因子
的蛋白质工程 第三节 基于蛋白质结构的小分子药物设计
第一节 医用抗体的蛋白质工程
• I. 抗体的产生和抗体的结构简介 1). 多肽组件的随机组合产生大量不同抗体 2). 抗原结合的特异性由超可变结构域决定 3). 恒定区的作用是稳定抗体分子 4). 稳定区介导效应器功能
静脉或冠脉内注射可使急性心肌梗死面积 减少，梗死血管重建血流。
对深静脉血栓、肺栓塞，眼底血管栓塞均有 疗效。
须早期用药．血栓形成不超过6h疗效最佳。
尿激酶(urokinase，UK)
由人肾细胞合成，无抗原性。 肝、肾灭活。 临床应用同SK，用于脑栓塞疗效明显。 因价格昂贵，仅用于SK过敏或耐药者。 不良反应为出血及发热，较SK少。 禁忌证同SK。